En injection intraventriculaire Utero et l'électroporation d'embryons de souris E15

Bonjour, je m’appelle William Tis et je travaille au Krete Lab. Aujourd’hui, moi-même et d’autres allons vous montrer des injections intra-utérines d’embryons de souris E 15. Bonjour, je m’appelle Laura Elias.

Aujourd’hui, je vais vous montrer comment préparer les pipettes de micro-injection et charger les pipettes pour les injections intraventriculaires et l’électroporation que nous allons faire. Je m’appelle David Castaneda et aujourd’hui, je vais aider à des injections in vivo in utero d’embryons de souris. Nous injecterons de l’ADN plasmidique dans le ventricule latéral d’embryons de souris en développement.

Nous ciblons le cortex CE de ces embryons afin d’obtenir l’expression de différentes molécules par les cellules gliales et qui deviendront des neurones plus tard dans le développement. Lorsque vous faites ces injections intra-utérines, il y a quelques outils importants que vous devrez utiliser et je vais vous les montrer. Maintenant. Nous utilisons un freerizer, quelques pinces supplémentaires.

L’une, une paire dentelée, et une autre paire qui a une petite dent à l’extrémité. Nous utilisons une paire d’hémostats. Il s’agit d’une paire de ciseaux.

Ensuite, nous utilisons ces deux agrafeuses. Ce sont les plus gros que nous utilisons pour les rats. C’est le plus petit que nous utilisons pour les souris.

Utilise une agrafe de taille sept, et celle-ci utilise une agrafe de taille neuf et elles sont juste à ressort. Certaines des choses que nous utilisons ici pour aider aux chirurgies, nous utilisons simplement une simple source de lumière à fibre optique avec une double tête dessus. Nous utilisons un coussin chauffant qui fait circuler de l’eau chaude et chauffée là-bas pour la garder au chaud.

Pour la surface de travail, nous utilisons ce système d’électroporation réalisé par BTX. Nous avons deux tailles différentes de palettes que nous utilisons en fonction de la taille et de la taille des embryons. Le côté bleu est le côté positif.

D’accord, donc pour les souris, nous utilisons un vaporisateur iso-fluoré. Nous avons constaté qu’il augmente notre taux de survie de la mère et des embryons. Cela nous permet également d’amener l’animal dans et hors de la conscience très rapidement et de manière très contrôlée.

C’est pourquoi nous l’avons trouvé très utile. Très bien, maintenant nous allons biseauter nos pipettes d’injection. Et c’est très important pour que votre pipette ait une ouverture suffisamment grande pour que vous puissiez charger votre ADN, mais aussi qu’elle soit très, très tranchante pour ne pas endommager l’embryon lorsque vous injectez.

Et si vous endommagez l’embryon lorsque vous l’injectez, vous allez avoir un taux de mortalité beaucoup plus élevé. Et donc c’est, ce n’est pas bon. Il s’agit donc en fait d’un processus très important, comme dans cette chirurgie.

Et d’abord, nous allons simplement mettre de l’eau sur cette pierre biseautée qui tourne ici. Et puis nous allons prendre, voyons voir ici, juste un, un, un bâton. Et nous allons placer notre pipette que nous venons de tirer sur ce bâton avec du ruban adhésif.

Et nous allons utiliser l’un de ces micromanipulateurs pour maintenir la pipette sur le biseau et lui permettre de biseauter ici. Donc, il suffit de le placer et nous utilisons un microscope afin de visualiser la pointe de la pipette. Et nous allons simplement le placer dans l’eau au-dessus du biseau afin qu’il y ait un peu de pression.

Et vous pouvez voir la pointe appuyer contre la, la pierre ici. Et laissez-le biseauter pendant un certain temps pendant au moins, vous savez, 15 minutes. J’aime les laisser même pour, vous savez, une heure.

Parfois, ils sont juste, ils deviennent vraiment, vraiment tranchants, mais cela dépend certainement de la durée de biseautage de leurs pipettes. D’accord, donc nous y sommes, vous pouvez voir sur le dessus que nous avons une pipette qui a été tirée et qui n’a pas encore été biseautée. Ainsi, bien qu’il soit tranchant, il n’a pas d’ouverture par laquelle vous pourriez charger votre ADN.

