En injection intraventriculaire Utero et l'électroporation d'embryons de souris E15

Bonjour, je suis William Tis du laboratoire Krete. Aujourd'hui, moi et d'autres chercheurs allons vous montrer des injections intra-utérines d'embryons de souris E 15. Bonjour, je m'appelle Laura Elias.

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment préparer les pipettes de microinjection et les charger pour les injections intraventriculaires et l'électroporation que nous allons réaliser. Je m'appelle David Castaneda et aujourd'hui, je vais assister à des injections in vivo in utero d'embryons de souris. Nous allons injecter de l'ADN plasmidique dans le ventricule latéral d'embryons de souris en développement.

Nous ciblons le cortex CE de ces embryons afin d'obtenir une expression de différentes molécules par les cellules gliales, qui deviendront plus tard des neurones au cours du développement. Lors de ces injections intra-utérines, il existe quelques outils importants que vous devrez utiliser, et je vais vous les montrer maintenant. Nous utilisons un freer, ainsi qu'une paire de forceps addin.

Un, une paire dentelée et une autre paire présentant une petite dent à l'extrémité. Nous utilisons une paire de pinces hémostatiques. Ceci est une paire de ciseaux.

Ensuite, nous utilisons ces deux agrafeuses. Celle-ci est la plus grande, que nous utilisons pour les rats. Celle-ci est la plus petite, que nous utilisons pour les souris.

Utilise une agrafe de taille sept, et ceci utilise une agrafe de taille neuf, toutes deux étant simplement à ressort. Parmi les éléments que nous utilisons ici pour faciliter les interventions chirurgicales, on trouve une simple source lumineuse à fibres optiques équipée d'une double tête. Nous utilisons également un tapis chauffant qui fait circuler de l'eau chaude à l'intérieur afin de maintenir la température.

La surface de travail, nous utilisons ce système d'électroporation fabriqué par BTX. Nous disposons de plusieurs tailles différentes de palettes que nous utilisons en fonction de la taille des embryons. Le côté bleu est le côté positif.

D'accord, donc pour les souris, nous utilisons un vaporisateur d'isoflurane. Nous avons constaté qu'il augmente notre taux de survie des mères et des embryons. Il nous permet également de faire passer l'animal de l'inconscience à la conscience très rapidement et de manière très contrôlée.

Pour cette raison, nous l'avons trouvé très utile. Très bien, nous allons maintenant aiguiser nos pipettes d'injection. C'est très important afin que l'ouverture de votre pipette soit suffisamment grande pour permettre le chargement de votre ADN, mais aussi afin qu'elle soit très, très fine, de manière à ne pas endommager l'embryon lors de l'injection.

Et si vous endommagez l'embryon lors de l'injection, vous aurez un taux de mortalité beaucoup plus élevé. Ce qui n'est pas souhaitable. Ce processus est donc en réalité une étape très importante de cette intervention chirurgicale.

Et tout d'abord, nous allons simplement ajouter un peu d'eau sur cette pierre de meulage qui tourne ici. Ensuite, nous allons prendre, voyons ici, juste un bâtonnet. Et nous allons fixer notre pipette, que nous venons de tirer, sur ce bâtonnet à l’aide de ruban adhésif.

Et nous allons utiliser l'un de ces micromanipulateurs pour maintenir la pipette sur le tranchant et permettre l'affûtage ici. Ainsi, placez simplement ceci et nous utilisons un microscope afin de visualiser l'extrémité de la pipette. Nous allons simplement la placer juste dans l'eau au-dessus du tranchant de manière à exercer une légère pression.

Et vous pouvez voir la pointe appuyer contre la pierre ici. Laissez-la affûter pendant un certain temps, au moins, disons, 15 minutes. J'aime les laisser même, disons, une heure.

Parfois, elles deviennent simplement très, très pointues, mais la durée du biseautage des pipettes dépend certainement de chaque personne. Très bien, ici nous avons, vous pouvez voir en haut une pipette qui a été étirée mais n’a pas encore été biseautée. Bien qu’elle soit pointue, elle ne possède aucune ouverture permettant de charger votre ADN.

