Name: Surfaces Micropatterned pour étudier les interactions acide hyaluronique avec les cellules cancéreuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Découvrez la fabrication de surfaces micropatternées pour étudier les interactions entre l'acide hyaluronique et les cellules cancéreuses. Cette méthode par photolithographie permet de visualiser l'adhésion et la migration cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs reconnaissent l&#39;usage du laboratoire d&#39;analyse de surface à l&#39;Université Johns Hopkins, financé dans le cadre de la Science Materials Research and Engineering Center à travers la Fondation nationale des sciences. LED est un stagiaire et un IGERT National Science Foundation Graduate Fellow. Cette recherche a été partiellement financé par le NIH octroi U54CA143868.

1. La photolithographie standard pour fabrication de timbres Micropatterned <ol><li> Rincer une nouvelle plaquette de silicium avec de l'éthanol et sécher avec un courant d'air. Utilisez une pince pour manipuler plaquette et éviter les défauts de surface pendant le processus entier. </li><li> Transfert plaquette pour faire tourner coucheuse et couvrir surface de la galette avec les SU-2025 photoresist négatif. Couvrir au moins 80% de la plaquette de résine photosensible. Manteau de Spin pendant 10 secondes à 600rpm, suivie de 30 secondes à 3000rpm. En raison de la photosensibilité de la résine photosensible, éteindre les lumières Chambre à partir de ce point vers l'avant. </li><li> Transfert photorésine plaquette de silicium recouvert la plaque chaude pour "soft-bake" à 95 ° C pendant 3 minutes. Retirer de la plaque chaude et laisser 1 minute pour refroidir. </li><li> Placer un pré-fabriqués masque avec le motif désiré sur le dessus de la plaquette de silicium photosensible couvertes et d'exposer aux rayons ultraviolets (UV) (350-450 nm) pendant 20 secondes. </li><li> Plaquette de silicium Transférer dans une assiette chaude pour "hard-bake" à 110 ° C pendant 6 minutes. </li><li> Allumez les lumières et les retirer à partir de plaquettes plaque chauffante. Modèles distincts devraient être visibles à ce stade. </li><li> Rincer soigneusement plaquette de silicium avec des SU-8 développeur résine photosensible. Après 3 rinçages avec une solution développeur, rincer avec de l'éthanol. Si aucun résidu blanc est présent, répétez rincer avec la solution de révélateur photosensible, ou tout simplement plonger la plaquette dans la solution de révélateur pendant 2 minutes et procéder à nouveau avec de l'éthanol rincer. Laver à l'eau et l'air sec. </li><li> Mélanger polydiméthylsiloxane (PDMS) solution d'élastomère et de durcisseur dans un ratio de 10:1 poids. Centrifuger à 900rpm pendant 5 minutes pour enlever les bulles d'air. </li><li> Placez motifs plaquette dans une boîte de Pétri et versez PDMS sur wafer de silicium. S'il ya des bulles présentes, dans dessiccateur sous vide pendant quelques minutes jusqu'à ce bulles disparaissent. </li><li> Cure nuit à température ambiante (TA) pour former un tampon élastomère complémentaires. Si PDMS n'est pas complètement guéri après 12 heures, mettre au four à 60 ° C pendant 30 minutes. </li><li> Retirer délicatement le PDMS à partir de plaquettes de silicium. Utilisez une lame de rasoir pour couper de timbre à la taille désirée. Soniquer dans l'éthanol pendant 15 minutes. Gaufrettes peut être utilisé plusieurs fois pour créer des timbres nouveaux élastomères. </li></ol> 2. Micropatterning HA <ol><li> Plasma nettoyage des lames de verre pendant 5 minutes. Placez toutes les diapositives dans la chambre et le vide pendant 5 minutes. Puis permettent à faible débit d'oxygène pour entrer dans la chambre. Tournez nettoyant plasma pendant 5 minutes. Retirer du plasma et plus propre place dans une boîte de Pétri en utilisant une pince. </li><li> Pendant le nettoyage au plasma, soniquer timbres de PDMS dans l'éthanol pendant 15 minutes. </li><li> Préparer une fraîche 3% v / v solution de 3-aminopropyltriméthoxysilane (APTMS) dans 95% v / v d'éthanol dans un tube à centrifuger de 15 ml. Laisser réagir pendant 5 minutes à température ambiante pour former un silanol. </li><li> Placez timbre en PDMS structure en place sur les spin coater mandrin et la couverture à motifs de surface avec une solution APTMS. Spincoat à 3500rpm pendant 30 secondes. Ne touchez pas la surface du tampon, seulement les côtés d'un timbre en PDMS. </li><li> Transfert APTMS solution pour le plasma nettoyé les surfaces de verre: jeu de timbres vers le bas sur une extrémité du côté de motifs et glissent doucement en appuyant sur PDMS ainsi il est complètement en contact avec une surface en verre pendant 1 minute. </li><li> Retirez délicatement PDMS de timbre, et permettre à lame de verre à motifs à incuber en RT pendant 30 minutes. Rincer les surfaces modelées avec de l'éthanol et l'air