Name: Dosage expression en surface des récepteurs chimiosensoriels dans des cellules hétérologues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Apprenez à détecter l'expression en surface des récepteurs chimiosensoriels dans des cellules HEK293T par marquage cellulaire en direct. Cette méthode permet d'étudier les récepteurs couplés aux protéines G par microscopie à immunofluorescence.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions les membres du laboratoire pour Matsunami lecture critique de ce manuscrit.

1. Procédure: La procédure comprend trois parties réalisé sur une durée totale de 3 jours: les cellules de transfert, la transfection et l'immunocytochimie, une étape menée par jour. Transfert et transfection de cellules au cours des deux premiers jours doit être effectué dans des conditions stériles dans une chambre à flux laminaire. Jour 1: Transfert de cellules pour le dosage HEK293T expression à la surface. <ol><li> Le fluide caloporteur (M10): Mélanger milieu essentiel minimum supplémenté avec 10% (en volume) de sérum bovin fœtal à l'état stérile. </li><li> Cultiver des cellules à une confluence souhaité dans une plaque de culture de 100 mm, selon le nombre de plaques nécessaires pour mettre en place. Il est important de déterminer la fraction de cellules pour être transféré à éviter des cellules envahies ou clairsemés: par exemple, à partir d'un 100% de confluence 100 mm plat, on peut transférer environ 3% à un plat de 35 mm afin d'obtenir environ 30% de confluence dans le celui-ci. </li><li> Avant le transfert de cellules, dans la chambre de flux laminaire stérile, manteau 22 X 22 mm en verre glisse couvrir avec la lysine stériles poly D (1 mg / ml) et placer un dans chaque plat de 35 mm de culture cellulaire, face enduite pour plaquage cellules (figure 1 ). Laisser la solution à sec pendant 5 - 10 minutes. Durant cet intervalle, la source UV dans la chambre de laminaire peut être activée pour stériliser les lamelles, si désiré. Poly D lysine aide les cellules hétérologues coller à l'lamelles. </li><li> Pour transférer des cellules, aspirer à des médias existants dans le plat 100mm, se laver en prenant soin d'ajouter 8 ml de PBS stérile, aspirer PBS et les cellules en utilisant trypsiniser 3 mL 0,05% de trypsine-EDTA; lorsque les cellules se détachent de la vaisselle, bloc de réaction enzymatique par d'autres ajoutant 5 ml M10. Triturer les cellules et le transfert du volume requis pour un tube stérile conique; centrifuger à 200g pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules. Aspirer à surnageant contenant la trypsine-EDTA, laissant le culot de cellules intactes. Pour transférer les cellules à plaques de 35 mm, ajouter 1 ml M10 pour chaque plat et triturer à dissocier les cellules. Ajouter 1 mL de cellules en suspension à chaque plat. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Coat 22 X 22 mm avec des lamelles en verre poly D lysine et le lieu couché une face dans chaque plat de 35 mm. </li></ol> Jour 2: La transfection de cellules HEK293T. <ol><li> 18-24 heures après le transfert, les cellules sont prêtes pour la transfection du récepteur à doser. Utilisez des récepteurs et RTP1S clonés dans le vecteur d'expression mammifère PCI, préparés à partir de cultures bactériennes en utilisant Qiagen Miniprep Kit protocole suivant décrit avant 4. Utilisez des récepteurs qui sont N terminale taggés avec 20 acides aminés à long épitope rhodopsine pour faciliter immunomarquage. </li><li> Utilisez des 1000ng construire des récepteurs, 250 ng de RTP1S construire et 50 ng de protéine à fluorescence verte chaque transfection. Effectuer transfection en utilisant Lipofectamine 2000, conformément au manuel du fabricant. </li></ol> Jour 3: immunocytochimie de visualiser les récepteurs de surface des cellules colorées. <ol><li> Avant de commencer, préparer la coloration et des solutions de lavage et de les refroidir à 4 ° C. Coloration moyennes: Minimum Essential Medium, 45 ml; sérum de veau fœtal, 5 ml; HEPES (1M), 500 ul (concentration finale 10 mM); azide de sodium (1,5 M), 500 ul (concentration finale 15 mM). Solution de lavage: HBSS, 500 ml; HEPES (1M), 5 ml (concentration