Maintenant, la pipette inférieure a été biseautée et vous pouvez voir cette belle ouverture angulaire, ce qui vous permettra de charger votre ADN, tout en conservant une pointe suffisamment fine pour réaliser l'injection sans causer de dommages. Très bien, nous allons maintenant remplir nos pipettes d'injection avec de l'ADN. Il est important que vous prépariez votre ADN de manière exempte d'endotoxines afin de ne pas injecter de lipopolysaccharides lors de l'administration de votre ADN.

Nous allons donc prendre notre ADN et, à ce moment précis, préparer notre parafilm. Vous allez simplement confectionner votre morceau de parafilm ici, puis récupérer votre ADN et le déposer sous forme d’un petit point sur ce film de parafine. Ensuite, nous allons prendre, moi j’utilise habituellement, pour chaque 10 microlitres de mon ADN, une quantité d’environ 1,5 à 1,7 microgrammes par microlitre.

J'utiliserai environ un microlitre de ce colorant vert rapide. Cela nous aide simplement à localiser notre injection et à nous assurer que nous avons correctement injecté dans le ventricule. Ensuite, je mélangerai simplement ce colorant vert rapide avec mon ADN.

Ensuite, prenez votre électrode d'injection et nous allons remplir la pipette en tirant sur le piston. Vous pouvez voir ici que si la pipette est correctement biseautée et possède une ouverture suffisamment large, le DNI devrait s'aspirer assez facilement. Parfois, il est nécessaire de déplacer le piston vers l'avant et vers l'arrière pour faciliter un chargement correct.

Ensuite, vous pouvez charger la pipette comme ceci. Nous avons donc chargé complètement l'ADN dans cette pipette et elle est prête pour l'injection. Très bien, je vais maintenant désinfecter l'animal avec de l'alcool et de l'iode, mais tout d'abord, je veux effectuer une pression sur l'orteil afin de m'assurer que l'animal est complètement anesthésié, et cela semble correct.

Je peux donc commencer. Et je commence, comme chez les rats, par une série de trois, en commençant par l'éthanol. Bon, l'iode.

Pour minimiser le risque d'infection, veuillez noter que lorsque William ouvre les lingettes, il nettoie l'animal avec la partie qui n'a pas été touchée par ses doigts, afin de maximiser la propreté de la zone. Deuxièmement, il n'effectue qu'une seule passe pour éviter de répartir les germes sur la surface abdominale.

Très bien. Maintenant, je vais nettoyer un peu et enfiler des gants chirurgicaux. Très bien. Très bien. Très bien. Maintenant, je vais ouvrir la souris et retirer les cornes utérines, en commençant par une petite pince de peau.

Permettez-moi de refaire une pincée sur l'orteil ici, juste pour être sûr qu'elle est complètement anesthésiée, et c'est bon. Je pince donc la peau pour créer un petit froncement qui ressort, ce qui facilite la coupe. Encore une fois, nous voulons faire l'incision exactement le long de la ligne médiane de l'animal afin d'éviter les vaisseaux sanguins.

Je coupe généralement la peau ainsi et je la sépare pour exposer le muscle. Une fois cela fait, vous pouvez facilement voir la ligne médiane dans le muscle. Elle est très bien définie.

Je vais prélever un peu de muscle ici, faire une incision. C'est une taille d'incision appropriée. Je ne voudrais pas vraiment la rendre plus grande que cela. Ensuite, j'utilise cet écarteur pour soulever le muscle et la peau, les tirer sur le côté, puis j'effectue une exploration très douce ici et tente de positionner l'écarteur entre les deux embryons, entre deux embryons, afin de pouvoir simplement les extraire délicatement sans les endommager du tout.

Parfois, c'est plus facile que d'autres fois. Voilà. Il suffit donc de tirer doucement pour le faire passer, et une fois que je l'aurai fait passer, je pourrai simplement les pousser légèrement pour les sortir.

Il est important de ne jamais pincer les embryons, mais simplement de les guider, de les pousser légèrement. Et une fois que vous les avez extraits, veillez à les maintenir toujours très humides. Vous ne devez pas les laisser dessécher.

