Name: Transfection des cellules souches humaines à lNucleofector Amaxa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Découvrez la transfection efficace des cellules souches neuronales humaines à l'aide de l'appareil Nucleofector Amaxa. Cette méthode optimise l'efficacité de transfection et la viabilité cellulaire pour l'étude des gènes en neurosciences.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Philip H. Schwartz, de la National des Ressources Humaines des cellules souches neurales à l&#39;Hôpital des enfants s, Orange County Institut de recherche pour fournir des cultures hNSPC.

Note: Se référer à l&#39;article de repiquage neuronaux humains Cellules souches ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) et le comptage de l&#39;homme souches neurales l&#39;article Cells ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) pour apprendre à resuspendre et compter hNSPCs. Préparation <ol><li> Assurez-vous qu&#39;il ya beaucoup de cellules disponibles pour la transfection (plusieurs millions de cellules pour chaque ADN à transfecter). </li><li> Enduire un plat de culture de tissu, dans lequel les cellules transfectées seront ensemencés, avec 10 ug / ml de fibronectine humaine la nuit avant la transfection. Juste avant de commencer le protocole de transfection, retirer la fibronectine, rincer la vaisselle avec du PBS, et milieux de culture dans le plat. Laissez le plat dans les 37 ° C incubateur de culture tissulaire pour réchauffer les médias. Aussi, placer 1 ml de milieux de culture dans l&#39;incubateur pour préchauffer à 37 ° C. </li><li> Placez l&#39;ADN (s) à transfecter, et la solution de transfection (à partir Amaxa), sur la glace. </li></ol> La transfection <ol><li> Laver un nombre défini de cellules avec du PBS (nous utilisons habituellement ~ 5 x 106 cellules par transfection). Pellet les cellules par centrifugation (1000 rpm (~ 200xg) pendant 5 minutes), enlever autant que possible du PBS, et remettre le culot cellulaire dans 100 pl de la solution de transfection fourni avec le kit de transfection. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,7 ml Eppendorf. </li><li> Ajouter 5 ul de l&#39;ADN (~ 5-10 mg d&#39;ADN par transfection) à la suspension cellulaire et mélanger doucement. </li><li> Utilisation de la mini-Amaxa pipette, transférer le mélange de cellules-ADN dans la cuvette de transfection Amaxa. Assurez vous d&#39;avoir 1 ml de milieux de culture pré-chauffé pour la prochaine étape. Aussi, retirez le plat cellule avec des milieux de culture de l&#39;incubateur et placez-le dans la hotte de culture de tissus. </li><li> Placer la cuvette dans l&#39;Nucleofector, tournez la molette vers la droite, et sélectionnez le programme &quot;A-033&quot;. Appuyez sur Entrée. </li><li> Une transfection réussie est indiquée par la présence d&#39;une couche très dense de bulles sur le dessus de la solution dans la cuvette. Ajouter 500 ul média chaud dans la cuvette, et en utilisant le mini-Amaxa pipette, transférer les cellules transfectées dans le plat avec préchauffé médias. Rincer la cuvette avec des médias plus chaude et ajoutez l&#39;eau de rinçage pour le même plat. Placer le plat avec des cellules dans les 37 ° C incubateur de culture tissulaire. </li></ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

Ce protocole décrit une méthode de transfection relativement rapide et efficace pour hNSPCs. En utilisant cette procédure, nous avons obtenu des efficacités de transfection initiale de ~ 35%. Les cellules transfectées par cette procédure peut être utilisée pour études à court terme (les cellules transfectées de façon transitoire) ou pour des études à long terme si un agent de sélection est utilisée pour générer une population transfectées de façon stable. Nous avons généré des cellules transfectées de façon stable dans lequel environ 70% de...

<table><tbody><tr><td>Appareil Nucleofector</td><td>Outil</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nucleofector pour cellules souches neurales de souris</td><td>Réactif</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

transfection des cellules souches humaines à l&#39;nucleofector amaxa

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

La transfection de cellules neurales primaires de mammifères, tels que souches neurales humaines / cellules précurseurs (hNSPCs), avec couramment utilisés cationiques réactifs de transfection des lipides a souvent abouti à la viabilité des cellules pauvres et à faible efficacité de la transfection. D&#39;autres méthodes mécaniques de l&#39;introduction d&#39;un gène d&#39;intérêt, comme un canon à gènes ou de micro-injection, sont également limitées par la viabilité des cellules pauvre et le faible nombre de cellules transfectées. La stratégie consistant à utiliser des vecteurs viraux pour introduire un gène exogène dans les cellules primaires a été freinée par deux la quantité de temps et le travail requis pour créer des vecteurs viraux et de problèmes de sécurité potentiels. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour la transfection en utilisant un dispositif hNSPCs Nucleofector Amaxa et technologie avec les paramètres électriques actuels et solutions tampon spécialement optimisé pour la transfection des cellules souches neurales. En utilisant ce protocole, nous avons atteint des efficacités de transfection initiale de ~ 35% et ~ 70% après transfection stable. Le protocole implique la combinaison d&#39;un nombre élevé de hNSPCs avec l&#39;ADN à transfecter dans le tampon approprié suivie par électroporation avec l&#39;appareil Nucleofector.

L&#39;introduction d&#39;un gène d&#39;intérêt dans une cellule est une méthode puissante pour élucider sa fonction in vivo. Ce protocole décrit une méthode efficace de transfection d&#39;une culture de souches neurales humaines / cellules précurseurs (hNSPCs) en utilisant l&#39;appareil d&#39;électroporation Nucleofector faite par Amaxa.

Transfection des cellules souches humaines à l&#39;Nucleofector Amaxa

Transfection de cellules neurales mammaliennes primaires, telles que les cellules souches/précurseurs neurales humaines (hNSPCs), avec des agents de transfection cationiques lipidiques couramment utilisés...