sec. Soniquer PDMS timbre pour 15 minutes pour enlever l'excès APTMS. </li><li> Surfaces de chaleur dans le four ou sur plaque chauffante pendant 1 heure à 115 ° C. Rincer avec de l'éthanol et sécher à l'air. </li><li> Préparer le polyéthylène glycol frais (PEG)-silane solution de 20% v / v 2 - [méthoxy (polyéthylèneoxy) propyl] triméthoxysilane dans le toluène. Cela servira comme une région non-adhésif entourant les modèles. </li><li> Transfert diapositives verre imprimé d'un plat en verre de Pétri et incuber dans le PEG-silane solution pendant 45 minutes à 75 ° C sur une plaque chauffante. Rincer avec du toluène, l'eau et sécher à l'air. </li><li> Stériliser pendant 1 heure en utilisant irradiation UV germicide dans une enceinte de sécurité biologique. Procéder dans le cabinet de sécurité biologique à partir de ce point en avant pour maintenir la stérilité. </li><li> Préparer une solution aqueuse de HA stérile. 10mm de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 5mM de N-hydroxysuccinimide 50μg / ml marquée à la fluorescéine HA </li><li> Appliquer la solution HA à des substrats de verre à motifs dans des conditions stériles et protégés de la lumière. Des substrats doit être au repos pendant 16-24 heures. </li><li> Aspirer solution HA, laver avec du tampon phosphate salin (PBS), et couvrir la surface avec 1% d'albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS pendant 1 heure. La surface est maintenant prête pour la culture cellulaire. </li></ol> 3. Culture cellulaire sur HA Surfaces Micropatterned <ol><li> Développer MDA-MB-231 cellules humaines de cancer du sein et LS174T cellules carcinome colorectal, selon les instructions du fabricant. </li><li> Suspensions semences cellule unique de cellules cancéreuses avec des densités comprises entre 0,4 et 1x10 2 de surface de verre et sur ​​HA immobilisé surfaces. Incuber dans incubateur humidifié (37 ° C) dans des atmosphères maintenue avec 5% de CO 2. L'adhérence cellulaire doit se produire dans les 24 heures et peut être observé en utilisant un microscope à lumière inversée </li><li> Surfaces de culture cellulaire peut être maintenue jusqu'à 5 jours dans des conditions incubateur standard. Changer les médias tous les jours. La morphologie cellulaire et la croissance peut être observé en utilisant un microscope à lumière inversée. D'autres dosages cellulaires peuvent être appliquées pour analyser les réponses à la surface HA. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: La chimie carbodiimide utilisé pour immobiliser de façon covalente à des diapositives HA APTMS verre imprimé est montré dans la figure 1A. EDC est un agent de réticulation de longueur nulle qui réagit avec HA groupes carboxyle pour former une amine réactive intermédiaires. Comme cet intermédiaire est sensible à l'hydrolyse, le NHS est ajouté pour augmenter l'efficacité de réaction carbodiimide. Comme solution de HA interagit avec micropatterns APTMS, une des formes stables liaison amide entre HA intermédiaires et amine primaire de ATPMS. Un exemple de motifs de surface HA visualisés en utilisant un microscope à fluorescence et une analyse ImageJ intensité de fluorescence de démontrer l'immobilisation motifs de HA sont représentées (figure 1B-C). Les surfaces HA micropatterned permettent l'étude des interactions des cellules cancéreuses avec HA expgenous. Les deux MDA-MB-231 maternel et LS174T humaine lignes cellulaires du cancer du côlon préférentiellement adhérer à HA régions micropatterned (figure 2). Imagerie à haute résolution en utilisant la microscopie électronique à balayage peuvent être utilisés pour analyser les interactions des cellules cultivées avec des surfaces HA immobilisé (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 HA surfaces micropatterned (A) Schéma décrivant le développement des surfaces fonctionnelles HA, (B) image de fluorescence de la fluorescéine (vert)-étiquetées HA micropatterned surface. (C) carte 3D répartition des pixels en utilisant le logiciel ImageJ démontrant les modèles HA discret. Barre d'échelle = 100 microns. Modifié à partir de 9 avec la permission d'Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Adhérence des cellules du cancer sur les surfaces micropatterned HA. Les deux points (A) et du sein (B) le carcinome de préférence collé sur plaques HA avec 24 heures de culture. Modifié à partir de 9 avec la permission d'Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Interactions cellulaires du cancer avec HA. (A) Numérisation d'images de microscopie électronique de cellules du cancer du côlon (A) cultivées sur des surfaces HA montré à faible grossissement (à gauche) et à fort grossissement (à droite; de ​​carrés à gauche) et des cellules du cancer du sein (B) cultivées sur des surfaces HA montré à faible grossissement (à gauche) et à fort grossissement (à droite; de ​​carrés sur la gauche).