Et voyons, j'utilise à nouveau mon fraise, je sonde autour. Voilà. C'est parfait.

Et donc, je veux toujours m'assurer de les avoir toutes sorties, car il est facile d'en laisser une à l'intérieur si l'on ne vérifie pas la présence des ovaires. Je les extrais donc toujours très délicatement, tout en cherchant à repérer les ovaires à l'extrémité, qui se trouvent juste là. Ils ressemblent simplement à une petite masse de tissu rouge chez cet animal.

Ensuite, retournez-les, revenez et vérifiez l'autre côté ; je peux les voir là. Assurez-vous donc de les maintenir hydratés et nous sommes prêts à commencer. Je tiens à souligner un point : vous ne devez pas, vous devez saisir les embryons très délicatement et uniquement saisir les embryons.

Ne saisissez pas là où se trouvent les vaisseaux sanguins, car ils peuvent s'endommager très facilement, ce qui entraînerait une hémorragie chez l'animal et ferait chuter considérablement le taux de survie. La première chose que nous devons donc déterminer est la position de la tête dans l'embryon que nous voulons injecter avec l'ADN. Nous procédons en faisant tourner doucement l'animal et en examinant chaque partie ventrale.

Dans cet exemple particulier, la tête se trouve à ma droite et la queue est proche de ma gauche. La ligne médiane est dans cette position, et William va maintenant positionner l'embryon de manière appropriée afin que je puisse l'injecter, tout comme chez les rats. Je les positionne toujours avec la tête du côté droit de la mère, tourné vers moi.

Et donc, je vais commencer cela maintenant. Bon, vous pouvez voir le pôle gauche du plancher ici, déplacez-vous un peu et vous pouvez clairement voir la ligne médiane juste là. Je vais essayer de le faire pivoter légèrement pour qu’il soit bien positionné pour David.

D'accord, et maintenant je vais procéder à l'injection du ventricule gauche. On peut voir ici que le ventricule gauche est totalement, complètement rempli d'ADN. On observe que certaines traces de colorant se sont répandues vers le ventricule droit ainsi que vers les troisième et quatrième ventricules ici.

Cela constitue un bon indicateur d'une bonne injection. Nous allons donc maintenant électroporater l'ADN dans les cellules. La considération importante ici est de savoir quel électrode correspond au pôle positif.

Nous savons que celui avec la poignée bleue ici est l'électrode positive et que ce côté doit être placé du côté que nous souhaitons électroporer, c'est-à-dire où introduire l'ADN. Puisque nous avons injecté le ventricule gauche avec la majeure partie de l'ADN, je positionnerai l'électrode positive du côté gauche comme ceci, puis nous appliquerons cinq impulsions et ce sera terminé. Il est important que les électrodes soient complètement mouillées dans du PBS afin que le contact entre les électrodes et l'utérus soit bon et que la transmission des impulsions électriques soit appropriée.

Très bien, maintenant que l'exploration est terminée, je vais remettre les cornes à l'intérieur. Pour ce faire, je déplacerai très doucement les cornes sur le côté, puis je descendrai ici pour attraper le muscle et la peau, et les replacerai délicatement, tout en douceur, à l'intérieur. Parfait, bien.

Attention à la vessie. Je peux faire l'autre côté. Ensuite, nous secouons légèrement la patiente pour aider à les positionner correctement à l'intérieur.

On peut utiliser le frein un peu pour les aplatir délicatement. Ensuite, je vais rincer avec trois millilitres d'antibiotique antifongique. Faisons une pression sur l'orteil pour vérifier qu'elle est complètement inconsciente avant de commencer la suture.

Et cela semble bon. Je vais utiliser Henry Shine. Numéro six, suture chirurgicale.

Je préfère faire des points d'agrafage. Je pense qu'ils sont plus résistants. Nous allons commencer simplement en passant l'aiguille à cet endroit, la tirer à travers, l'enrouler trois fois, saisir l'extrémité, puis la tirer à travers.