Maintenant, la pipette inférieure a été biseautée et vous pouvez voir cette belle ouverture inclinée qui vous permettra de charger votre ADN, mais elle a toujours une pointe pointue pour que vous puissiez injecter sans créer de dommages. Très bien, nous allons maintenant remplir nos pipettes d’injection d’ADN. Il est donc important que vous prépariez votre ADN de manière à ce qu’il ne vous agisse pas d’endotoxines afin de ne pas injecter de lipopolysaccharides lorsque vous injectez votre ADN.

Nous allons donc prendre notre ADN et en fait, ici, préparer notre paraforme. Vous allez donc simplement créer votre paraforme ici et vous allez vouloir collecter votre ADN et le placer simplement comme un petit point sur ce film para. Et puis nous allons prendre, donc je prends généralement pour chaque 10 microlitres de mon ADN, que j’utilise généralement à environ 1,5 à 1,7 microgramme d’un microlitre.

J’utiliserai environ un microlitre de ce colorant vert rapide. Et c’est juste pour nous aider à localiser notre injection et à nous assurer que nous avons réussi à injecter dans le ventricule. Alors je vais juste mélanger ce colorant vert rapide avec mon ADN.

Ensuite, vous prenez votre électrode d’injection et nous remplissons simplement la pipette en tirant sur le piston. Et vous pouvez voir ici si, si la pipette est biseautée correctement et a une grande ouverture suffisante, le DNI devrait se charger assez facilement. Parfois, il suffit de déplacer le piston d’avant en arrière pour l’aider à se charger correctement.

Et vous pouvez donc charger la pipette comme ceci. Et donc nous avons l’ADN chargé entièrement dans cette pipette et il est prêt pour l’injection. D’accord, je vais maintenant laver l’animal avec de l’alcool et de l’iode, mais d’abord, bien sûr, je veux faire un pincement des orteils pour m’assurer que l’animal est complètement en dessous et qu’il a l’air bien.

Je peux donc aller de l’avant et commencer. Et je commence avec, tout comme chez les rats, nous faisons une série de trois d’entre eux à partir de l’éthanol. D’accord, de l’iode.

Pour minimiser le risque d’infection, veuillez noter que lorsque William a ouvert les lingettes, il nettoie l’animal avec la partie qui n’a pas été touchée par ses doigts. Pour que la zone soit propre, afin de maximiser sa propreté. Deuxièmement, il ne fait qu’une seule lingette pour éviter de répandre les germes sur la surface abdominale.

D’accord, super. Maintenant, je vais nettoyer un peu et nous allons mettre des gants chirurgicaux. Alors maintenant, je vais ouvrir la souris et retirer les cornes utérines et je vais commencer par une petite pincée de peau.

Permettez-moi de faire un autre pincement d’orteil ici juste pour être sûr qu’elle est complètement en dessous et c’est bien. Je vais donc pincer la peau et y faire juste une petite ondulation qui se dressera, ce qui me permettra de couper plus facilement. Et encore une fois, nous voulons faire l’incision le long de la ligne médiane de l’animal pour éviter tout vaisseau sanguin.

D’habitude, je coupe la peau comme ça et je la sépare et expose le muscle. Et une fois que vous avez fait cela, vous pouvez facilement voir la ligne médiane dans le muscle. C’est très défini.

Je vais attraper un peu de muscle là-bas couper Et c’est une incision de bonne taille. Je ne voudrais pas vraiment aller plus loin que ça. Et puis j’utilise ce libérateur juste pour soulever le muscle et la peau, le tirer sur le côté, puis je fais une sonde très douce ici et j’essaie de positionner le libérateur entre les deux embryons, entre deux embryons afin que je puisse les tirer doucement sans les endommager du tout.

Parfois, c’est plus facile que d’autres. Et voilà. Il suffit donc de le tirer doucement et une fois que je l’ai fait, je peux en quelque sorte les pousser vers l’extérieur.

