Surfaces Micropatterned pour étudier les interactions acide hyaluronique avec les cellules cancéreuses

L'invasion et la progression du cancer impliquent un phénotype cellulaire modal, régulé de manière complexe par des facteurs de croissance, des cytokines et des composants de la matrice extracellulaire présents dans le microenvironnement tumoral. L'acide hyaluronique, ou HA, est un composant stromal de la matrice extracellulaire connu pour faciliter la progression tumorale en renforçant l'invasion, la croissance et l'angiogenèse, par l'interaction de l'HA avec son récepteur membranaire. L'interaction de CD44 avec l'HA déclenche des événements de signalisation qui favorisent la croissance, la survie et la migration des cellules tumorales, augmentant ainsi la dissémination métastatique. Étudier l'adhésion, la migration et la croissance des cellules cancéreuses sur de l'HA exogène.

La photolithographie standard est utilisée pour fabriquer un tampon élastomère microstructuré, qui permet ensuite de créer un réseau ordonné de molécules d'aminoséline sur des substrats de verre. Ensuite, une chimie de carbodiimide est réalisée afin d'attacher de manière covalente l'acide hyaluronique (HA) aux aminosélines microstructurées. Ainsi, des motifs microscopiques d'acide hyaluronique sont obtenus, sur lesquels des cellules cancéreuses en culture peuvent être ensemencées. Les interactions entre les cellules cancéreuses et l'acide hyaluronique exogène peuvent alors être visualisées par microscopie optique, ou par des techniques d'imagerie haute résolution telles que la microscopie électronique à balayage ou la microscopie immunofluorescente.

La méthode de création de surfaces microstructurées en acide hyaluronique présentée dans cet article vidéo peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, comme l'élucidation plus poussée du rôle de l'acide hyaluronique exogène dans la progression du cancer. Pour fabriquer un tampon en polyméthylsiloxane ou en PDMS présentant une microstructure, qui sera utilisé pour imprimer des lames de verre avec de l'HA, commencez par prendre une nouvelle plaquette de silicium à l'aide de pinces.

Ensuite, au-dessus de l’évier du laboratoire. Utilisez une bouteille de lavage pour rincer la plaquette avec de l’éthanol et séchez-la avec un courant d’air. Éteignez les lumières de la pièce.

Ensuite, à l’aide de pinces, transférez la plaquette vers un spin coater en utilisant une pipette de transfert ; recouvrez au moins 80 % de la surface de la plaquette avec une résine photosensible négative SU 2025, puis appliquez un revêtement par rotation pendant 10 secondes à 600 tr/min. Ensuite, faites-le tourner pendant 30 secondes à 3000 tr/min. Transférez la plaquette recouverte de résine photosensible sur une plaque chauffante et effectuez un pré-cuisson à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Puis retirez-la de la plaque chauffante et laissez-la refroidir pendant une minute.

Placer un masque préfabriqué avec le motif souhaité sur la tranche recouverte de photo-résist et d'UV. L'irradier pendant 20 secondes. Ensuite, transférer la tranche sur une plaque chauffante et effectuer une cuisson dure à 110 degrés Celsius pendant six minutes.

Allumez les lumières et retirez la plaquette du bloc chauffant. À ce stade, des motifs distincts devraient être visibles à l’aide d’une pipette de transfert. Rincez soigneusement la plaquette avec le révélateur de photo-résine SU eight après trois rinçages avec la solution révélatrice, puis rincez à l’éthanol.

Si un résidu blanc est présent, répéter le rinçage avec la solution de développement de photo-résine ou plonger simplement la plaquette dans la solution de développement pendant deux minutes, puis rincer à nouveau avec de l'éthanol, laver à l'eau et sécher à l'aide d'un courant d'air dans un grand bateau en lactosérum. Mélanger la solution d'élastomère PDMS et l'agent de réticulation selon un rapport pondéral de 10 pour 1 ; pour la plaquette illustrée ici, 22 grammes suffisent. Verser dans un tube de centrifugeuse et faire tourner à 900 tr/min pendant cinq minutes.