1, 2, 3, coupez l'excédent. Vous devez donc continuer le long de la ligne en espaçant régulièrement et en tirant fermement. Vous devez aller légèrement au-delà de l'endroit où s'arrête l'incision, puis faire un nouveau nœud.

Et j'aborde cela maintenant. Relevez légèrement le tissu ou la peau. Il y a un peu de saignement à cet endroit.

Cela devrait aller. Nous gardons un cautère à portée de main en cas de saignement, ce qui arrive parfois. Et le cautère fonctionne bien pour arrêter cela.

Donc, d'accord, je suis au-delà de l'incision. Je m'arrête ici. Tirez pour faire passer, formez une boucle, tournez trois fois autour, saisissez la boucle et tirez-la vers le bas.

Tournez-vous trois fois, saisissez la boucle, faites-la passer à travers, et retirez l'excédent. Placez l'aiguille dans le conteneur pour objets tranchants. Ensuite, nous allons utiliser une agrafeuse.

Nous allons utiliser des agrafes de taille 7 sur cet animal. Nous utilisons la taille 7 pour les souris et la taille 9 pour les rats.

Prenez simplement la peau, soulevez-la légèrement et commencez à couper. Reprenez la pince. Nous voulons espacer régulièrement les points jusqu’à un peu au-delà de l’incision, et c’est bien.

Procédez ensuite à une désinfection à l’alcool de toute la zone. Ensuite, nous allons lui administrer une injection de buprénorphine afin de s'assurer qu'elle ne ressente aucune douleur. Nous continuerons de la surveiller pendant les prochains jours afin de vérifier qu'elle reste en bonne santé et qu'elle n'éprouve aucune douleur.

Très bien, maintenant que nous lui avons administré une injection de buprénorphine, nous allons la remettre dans sa cage d'origine afin qu'elle se sente à l'aise lorsqu'elle se réveillera, la placer dans l'incubateur et la laisser environ 20 minutes jusqu'à ce qu'elle soit complètement réveillée et sèche. Nous allons vous montrer comment réaliser une électroporation in vivo in utero de l'ADN plasmidique. Nous pouvons injecter n'importe quelle molécule.

Il pourrait s'agir du tissu D ou de drogues. Les facteurs de croissance disparaissent. Si vous devez délivrer ces molécules à l'intérieur des cellules et qu'elles ne traversent pas par diffusion passive, vous aurez besoin d'électroporation et, pour cela, les molécules devront être chargées.

Mais fondamentalement, les possibilités sont illimitées. Un exemple de vecteur alternatif pour la délivrance de gènes dans la cellule : nos virus.

Dans le passé, nous avons utilisé des rétrovirus pour marquer les cellules souches gliales par de l'ADN et observer comment elles se divisent et deviennent des neurones, migrent ensuite vers le cortex après marquage des cellules par un virus ou par électroporation, ou après injection de médicaments ou de toute autre molécule affectant le développement du cerveau. Vous pouvez étudier ce phénomène par plusieurs techniques. L'une d'elles consiste à réaliser un suivi temporel (TimeLapse) au cours duquel vous effectuerez des cultures de tranches organotypiques.

Ensuite, vous suivrez le destin des cellules à l’aide d’un microscope. Comme vous pouvez le voir ici, temps 0,0. Nous commençons avec un groupe de cellules très proches du ventricule latéral.

Et au fil du temps, on observe que les cellules commencent à migrer hors de la zone ventriculaire et vers la plaque corticale. De plus, nous fixons les embryons et réalisons une immunohistochimie afin d'étudier, par exemple, la distribution de différentes molécules ou de déterminer le destin de ces différentes cellules. Une autre possibilité consiste à réaliser de l'électrophysiologie.

Nous identifions les cellules marquées, puis nous étudions leurs propriétés électriques. Eh bien, merci d'avoir suivi cette présentation. Nous espérons que vous avez apprécié nos démonstrations et que vous réussirez dans la réalisation de vos expériences.

Si vous avez des questions, n'hésitez pas à nous contacter. Vous savez, bonne chance.