finale 10 mM); azide de sodium (1,5 M), 5 ml (concentration finale 15 mM). Les deux solutions peuvent être conservés à 4 ° C pour les réutiliser. Préparer des solutions d'anticorps en diluant les anticorps nécessaires à moyen et coloration 100 fois. </li><li> Démarrer immunochimie pour la coloration de surface pour les récepteurs olfactifs environ 24 heures après la transfection. Pour effectuer une coloration de cellules vivantes, le dispositif expérimental suivi doit être refroidi à 4 ° C: remplissez un grand contenu de glace et de Pat la surface de la glace pour la rendre aussi uniforme que possible, placez un bac sur la glace et de le vaporiser avec 70% l'éthanol. Coupez un morceau de parafilm (plus petit que la longueur du bac) et l'apposer sur le plateau de l'éthanol pulvérisé, pour obtenir une surface lisse. Transférer les lamelles de verre contenant des cellules transfectées sur le parafilm, un à la fois, côté pile, en utilisant une pince à épiler. Couche de chaque lamelle avec 100 uL solution de coloration à froid primaire, extrusion soin à partir d'un coin de la glisse (figure 2). Après superposition de tous les bordereaux de couvrir avec une solution d'anticorps, couvrir le bac pour éviter l'assèchement de la solution dans l'air. Effectuer une incubation primaires pendant 45-60 minutes. </li><li> Après une incubation de primaire, de transférer rapidement des lamelles de la culture de plats originaux 35mm, contenant les médias. Aspirer les médias et ajouter 2 ml de solution de lavage refroidie doucement à partir du bord du plat pour éviter de perdre les cellules de la lamelle. Aspirer la solution de lavage et de répéter deux fois pour terminer trois lavages. A la fin du troisième lavage, ne pas aspirer la solution au lavage. </li><li> Préparer anticorps secondaire solutidans les médias coloration et de transférer les lamelles de la solution de lavage à une couche de parafilm nouvellement apposée dans le même bac. Encore une fois délicatement extruder 100 uL de solution d'anticorps à la couche de chaque lamelle, à partir du coin, comme l'incubation primaire. Effectuer une incubation secondaire pour 30 - 45 minutes et transfert à la solution de lavage dans les 35 plats originaux mm. Une fois de plus, se laver le couvercle glisse trois fois comme décrit. </li><li> Aspirer la solution de lavage du dernier lavage et ajouter 2 ml de paraformaldéhyde 1% réfrigérée. Fixer les cellules dans une solution de paraformaldéhyde réfrigérée à 1%, sur la glace pendant 15 minutes. </li><li> Montez le couvercle glisse sur le verre de microscope propre diapositives à l'aide de réactifs de montage Mowiol, avec le côté pile vers le bas et prudemment exclure toutes les bulles d'air (figure 3). Une fois séché à l'air Mowiol, lavez délicatement lamelles en ajoutant de l'eau distillée sur la surface et aspirer immédiatement. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Couche de chaque lamelle avec 100 uL solution de coloration à froid primaire. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Monter les lamelles avec le côté pile vers le bas sur microscope en verre propres diapositives à l'aide de réactifs Mowiol montage. </li></ol> 2. Les résultats représentatifs: Coloration des cellules en direct permet de visualiser les protéines à la surface des cellules, sur la transfection de récepteurs avec des chaperons (dans ce cas, des récepteurs olfactifs Olfr62, avec RTP1S récepteur protéique Transport) (figure 4). Coloration de la surface cellulaire des récepteurs est caractérisée par le modèle ponctuée de taches (figure 4B, en médaillon). Coloration effectué de façon inappropriée peut entraîner une augmentation du bruit, ce qui rend difficile pour l'observateur de distinguer la coloration de surface réelle du bruit. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Transfection Figure 4. Des récepteurs avec des chaperons permet la visualisation des protéines à la surface des cellules utilisant une coloration de cellules vivantes. La transfection du récepteur odorant Olfr62 seul (A) et la transfection de Olfr62 avec chaperon RTP1S (B). Les niveaux d'expression de GFP servir de contrôle de transfection (A 'et B').