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
<li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+%28HA%29+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li>
<li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li>
<li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li>
<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

Figure schématique vidéo reproduit avec la permission; auteur Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. Dickinson LE, S Kusuma, Gerecht S. Reconstruire la niche la différenciation des cellules souches embryonnaires utilisant des biomatériaux. Macromol. Biosci. 2010; le 21 octobre. [Epub ahead of print].

La méthode présentée permet micropatterning HA l&#39;étude des interactions cellulaires avec exogène HA. HA est connue pour jouer un rôle clé dans une progression du cancer mais il ya eu des études limitées étudie l&#39;interaction des cellules de cancer sur deux dimensions surfaces texturées HA. Une étude contrôlables sur micropatterns HA exogène permet la visualisation haute résolution de l&#39;adhérence des cellules cancéreuses, la croissance et la migration et peut élucider les fondamentaux supplémentaire...

<table><tbody><tr><td>Résine photosensible SU-2025</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Développeur SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltriméthoxysilane (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2-[méthoxy(polyéthylèneoxy)propyl]triméthoxysilane (silane PEG)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-Éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Acide hyaluronique marqué à la fluorescéine (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>Reconstituer avec 10 ml d'eau désionisée</td></tr><tr><td>Cellules de carcinome du sein MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Cellules de carcinome colorectal LS174t</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

surfaces micropatterned pour étudier les interactions acide hyaluronique avec les cellules cancéreuses

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

L&#39;invasion et la progression du cancer implique un phénotype cellulaire mobiles, qui est sous réglementation complexe de facteurs de croissance / cytokines et la matrice extracellulaire (ECM) des composants dans le microenvironnement de la tumeur. L&#39;acide hyaluronique (HA) est une composante stromale ECM qui est connue pour faciliter la progression de la tumeur par l&#39;invasion amélioration, la croissance et l&#39;angiogénèse 1. Interaction des HA avec son récepteur cellulaire CD44 de surface induit événements de signalisation qui favorisent la croissance des cellules tumorales, la survie et la migration, augmentant ainsi la dissémination métastatique 2-3. HA est une anioniques, glycosaminoglycane nonsulfated composé d&#39;unités répétitives de l&#39;acide D-glucuronique et de DN-acétylglucosamine. En raison de la présence de groupes carboxyle et hydroxyle sur les unités disaccharide répéter, HA natif est largement hydrophiles et se prêtent à des modifications chimiques qui introduisent des groupes sulfate d&#39;immobilisation photoreative 4-5. Des études précédentes impliquant le immobilisations de HA sur des surfaces d&#39;utiliser le comportement bioresistant de HA et de son dérivé sulfaté de contrôler l&#39;adhésion cellulaire sur des surfaces 6-7. Dans ces études de l&#39;adhésion cellulaire survient préférentiellement sur les régions à motifs non-HA. Pour analyser les interactions cellulaires avec HA exogène, nous avons développé motifs surfaces fonctionnalisées qui permettent une étude contrôlable et la visualisation haute résolution des interactions des cellules cancéreuses avec HA. Nous avons utilisé l&#39;impression par microcontact (RUU) pour définir des motifs discrets régions HA sur les surfaces en verre. Un &quot;tethering&quot; approche qui s&#39;applique la chimie carbodiimide reliant à immobiliser HA a été utilisé 8. Les surfaces vitrées ont été imprimés avec une microcontact aminosilane et réagir avec une solution HA des ratios d&#39;EDC et optimisé afin de permettre l&#39;immobilisation du NHS HA dans des tableaux à motifs. Incorporer la chimie carbodiimide avec MCP a permis l&#39;immobilisation de l&#39;HA à des régions définies, créant des surfaces appropriées pour les applications in vitro. Les deux cellules de cancer du côlon et de cellules du cancer du sein implicitement interagi avec les surfaces micropatterned HA. L&#39;adhésion des cellules du cancer survenu dans les 24 heures avec la prolifération de 48 heures. L&#39;utilisation de surfaces HA micropatterned, nous avons démontré que l&#39;adhésion des cellules du cancer se fait par le CD44 récepteur HA. Par ailleurs, HA surfaces texturées étaient compatibles avec microscopie électronique à balayage (MEB) et a permis d&#39;imagerie haute résolution des protubérances cellulaires du cancer adhésif et répandre sur les habitudes de HA pour analyser la motilité des cellules cancéreuses sur HA exogène.

