Transfection des cellules souches humaines à l'Nucleofector Amaxa

Bonjour, je suis Steve. Je travaille dans le laboratoire du Dr Flanagan au Département d'anatomie pathologique de l'université de Californie, Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment transfecter des cellules souches neurales humaines en utilisant un facteur nucléaire maxis.

Tout d'abord, vous aurez besoin d'un grand nombre de cellules. Je recommanderais au moins un flacon T25 confluent, car ce protocole exige une densité cellulaire très élevée ; vous aurez donc besoin d'au moins un million de cellules. Premièrement, je vais commencer par détacher les cellules de la surface à l'aide d'un tampon de dissociation cellulaire, puis les compter.

Pour cette procédure, reportez-vous à mon protocole d’emballage. La raison pour laquelle je préfère utiliser un Amaxa pour mes expériences de transfection tient au fait qu’Amaxa propose des protocoles de transfection sur mesure pour des types cellulaires spécifiques, et dans mon cas, pour les cellules souches neuronales. Et cela fonctionne très bien.

Il offre une efficacité de transfection très élevée et une viabilité cellulaire très élevée. Commençons. Je suis maintenant prêt à effectuer une transfection.

Ainsi, en prévision de cette transfection, j'ai déjà revêtu ma boîte de culture tissulaire avec du fibrine pendant la nuit. Ensuite, j'ai ajouté du milieu de croissance. Actuellement, elle se trouve dans l'incubateur en attente de recevoir les cellules.

De plus, j'ai préparé tous mes réactifs, mon vecteur d'ADN et la solution de transfection. Ils sont donc tous en attente ici sur de la glace. Et je suis prêt à commencer la transfection.

Voici donc le facteur nucléaire M max, et avant de le placer dans la hotte, je vais le désinfecter avec de l'éthanol à 70 %, puis le sécher avec un essuie-tout. Je viens de faire le décompte de mes cellules afin d'obtenir un total de 4 millions de cellules, que je vais maintenant semer. Je suis désormais prêt à commencer la transfection.

Tout d'abord, je vais retirer le milieu dans lequel ils se trouvent. J'ai donc mon culot cellulaire juste ici, et je vais aspirer le milieu dans lequel ils étaient. J'essaierai d'éliminer autant de milieu que possible, car je ne veux aucune protéine ni autre composant dans le milieu de transfection, car cela pourrait affecter le protocole de transfection.

J'ai donc retiré la majeure partie du milieu, et maintenant je vais resuspendre ce culot cellulaire dans cent microlitres de cette solution spécifique de facteur nucléaire pour cellules souches neuronales de souris. Mxa propose une solution de transfection destinée à la transfection des cellules souches neuronales de souris, mais ils n'en ont pas pour les cellules souches neuronales humaines. Toutefois, nous avons constaté que celle destinée aux cellules de souris fonctionne très bien. Je vais donc prélever cent microlitres de cette solution d'effecteur nucléaire pour cellules souches neuronales de souris.

Et je vais resuspendre soigneusement mon culot cellulaire afin qu’il n’y ait plus d’agrégats cellulaires. Ainsi, j’obtiens essentiellement une suspension cellulaire homogène. Je vais donc aspirer et redistribuer le liquide environ 10 fois.

Je pense donc que j'ai maintenant un mélange assez homogène, et je vais le transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. J'utilise une pipette P1000 et je vais m'assurer de prélever toute cette solution. J'ai maintenant mes 4 millions de cellules resuspendues dans la solution de transfection pour souris, et je vais maintenant ajouter cinq microlitres de mon vecteur.

Donc, je l'ai gardé sur de la glace tout ce temps jusqu'à maintenant. Et donc, je vais d'abord prélever cinq microlitres. Maintenant, je vais l'ajouter à la suspension cellulaire.

Je vais maintenant utiliser une pipette P200 réglée à environ 50 microlitres, et je vais mélanger soigneusement les cellules avec le vecteur. Je vais donc les aspirer et les expulser 10 fois. Très bien, c'est prêt.

Et moi, je suis prêt à transfecter. Je vais donc ouvrir une nouvelle microplaque. Et je vais également prendre une pipette spéciale fournie par Amaxa.

Je vais donc retirer le capuchon et je vais doucement tirer vers le haut ce mélange. Ensuite, je vais insérer la pipette entièrement dans le vial et expulser délicatement la solution. Je vais maintenant activer le facteur nucléaire max et régler cette valeur sur 33 0 3 3, puis appuyer sur entrée.

Ensuite, je vais placer le vete dans le support de vete, puis je vais faire tourner la roue ; maintenant, je suis prêt à transfecter. Mais auparavant, je vais m'assurer que j'ai un milieu tiède prêt à être ajouté immédiatement aux cellules transfectées. Cela permet d'augmenter la viabilité cellulaire si j'ajoute le milieu tiède directement dans le vete juste après la transfection.

Je vais donc préparer un P 1000. Et aussi, je vais prendre le milieu de culture qui se trouve actuellement dans l'incubateur afin de pouvoir transférer les cellules dans ce milieu immédiatement. Maintenant, je vais de nouveau appuyer sur entrée et c'est terminé.

Et la transfection réussie, comme vous pouvez le voir, présente ici une couche très épaisse de bulles qui indique une transfection réussie. Je vais donc ajouter 500 microlitres de milieu préchauffé dans le vete. J'ajoute ainsi davantage de milieu que les cellules désirent fortement, et je vais utiliser la même pipette MX pour prélever les cellules du vete.

Ils sont donc vraiment stressés en ce moment. Je vais donc les placer directement dans du milieu tiède, davantage de milieu tiède. Enfin, la dernière étape : je vais rincer la Q vete avec un peu plus de milieu préchauffé afin de m'assurer de récupérer toutes ces cellules, puis je vais les transférer dans le même puits L et placer la plaque immédiatement dans l'incubateur.

Dans cette image, nous observons des cellules souches neurales humaines qui ont été transfectées avec un facteur nucléaire d'accès et cultivées sur des lamelles quadrillées. Ainsi, dès deux jours après le transfection, nous obtenons une efficacité de transfection d'environ 50 %, observable par l'expression de la GFP. Aujourd'hui, je vous ai montré comment transfecter des cellules souches neurales humaines en utilisant le facteur nucléaire Xis.

Bonne chance avec votre transfection.