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

Chaque étape doit être réalisée avec soin pour s&#39;assurer coloration de surface importante et distinctive. Le processus de coloration au complet doit être effectué à froid (sur glace), et le plateau sur lequel sont fixées des lamelles doit être refroidi avant de l&#39;utiliser pour assurer les cellules rester en vie. Par ailleurs la fixation est effectuée à la fin du processus de coloration de surface. Ceci est en contraste frappant avec la coloration interne où la fixation précède coloration pour perméabiliser la me...

<table><tbody><tr><td>Couvre-objet 22 x 22 mm (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Milieu minimum essentiel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>Avec L-glutamate, sel d'Earle&amp;rsquo;s et bicarbonate</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) 1X</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>14025</td><td>Avec chlorure de calcium et chlorure de magnésium</td></tr><tr><td>Solution tampon HEPES</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>Sans calcium ni magnésium</td></tr><tr><td>Hydrobromure de poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture de tissus 35 x 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25300</td><td>0,05 %</td></tr></tbody></table>

dosage expression en surface des récepteurs chimiosensoriels dans des cellules hétérologues

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Le monde des odeurs vives est reconnu par le sens de l&#39;olfaction. Olfaction chez la souris est médiée par un répertoire d&#39;environ 1200 récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 1 qui sont postulés pour lier les molécules odorantes volatiles et en convertissant le signal extracellulaire en signal intracellulaire par couplage avec la protéine G Gαolf. La liaison de l&#39;odorants aux récepteurs est pensé pour suivre une règle combinatoire, qui est, un odorant peut lier plusieurs récepteurs et un récepteur peut se lier plusieurs molécules odorantes à des degrés divers 2. Biochimiques, la signalisation et des études de liaison ligand ont été commodément effectuée pour la plupart des RCPG en utilisant des cellules hétérologues. Cependant l&#39;utilisation de cellules hétérologues pour l&#39;étude des récepteurs olfactifs, a été exclue pour un temps depuis longtemps sur la transfection ils ont échoué à l&#39;exportation vers la surface. Saito et al ont démontré seule récepteur membranaire passent protéine de transport (RTP) chaperons familiales montrent une expression accrue dans les neurones olfactifs sensoriels et d&#39;agir comme accompagnateur à récepteurs olfactifs du trafic à la surface des cellules hétérologues, en cas de co transfectées ensemble 3. Pour mener à bien des dosages biochimiques des récepteurs utilisant des cellules hétérologues, on doit d&#39;abord déterminer si le récepteur affiche l&#39;expression en surface robuste dans la lignée cellulaire. Cela peut être dosé en surexprimant les récepteurs à la RTP1S chaperon suivie par coloration de cellules vivantes à fluorescence étiquette du domaine extracellulaire ou un tag dans le domaine extracellulaire exclusivement. Ici nous démontrons un protocole pour mener à bien coloration de cellules vivantes qui peuvent être utilisés pour détecter les récepteurs olfactifs à la surface des cellules HEK293T commodément. En outre, il peut également être utilisé pour le dosage de l&#39;expression de surface d&#39;autres récepteurs chimiosensoriels ou RCPG.

Ici nous démontrons un protocole pour mener à bien coloration de cellules vivantes qui peuvent être utilisés pour détecter les récepteurs olfactifs à la surface des cellules HEK293T commodément. En outre, il peut également être utilisé pour le dosage de l&#39;expression de surface d&#39;autres récepteurs chimiosensoriels ou RCPG.