Une nouvelle approche qui permet l&#39;analyse de la haute résolution des interactions cellulaires du cancer avec l&#39;acide hyaluronique exogène (HA) est décrite. Surfaces texturées sont fabriqués en combinant la chimie carbodiimide et l&#39;impression par microcontact.

Surfaces Micropatterned pour étudier les interactions acide hyaluronique avec les cellules cancéreuses

L'invasion et la progression du cancer impliquent un phénotype cellulaire mobile, lequel fait l'objet d'une régulation complexe par des facteurs de croissance/cytokines et la matrice extracellulaire...

L'invasion et la progression du cancer impliquent un phénotype cellulaire modal, régulé de manière complexe par des facteurs de croissance, des cytokines et des composants de la matrice extracellulaire présents dans le microenvironnement tumoral. L'acide hyaluronique, ou HA, est un composant stromal de la matrice extracellulaire connu pour faciliter la progression tumorale en renforçant l'invasion, la croissance et l'angiogenèse, par l'interaction de l'HA avec son récepteur membranaire. L'interaction de CD44 avec l'HA déclenche des événements de signalisation qui favorisent la croissance, la survie et la migration des cellules tumorales, augmentant ainsi la dissémination métastatique. Étudier l'adhésion, la migration et la croissance des cellules cancéreuses sur de l'HA exogène.La photolithographie standard est utilisée pour fabriquer un tampon élastomère microstructuré, qui permet ensuite de créer un réseau ordonné de molécules d'aminoséline sur des substrats de verre. Ensuite, une chimie de carbodiimide est réalisée afin d'attacher de manière covalente l'acide hyaluronique (HA) aux aminosélines microstructurées. Ainsi, des motifs microscopiques d'acide hyaluronique sont obtenus, sur lesquels des cellules cancéreuses en culture peuvent être ensemencées. Les interactions entre les cellules cancéreuses et l'acide hyaluronique exogène peuvent alors être visualisées par microscopie optique, ou par des techniques d'imagerie haute résolution telles que la microscopie électronique à balayage ou la microscopie immunofluorescente.La méthode de création de surfaces microstructurées en acide hyaluronique présentée dans cet article vidéo peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, comme l'élucidation plus poussée du rôle de l'acide hyaluronique exogène dans la progression du cancer. Pour fabriquer un tampon en polyméthylsiloxane ou en PDMS présentant une microstructure, qui sera utilisé pour imprimer des lames de verre avec de l'HA, commencez par prendre une nouvelle plaquette de silicium à l'aide de pinces.Ensuite, au-dessus de l’évier du laboratoire. Utilisez une bouteille de lavage pour rincer la plaquette avec de l’éthanol et séchez-la avec un courant d’air. Éteignez les lumières de la pièce.Ensuite, à l’aide de pinces, transférez la plaquette vers un spin coater en utilisant une pipette de transfert ; recouvrez au moins 80 % de la surface de la plaquette avec une résine photosensible négative SU 2025, puis appliquez un revêtement par rotation pendant 10 secondes à 600 tr/min. Ensuite, faites-le tourner pendant 30 secondes à 3000 tr/min. Transférez la plaquette recouverte de résine photosensible sur une plaque chauffante et effectuez un pré-cuisson à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Puis retirez-la de la plaque chauffante et laissez-la refroidir pendant une minute.Placer un masque préfabriqué avec le motif souhaité sur la tranche recouverte de photo-résist et d'UV. L'irradier pendant 20 secondes. Ensuite, transférer la tranche sur une plaque chauffante et effectuer une cuisson dure à 110 degrés Celsius pendant six minutes.Allumez les lumières et retirez la plaquette du bloc chauffant. À ce stade, des motifs distincts devraient être visibles à l’aide d’une pipette de transfert. Rincez soigneusement la plaquette avec le révélateur de photo-résine SU eight après trois rinçages avec la solution révélatrice, puis rincez à l’éthanol.Si un résidu blanc est présent, répéter le rinçage avec la