Bonjour, je suis Steve. Je travaille dans le laboratoire du Dr Flanagan au Département d'anatomie pathologique de l'université de Californie, Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment transfecter des cellules souches neurales humaines en utilisant un facteur nucléaire maxis.Tout d'abord, vous aurez besoin d'un grand nombre de cellules. Je recommanderais au moins un flacon T25 confluent, car ce protocole exige une densité cellulaire très élevée ; vous aurez donc besoin d'au moins un million de cellules. Premièrement, je vais commencer par détacher les cellules de la surface à l'aide d'un tampon de dissociation cellulaire, puis les compter.Pour cette procédure, reportez-vous à mon protocole d’emballage. La raison pour laquelle je préfère utiliser un Amaxa pour mes expériences de transfection tient au fait qu’Amaxa propose des protocoles de transfection sur mesure pour des types cellulaires spécifiques, et dans mon cas, pour les cellules souches neuronales. Et cela fonctionne très bien.Il offre une efficacité de transfection très élevée et une viabilité cellulaire très élevée. Commençons. Je suis maintenant prêt à effectuer une transfection.Ainsi, en prévision de cette transfe

transfecting-human-neural-stem-cells-with-the-amaxa-nucleofector

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Malgré les progrès récents dans la modification génétique, la transfection de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) reste un processus capricieux. A notre connaissance, les méthodes systématiques et efficaces pour transfecter l'homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) n'ont pas été signalés. Ici, nous décrivons les protocoles robustes pour transfecter efficacement et nucleofect iPSCs de l'homme.

Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Cette vidéo décrit une technique précise d’édition du génome dans des cellules souches pluripotentes induites humaines, ou hiPSC, à l’aide de TALEN pour créer des cassures double brin au niveau d’un locus ciblé, induisant une réparation dirigée par homologie pour l’intégration des gènes de la protéine de fluorescence.

Intégration génique ciblée médiée par TALEN : utilisation de nucléases spécifiques à une séquence modifiée pour l’insertion précise d’un gène de protéine fluorescente dans des hiPSC

Cette vidéo démontre la reprogrammation directe de cellules progénitrices hématopoïétiques génétiquement modifiées en cellules souches neuronales. Les facteurs de transcription exprimés par les cellules progénitrices hématopoïétiques déclenchent une cascade d’événements moléculaires facilitant leur transformation. D’autres milieux spécifiques sont utilisés pour sélectionner et développer des cellules souches neuronales induites.

Reprogrammation directe de cellules progénitrices hématopoïétiques en cellules souches neurales

Cette vidéo démontre le processus d’induction de cellules souches pluripotentes humaines à se différencier en neurones en les transfectant avec des lentivirus modifiés portant un gène de facteur de transcription neurogène sous le contrôle d’un élément sensible à la tétracycline, suivi d’un traitement avec un dérivé de la tétracycline et un milieu de maturation.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines dans les neurones à l’aide de lentivirus modifiés

des lignées cellulaires rapporteurs offrent un moyen de visualiser, de suivre et d'isoler des cellules d'intérêt à partir de populations hétérogènes. Cependant, le ciblage génique en utilisant une recombinaison homologue conventionnelle dans les cellules souches embryonnaires humaines est extrêmement inefficace. Ici, nous décrivons le ciblage CNS lieu mésencéphale spécifique Pitx3 facteur de transcription avec EGFP en utilisant doigt de zinc nucléase amélioré recombinaison homologue.

Doigt de zinc nucléase Gene meilleur ciblage dans embryonnaires humaines Cellules souches

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

L’édition de gènes médiée par TALEN au locus AAVS1 permet l’ajout de transgènes à haute efficacité dans les iPSC humaines. Ce protocole décrit les procédures de préparation des CSPi pour l’administration de TALEN et du vecteur donneur, la transfection des CSPi, ainsi que la sélection et l’isolement des clones de CSPi afin de réaliser l’intégration ciblée d’un gène GFP pour générer des lignées rapporteures.

Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l&#39;homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

Ici, nous décrivons une méthode détaillée d’édition de gènes transparente dans des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant Cas9 nickase. Deux mutations ponctuelles ont été introduites dans l’exon 8 du locus du facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes (HNF4α) dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh).

Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

Ici, nous décrivons un système de nucléofection conçu pour améliorer l’efficacité de l’administration de gènes dans les cellules souches neurales (NSC) élargies isolées de la zone sous-ventriculaire murine adulte. Les résultats démontrent que cette méthode améliore considérablement la perturbation des gènes dans les CSN, surpassant l’efficacité des protocoles de transfection traditionnels et augmentant le taux de survie cellulaire.

Isolement, expansion et nucléofection de cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire murine adulte

Ici, nous décrivons un protocole pour concevoir des cellules souches reprogrammées chimiquement afin d’obtenir une modulation neuronale précise en différenciant ces cellules en cellules précurseurs dopaminergiques, en les transplantant dans des modèles murins de la maladie de Parkinson et en évaluant les résultats comportementaux et électrophysiologiques pour confirmer l’intégration réussie et l’efficacité fonctionnelle des cellules transplantées.

Régulation chimiogénétique dans les cellules précurseurs dérivées de cellules souches reprogrammées dans le traitement des maladies neurodégénératives

Découvrez la transfection efficace des cellules souches neuronales humaines à l'aide de l'appareil Nucleofector Amaxa. Cette méthode optimise l'efficacité de transfection et la viabilité cellulaire pour l'étude des gènes en neurosciences.

Transfection des cellules souches humaines à l'Nucleofector Amaxa

Explorer plus de vidéos