Il est important de ne jamais pincer les embryons, mais vous voulez juste les guider, juste les pousser. Et une fois que vous les avez sortis, je veux être sûr de les garder toujours très humides. Vous ne voulez pas les laisser se dessécher.

Et voyons, j’utilise à nouveau mon freer ici, sonder autour. Et voilà. C’est super.

Et donc je veux toujours m’assurer que je les ai tous sortis parce qu’il est facile d’en laisser un là-bas si vous ne vérifiez pas les ovaires. Alors je les retire toujours très doucement, mais en cherchant et en regardant pour voir les ovaires à la fin, qui est juste là. Et cela ressemble à une petite masse de tissu rouge chez cet animal.

Et puis je les retourne, je reviens et je vérifie de l’autre côté et je peux les voir là-bas. Alors assurez-vous simplement de les garder hydratés et nous sommes prêts à partir. Quelque chose que je veux souligner, c’est que vous ne le faites pas, vous devriez saisir les embryons très doucement et ne saisir que les embryons.

Ne vous accrochez pas à l’endroit où se trouvent les vaisseaux sanguins car ils deviennent, ils peuvent être endommagés très facilement et ils l’auront, l’animal aura une hémorragie et le taux de survie diminuera considérablement. La première chose que nous voulons déterminer, c’est où se trouve la tête dans l’embryon à qui nous voulons injecter l’ADN. Pour ce faire, nous faisons pivoter doucement l’animal et en regardant le ventral, chaque partie ventrale.

Donc, dans cet exemple particulier, nous avons la tête est sur ma droite et la queue est près de ma gauche. La ligne médiane est dans cette position et William va procéder au positionnement de l’embryon de manière appropriée pour que je puisse l’injecter comme chez les rats. Je les positionne toujours avec la tête vers le bas, le côté droit de la mère tourné vers moi.

Et donc je vais commencer maintenant. D’accord, vous pouvez donc voir le poteau du sol gauche là-bas, bougez juste un peu et vous pouvez certainement voir la ligne médiane juste là. Je vais essayer de le faire tourner un peu pour qu’il soit en bonne position pour David.

D’accord, et maintenant je vais procéder à l’injection du ventricule gauche. Nous pouvons voir ici que le ventricule gauche est totalement, complètement rempli d’ADN. Nous pouvons voir qu’une partie de la matrice s’est propagée au ventricule droit et aussi aux troisième et quatrième ventricules ici.

C’est un bon indicateur d’une bonne injection. Nous allons maintenant procéder à l’électro de l’ADN dans les cellules. La considération importante ici est de savoir quelle électrode est le côté positif.

Nous savons que celui avec la poignée bleue ici est l’électrode positive et que ce côté doit aller dans le côté dans lequel nous voulons électroporer l’ADN. Donc, puisque nous avons le, nous avons injecté dans le ventricule gauche la majeure partie de l’ADN positionnera l’électrode positive sur le côté gauche comme ceci, puis nous appliquerons cinq impulsions et c’est tout. Il est important d’avoir les électrodes complètement mouillées dans du PBS afin que le contact entre les électrodes et l’utérus soit bon et que la transmission des impulsions électriques soit appropriée.

D’accord, maintenant que l’exploration est terminée, je vais aller de l’avant et remettre les cornes à l’intérieur. Et la façon dont je vais le faire, c’est que je vais très doucement déplacer les cornes d’un côté, descendre ici et attraper le muscle et la peau et en quelque sorte doucement, doucement plus facilement là-bas. D’accord, sympa.

Faites attention à la vessie. Je peux faire l’autre côté. Et puis ce que nous faisons, c’est lui donner un petit coup de pouce pour les installer en quelque sorte là-dedans.

Peut utiliser un peu le plus libre pour les aplatir doucement. Et puis ce que je vais faire, c’est rincer avec trois mils d’antibiotique antimycosique. Faisons un pincement des orteils pour nous assurer qu’elle est complètement sortie avant de commencer à suturer.

Et ça a l’air bien. Je vais utiliser Henry Shine. Numéro six, la suture chirurgicale.

Je préfère faire des points de bloc. Je pense qu’ils tiennent mieux. Et nous allons commencer simplement en insérant l’aiguille là-bas, en la tirant, en l’enroulant trois fois, en saisissant l’extrémité, en la tirant à travers.