solution de développement de photo-résine ou plonger simplement la plaquette dans la solution de développement pendant deux minutes, puis rincer à nouveau avec de l'éthanol, laver à l'eau et sécher à l'aide d'un courant d'air dans un grand bateau en lactosérum. Mélanger la solution d'élastomère PDMS et l'agent de réticulation selon un rapport pondéral de 10 pour 1 ; pour la plaquette illustrée ici, 22 grammes suffisent. Verser dans un tube de centrifugeuse et faire tourner à 900 tr/min pendant cinq minutes.Pour éliminer les bulles d'air, placez la plaquette structurée dans une boîte de Pétri de taille appropriée. Versez suffisamment de solution de PDMS dessus pour recouvrir complètement la plaquette d'une épaisseur d'environ un quart de pouce. S'il y a des bulles présentes à la surface de la plaquette, placez-la dans un dessiccateur sous vide jusqu'à leur disparition.Polymériser toute la nuit à température ambiante pour former un tampon élastomère complémentaire. Si le PDMS n'est pas complètement polymérisé après 12 heures, placer la plaquette dans un four à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Retirer délicatement le PDMS de la plaquette.Ensuite, à l’aide d’un rasoir, découper le tampon à la taille souhaitée. Placer le tampon dans un bain ultrasonore contenant de l’éthanol, de préférence dans un support en plastique, et soumettre à une sonication pendant 15 minutes. Les tranches peuvent être utilisées plusieurs fois pour créer de nouveaux tampons élastomériques afin d’immobiliser covalemment l’ha sur des surfaces de verre en zones définies.Commencez par nettoyer toutes les lames à utiliser dans un nettoyeur à plasma, conformément aux instructions fournies dans le texte accompagnant. Une fois les lames en verre nettoyées, utilisez une pince pour les retirer du nettoyeur à plasma. Placez les lames dans une boîte de Pétri en plastique et mettez-les de côté pour une utilisation ultérieure.Ensuite, préparez la solution d'aminocline à déposer sur la lame de verre pour fixer l'acide hyaluronique dans un tube conique en polystyrène de 15 millilitres. Préparez une solution fraîche à 3 % volume par volume de triméthoxypropylaminosilane, ou A-P-T-M-S, dans de l'éthanol à 95 % volume par volume, pour un volume total de cinq millilitres. Laissez la solution réagir pendant cinq minutes à température ambiante.Pendant cette période, l'A-P-T-M-S est converti par hydrolyse en un ciol. Ensuite, en ne touchant que les côtés, placez le motif du tampon en PDMS vers le haut sur un mandrin de spin coater. Utilisez une pipette de transfert pour recouvrir la surface du motif avec de l'A-P-T-M-S.Ensuite, appliquez par rotation la surface du tampon avec du A-P-T-M-S à 3 500 tr/min pendant 30 secondes. Après avoir retiré le tampon en PDMS du support de rotation et l’avoir inversé de sorte que la face structurée soit orientée vers le bas, placez une extrémité du tampon en PDMS au centre de la lame de verre et appuyez délicatement pour que l’ensemble du tampon adhère à la lame de verre pendant une minute. Ensuite, retirez délicatement le tampon en PDMS et laissez la lame de verre portant le motif de A-P-T-M-S reposer à température ambiante.Après 30 minutes, rincer la surface du motif avec de l'éthanol et sécher à l'aide d'un courant d'air. Soniquer le tampon en PDMS pendant 15 minutes pour éliminer tout excès d'A-P-T-M-S. Puis placer les lames sur une plaque chauffante pendant une heure à 115 degrés Celsius afin de chauffer les surfaces et d'éliminer l'excès d'eau.Rincer à l'éthanol et sécher à l'air à l'aide de pinces. Transférer la lame avec le motif dans une boîte de Pétri en verre. Utiliser une pipette de transfert pour recouvrir complètement la lame de verre par une solution fraîchement préparée de polyéthylène glycol ou de solution de peg cline, qui servira de région non adhésive entourant les motifs.Après une incubation de 45 minutes à 75 degrés Celsius, versez la solution saline excédentaire de PEG. Ensuite, tout en tenant la lame de verre avec des pinces, rincez la surface des lames de