Pour éliminer les bulles d'air, placez la plaquette structurée dans une boîte de Pétri de taille appropriée. Versez suffisamment de solution de PDMS dessus pour recouvrir complètement la plaquette d'une épaisseur d'environ un quart de pouce. S'il y a des bulles présentes à la surface de la plaquette, placez-la dans un dessiccateur sous vide jusqu'à leur disparition.

Polymériser toute la nuit à température ambiante pour former un tampon élastomère complémentaire. Si le PDMS n'est pas complètement polymérisé après 12 heures, placer la plaquette dans un four à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Retirer délicatement le PDMS de la plaquette.

Ensuite, à l’aide d’un rasoir, découper le tampon à la taille souhaitée. Placer le tampon dans un bain ultrasonore contenant de l’éthanol, de préférence dans un support en plastique, et soumettre à une sonication pendant 15 minutes. Les tranches peuvent être utilisées plusieurs fois pour créer de nouveaux tampons élastomériques afin d’immobiliser covalemment l’ha sur des surfaces de verre en zones définies.

Commencez par nettoyer toutes les lames à utiliser dans un nettoyeur à plasma, conformément aux instructions fournies dans le texte accompagnant. Une fois les lames en verre nettoyées, utilisez une pince pour les retirer du nettoyeur à plasma. Placez les lames dans une boîte de Pétri en plastique et mettez-les de côté pour une utilisation ultérieure.

Ensuite, préparez la solution d'aminocline à déposer sur la lame de verre pour fixer l'acide hyaluronique dans un tube conique en polystyrène de 15 millilitres. Préparez une solution fraîche à 3 % volume par volume de triméthoxypropylaminosilane, ou A-P-T-M-S, dans de l'éthanol à 95 % volume par volume, pour un volume total de cinq millilitres. Laissez la solution réagir pendant cinq minutes à température ambiante.

Pendant cette période, l'A-P-T-M-S est converti par hydrolyse en un ciol. Ensuite, en ne touchant que les côtés, placez le motif du tampon en PDMS vers le haut sur un mandrin de spin coater. Utilisez une pipette de transfert pour recouvrir la surface du motif avec de l'A-P-T-M-S.

Ensuite, appliquez par rotation la surface du tampon avec du A-P-T-M-S à 3 500 tr/min pendant 30 secondes. Après avoir retiré le tampon en PDMS du support de rotation et l’avoir inversé de sorte que la face structurée soit orientée vers le bas, placez une extrémité du tampon en PDMS au centre de la lame de verre et appuyez délicatement pour que l’ensemble du tampon adhère à la lame de verre pendant une minute. Ensuite, retirez délicatement le tampon en PDMS et laissez la lame de verre portant le motif de A-P-T-M-S reposer à température ambiante.

Après 30 minutes, rincer la surface du motif avec de l'éthanol et sécher à l'aide d'un courant d'air. Soniquer le tampon en PDMS pendant 15 minutes pour éliminer tout excès d'A-P-T-M-S. Puis placer les lames sur une plaque chauffante pendant une heure à 115 degrés Celsius afin de chauffer les surfaces et d'éliminer l'excès d'eau.

Rincer à l'éthanol et sécher à l'air à l'aide de pinces. Transférer la lame avec le motif dans une boîte de Pétri en verre. Utiliser une pipette de transfert pour recouvrir complètement la lame de verre par une solution fraîchement préparée de polyéthylène glycol ou de solution de peg cline, qui servira de région non adhésive entourant les motifs.

Après une incubation de 45 minutes à 75 degrés Celsius, versez la solution saline excédentaire de PEG. Ensuite, tout en tenant la lame de verre avec des pinces, rincez la surface des lames de verre imprimées avec du toluène, puis à nouveau avec de l'eau, et séchez à l'aide d'un courant d'air. Placez les lames dans une boîte à lames humidifiée.