Dosage expression en surface des récepteurs chimiosensoriels dans des cellules hétérologues

Le monde vibrant des odeurs est reconnu par le sens de l'olfaction. Chez la souris, l'olfaction est médiée par un répertoire d'environ 1 200 récepteurs couplés aux protéines G...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment la détection de l'expression membranaire de récepteurs chimiosensoriels peut être réalisée par marquage de cellules vivantes dans des cellules HEK 293T. Cette étape est réalisée en semant d'abord les cellules sur des lamelles recouvertes de poly-D-lysine dans des boîtes de culture. La deuxième étape de la procédure consiste à transfecter de l'ADN dans des cellules HEK 293T. La troisième étape de la procédure consiste à effectuer un marquage de cellules vivantes à l'aide d'anticorps primaires et d'anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome.La dernière étape de la procédure consiste à fixer les cellules colorées et à monter les lamelles. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant la localisation des récepteurs à la surface des cellules par microscopie en immunofluorescence. Cette méthode nous permet de détecter les récepteurs chimiosensoriels exportés à la surface cellulaire de cellules hétérologues telles que les HEK 293T. Une démonstration visuelle de cette méthode va indiquer les étapes clés qui doivent être strictement suivies afin de maintenir les cellules vivantes pour l'auto-marquage cellulaire.Les personnes novices dans cette méthode peuvent trouver délicates les étapes telles que le transfert, la manipulation et la pose du coverslip. Toutefois, après quelques essais, la technique devient facile. À l’aide d’un protocole modifié utilisant une colonne cgen, purifiez l’ADN plasmatique du récepteur et du récepteur. Le transport de la protéine RT TP, clonée dans un vecteur d’expression PCI à un million, garantit que, pour la coloration immunohistochimique, le récepteur recouvert est marqué en terminaison C par un épitope d’une longueur de 20 acides aminés afin de faciliter l’adhérence des cellules.Codez les lamelles en verre avec un milligramme par millilitre. Placez les lamelles de polylysine dans des boîtes de culture cellulaire de 35 millimètres, côté revêtu vers le haut, pour les faire sécher à l’air dans la chambre à flux laminaire stérile. Plaquez les cellules HEK 293T à environ 30 % de densité dans un millilitre de milieu M10, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit piégée entre la lamelle et la boîte de culture cellulaire. Incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 18 à 24 heures. Pour chaque transfection, préparez un mélange d’ADN composé de 1000 nanogrammes de construit récepteur, 250 nanogrammes de construit RTP1S et 50 nanogrammes de construit GFP.Suivant les instructions du fabricant, transfectez les cellules avec du lipectomy 2000. Préparez le milieu de marquage en ajoutant de l'azoture de sodium et des hippies au M 10. Ce mélange peut être conservé à quatre degrés Celsius pendant plusieurs mois.Ensuite, préparez un tampon de lavage contenant de l'azoture de sodium à 15 millimolaire et du heis à 10 millimolaire. Dans du HBSS froid, le tampon de lavage peut être conservé à quatre degrés Celsius pendant plusieurs mois. Afin d'effectuer la coloration à froid, placez un plateau contenant du parfum sur de la glace pendant cinq minutes.Avec la face des cellules vers le haut, transférez les lamelles en verre contenant les cellules transfectées du coin de la lamelle vers le paraforme. Ajoutez soigneusement 100 microlitres d'anticorps primaire froid, dilué dans le milieu de marquage. Incubez pendant 60 minutes à température ambiante. Lavez ensuite les cellules dans les boîtes de culture originales de 35 millimètres en ajoutant et en aspirant alternativement la solution de lavage froide.Répétez deux fois. De la même manière, incubez avec l'anticorps secondaire conjugué SI trois pendant 30 minutes. Effectuez trois lavages dans les boîtes de 35 millimètres.Enfin, fixez les cellules avec une solution fraîche de paraformaldéhyde à 1 %. Veillez à exclure toutes les bulles d'air. Montez les lamelles côté cellules vers le bas sur des lames de microscope en utilisant du mole, puis rincez la surface des lamelles avec de l'eau distillée pour éliminer les dépôts salins.Typiquement, comme avec les OL FFR 62 et les RTP, la coloration d'un récepteur à la surface cellulaire se caractérise par une apparence ponctuée du signal fluorescent provenant de l'anticorps conjugué. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour colorer de 32 à 40 lamelles en aussi peu que deux heures et demie à trois heures. Lorsqu'on effectue cette procédure avec plusieurs lamelles, il est important de transférer et de commencer l'incubation avec l'anticorps une lamelle à la fois afin d'éviter que les cellules ne s'assèchent.