1, 2, 3, coupez l’excédent. Vous devez donc continuer à descendre uniformément dans l’espace et serrer la ligne. Et vous voulez aller juste au-delà de l’endroit où l’incision s’arrête et attacher à nouveau.

Et je m’en rapproche maintenant. Tirez un peu le tissu vers l’arrière ou la peau. Il y a un peu de saignement là-bas.

Ça devrait aller. Nous gardons un cautériseur au cas où nous aurions des saignements, ce qui arrive de temps en temps. Et son cautériseur fonctionne bien pour arrêter cela.

Donc, d’accord, je suis au-delà de l’incision. Je m’arrête là. Tirez à travers, faites une boucle, tournez trois fois, attrapez la boucle et tirez-la vers le bas.

Tournez trois fois, saisissez la boucle, tirez-la à travers et éteignez l’excédent. Mettez l’aiguille dans les objets tranchants. Ensuite, nous allons utiliser une agrafeuse.

Nous allons utiliser des agrafes de taille sept sur cet animal. Nous en utilisons sept pour les souris. Neuf pour les rats.

Il suffit de saisir la peau, de la tirer un peu vers le haut et de commencer à la couper. Récupérez le clip. Nous voulons aller uniformément espacés jusqu’à un peu au-delà de l’incision et c’est bien.

Poursuivez avec une lingette imbibée d’alcool sur toute la zone. Ensuite, nous allons lui faire une injection de buprénorphine juste pour nous assurer qu’elle ressent de la douleur. Et nous continuerons à la surveiller au cours des deux prochains jours pour nous assurer qu’elle reste en bonne santé et qu’elle ne souffre pas.

D’accord, maintenant que nous lui avons donné une injection de buprénorphine, nous allons la remettre dans sa cage d’origine pour qu’elle se sente à l’aise lorsqu’elle se réveille, la mettre dans l’incubateur et lui permettre d’y rester pendant environ 20 minutes jusqu’à ce qu’elle soit complètement réveillée et séchée. Nous vous avons montré comment réaliser in vivo in utero, électroporation de plasma, d’ADN. On peut injecter n’importe quelle molécule.

Il peut s’agir d’un plaid D ou de drogues. Les facteurs de croissance meurent. Si vous avez besoin que ces molécules soient délivrées dans les cellules et qu’elles ne passent pas par diffusion passive, vous aurez besoin d’électroporation et pour cela, les molécules devront être chargées.

Mais en gros, les possibilités sont illimitées. Un exemple d’un vecteur alternatif pour délivrer des gènes dans la cellule. Nos virus.

Et dans le passé, nous avons utilisé des rétrovirus pour marquer les gls avec de l’ADN et montrer comment ils se divisent et deviennent des neurones, migrant finalement vers le cortex après avoir marqué les cellules avec un virus ou utilisé l’électroporation, ou vous avez injecté des médicaments ou toute autre molécule pour affecter le développement du cerveau. Vous pouvez étudier cela par plusieurs techniques. L’une d’entre elles est de faire du TimeLapse dans lequel vous ferez des cultures de tranches organotypiques.

Ensuite, vous suivrez le devenir des cellules à l’aide d’un microscope. Comme vous pouvez le voir ici, temps 0,0. Nous commençons avec un groupe de cellules très proches du ventricule latéral.

Et au fil du temps, nous pouvons voir que les cellules commencent à migrer hors de la zone ventriculaire et vers la plaque corticale. De plus, on fixe les embryons et on fait de l’immunohistochimie pour étudier, vous savez, différentes distributions de différentes molécules, ou pour déterminer le devenir de ces différentes cellules. Une autre possibilité est de faire de l’électrophysiologie.

Nous identifions les cellules de marquage puis nous étudions leurs propriétés électriques. Eh bien, merci d’être avec nous aujourd’hui. Nous espérons que vous apprécierez nos démonstrations et que vous réussirez à réaliser vos expériences.

Si vous avez des questions, n’hésitez pas à nous contacter. Vous savez, bonne chance.