Ensuite, placez la boîte dans une hotte de sécurité biologique et allumez la lampe UV pendant une heure afin d'effectuer une irradiation germicide. Poursuivez les opérations dans la hotte de sécurité biologique à partir de ce moment. Pour maintenir la stérilité à l'extérieur de la hotte, préparez une solution aqueuse stérile d'HA d'un millilitre composée de 10 millimolaire.

Un éthyl 3,3-diméthylaminopropylcarbodiimide ou EDC à 5 millimolaire et de l'hydroxysuccinimide à 50 microgrammes par millilitre. Le EDC marqué au fluorescéine stérile est un agent de réticulation de longueur nulle qui réagit avec les groupes carboxyles de l'HA pour former des intermédiaires réactifs avec les amines. Comme cet intermédiaire est sensible à l'hydrolyse, le NHS est ajouté afin d'augmenter l'efficacité de la réaction du carbodiimide.

Ensuite, appliquez des aliquotes de 200 microlitres de solution stérile d’acide hyaluronique (HA) sur le verre structuré jusqu’à ce que la zone structurée soit recouverte. Fermez ensuite la boîte à lames afin de protéger les préparations de la lumière. Les substrats structurés doivent être laissés au hotte sans perturbation pendant 16 à 24 heures, le temps que la solution d’HA interagisse avec le motif microscopique : une liaison MI stable se forme entre l’intermédiaire HA et l’amine primaire de l’A-P-T-M-S.

Le lendemain, utiliser une pipette Pasteur APA pour aspirer la solution d'acide hyaluronique. Rincer les lames avec du PBS, puis recouvrir la surface de 1 % de BSA dans du PBS pendant une heure. La surface est désormais prête pour la culture cellulaire.

Placer les surfaces micropaternisées d'acide hyaluronique dans une boîte de Pétri stérile pour la culture sur des surfaces micropaternisées d'acide hyaluronique. Ensemencer des suspensions monocellulaires de cellules cancéreuses avec des densités comprises entre 0,4 et 1 × 10⁶ cellules cancéreuses par 18,75 cm² de surface de verre dans un millilitre de milieu cellulaire afin de recouvrir la surface de la lame de verre. Placer soigneusement les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone, en prenant soin que le milieu ne déborde pas. L'adhésion cellulaire devrait survenir dans les 24 heures et peut être observée à l'aide d'un microscope optique inversé.

Les surfaces de culture cellulaire peuvent être conservées jusqu'à cinq jours. Dans des conditions d'incubateur standard, changez le milieu tous les deux jours. La morphologie et la croissance cellulaire peuvent être observées à l'aide d'un microscope optique inversé.

Des essais cellulaires supplémentaires peuvent ensuite être appliqués pour analyser les réponses à la surface de HA dans l'exemple montré ici. Surface de motif HA visualisée à l'aide d'un microscope à fluorescence et d'une image. L'analyse de l'intensité de fluorescence J démontre la déstabilisation du motif de HA.

Les surfaces micropaternisées d'HA permettent l'étude des interactions des cellules cancéreuses avec l'HA exogène. L'adhésion des cellules cancéreuses sur les surfaces micropaternisées d'HA est illustrée ici. À la fois les cellules de carcinome du côlon et du sein adhèrent préférentiellement aux zones d'HA après 24 heures de culture. Une imagerie à haute résolution par microscopie électronique à balayage peut être utilisée pour analyser les interactions entre les cellules cultivées et les surfaces immobilisées avec de l'HA.

Dans ce micrographie électronique à balayage, on observe l'interaction entre des cellules cancéreuses du côlon et l'acide hyaluronique (HA) ; un grossissement plus élevé est montré à droite. Des cellules de cancer du sein cultivées sur des surfaces à base d'acide hyaluronique (HA) sont présentées ici, avec à nouveau un grossissement plus élevé à droite. Cette analyse démontre clairement la présence de prolongements adhésifs qui favorisent l'expansion des cellules cancéreuses sur les motifs microscopiques d'acide hyaluronique (HA).

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des surfaces microstructurées à l'acide hyaluronique et comment les utiliser pour étudier la réponse des cellules cancéreuses.