assaying-surface-expression-chemosensory-receptors-heterologous

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Source : de March, C. A. et. al., Surveillance in vitro en temps réel de l’activation des récepteurs odorants par un odorisant en phase vapeur. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la méthode de surveillance de l’activation en temps réel des récepteurs odorants dans les cellules de mammifères recombinants à l’aide de la mesure de la luminescence. La liaison odorante déclenche l’activation de la protéine G et la production d’AMPc, activant les protéines glocapteurs qui émettent de la...

Surveillance en temps réel de l’activation des récepteurs odorants dans les cellules recombinantes

Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l'adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d'un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA.

Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

Modèles d'activation des récepteurs olfactifs codent l'identité de l'odeur, mais le manque de données publiées identification des ligands odorants pour les récepteurs olfactifs de mammifères entrave le développement d'un modèle complet de codage de l'odeur. Ce protocole décrit un procédé pour faciliter l'identification à haut débit de ligands de récepteurs olfactifs et la quantification de l'activation du récepteur.

Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité

Caractériser le fonctionnement des récepteurs odorants sert un élément indispensable dans le processus de deorphanization. Nous décrivons une méthode permettant de mesurer l’activation des récepteurs odorants en temps réel à l’aide d’un test de cAMP.

Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP

Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.

Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants

Physiologiquement, les odorants récepteurs sont activés par des molécules odorantes inhalés en phase vapeur. Cependant, la plupart des systèmes in vitro utilisent une stimulation de la phase liquide odorant. Nous présentons ici une méthode qui permet un suivi en temps réel in vitro de l’activation des récepteurs odorants lors de la stimulation de la substance odorante en phase gazeuse.

En temps réel en Vitro suivi d’Activation des récepteurs de l’odeur par une substance odorante en Phase vapeur

Cet article présente une méthode pour étudier le trafic de récepteur de glutamate (GluR) dans les cultures hippocampal primaires dissociées. Utilisant une approche d'alimentation par anticorps pour étiqueter les récepteurs endogènes ou surexprimés en combinaison avec des approches pharmacologiques, cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires régulant l'expression de surface du GluR en modulant processus d'internalisation ou de recyclage.

Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour mesurer rapidement et semiquantitativement les interactions ligand-récepteur dans trans dans un système cellulaire heterologous utilisant la microscopie de fluorescence.

Mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux

L’article décrit les méthodes et les réactifs nécessaires pour effectuer l’hybridation de l’hybridation de l’ARN en fluorescence sur montage entier (HCR ARN, WM-FISH) afin de révéler des informations sur la résolution spatiale et cellulaire des gènes des récepteurs chimiosensoriels dans l’antenne du moustique et le palpe maxillaire.

Hybridation Réaction en chaîne ARN Fluorescence intégrale Hybridation in situ de gènes chimiosensoriels dans les appendices olfactifs des moustiques

Ce protocole décrit l’expression et la quantification des sous-unités neuronales des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine à l’aide de la lignée cellulaire Neuro-2a des mammifères. Les marqueurs fluorescents sensibles au pH et la microscopie confocale permettent une évaluation précise de la localisation des récepteurs à la membrane plasmique par rapport à celles exprimées dans les compartiments intracellulaires neutres en pH, facilitant ainsi l’étude du trafic et de la modulation...

Localisation des récepteurs de la membrane plasmique et des récepteurs de l’acétylcholine nicotinique neuronale intracellulaire à l’aide de l’imagerie quantitative dans les cellules de mammifères

Apprenez à détecter l'expression en surface des récepteurs chimiosensoriels dans des cellules HEK293T par marquage cellulaire en direct. Cette méthode permet d'étudier les récepteurs couplés aux protéines G par microscopie à immunofluorescence.

Dosage expression en surface des récepteurs chimiosensoriels dans des cellules hétérologues

Explorer plus de vidéos