verre imprimées avec du toluène, puis à nouveau avec de l'eau, et séchez à l'aide d'un courant d'air. Placez les lames dans une boîte à lames humidifiée.Ensuite, placez la boîte dans une hotte de sécurité biologique et allumez la lampe UV pendant une heure afin d'effectuer une irradiation germicide. Poursuivez les opérations dans la hotte de sécurité biologique à partir de ce moment. Pour maintenir la stérilité à l'extérieur de la hotte, préparez une solution aqueuse stérile d'HA d'un millilitre composée de 10 millimolaire.Un éthyl 3,3-diméthylaminopropylcarbodiimide ou EDC à 5 millimolaire et de l'hydroxysuccinimide à 50 microgrammes par millilitre. Le EDC marqué au fluorescéine stérile est un agent de réticulation de longueur nulle qui réagit avec les groupes carboxyles de l'HA pour former des intermédiaires réactifs avec les amines. Comme cet intermédiaire est sensible à l'hydrolyse, le NHS est ajouté afin d'augmenter l'efficacité de la réaction du carbodiimide.Ensuite, appliquez des aliquotes de 200 microlitres de solution stérile d’acide hyaluronique (HA) sur le verre structuré jusqu’à ce que la zone structurée soit recouverte. Fermez ensuite la boîte à lames afin de protéger les préparations de la lumière. Les substrats structurés doivent être laissés au hotte sans perturbation pendant 16 à 24 heures, le temps que la solution d’HA interagisse avec le motif microscopique : une liaison MI stable se forme entre l’intermédiaire HA et l’amine primaire de l’A-P-T-M-S.Le lendemain, utiliser une pipette Pasteur APA pour aspirer la solution d'acide hyaluronique. Rincer les lames avec du PBS, puis recouvrir la surface de 1 % de BSA dans du PBS pendant une heure. La surface est désormais prête pour la culture cellulaire.Placer les surfaces micropaternisées d'acide hyaluronique dans une boîte de Pétri stérile pour la culture sur des surfaces micropaternisées d'acide hyaluronique. Ensemencer des suspensions monocellulaires de cellules cancéreuses avec des densités comprises entre 0,4 et 1 × 10⁶ cellules cancéreuses par 18,75 cm² de surface de verre dans un millilitre de milieu cellulaire afin de recouvrir la surface de la lame de verre. Placer soigneusement les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone, en prenant soin que le milieu ne déborde pas. L'adhésion cellulaire devrait survenir dans les 24 heures et peut être observée à l'aide d'un microscope optique inversé.Les surfaces de culture cellulaire peuvent être conservées jusqu'à cinq jours. Dans des conditions d'incubateur standard, changez le milieu tous les deux jours. La morphologie et la croissance cellulaire peuvent être observées à l'aide d'un microscope optique inversé.Des essais cellulaires supplémentaires peuvent ensuite être appliqués pour analyser les réponses à la surface de HA dans l'exemple montré ici. Surface de motif HA visualisée à l'aide d'un microscope à fluorescence et d'une image. L'analyse de l'intensité de fluorescence J démontre la déstabilisation du motif de HA.Les surfaces micropaternisées d'HA permettent l'étude des interactions des cellules cancéreuses avec l'HA exogène. L'adhésion des cellules cancéreuses sur les surfaces micropaternisées d'HA est illustrée ici. À la fois les cellules de carcinome du côlon et du sein adhèrent préférentiellement aux zones d'HA après 24 heures de culture. Une imagerie à haute résolution par microscopie électronique à balayage peut être utilisée pour analyser les interactions entre les cellules cultivées et les surfaces immobilisées avec de l'HA.Dans ce micrographie électronique à balayage, on observe l'interaction entre des cellules cancéreuses du côlon et l'acide hyaluronique (HA) ; un grossissement plus élevé est montré à droite. Des cellules de cancer du sein cultivées sur des surfaces à base d'acide hyaluronique (HA) sont présentées ici, avec à nouveau un grossissement plus élevé à droite. Cette analyse démontre clairement la présence de prolongements adhésifs qui favorisent l'expansion des cellules cancéreuses sur les motifs microscopiques d'acide hyaluronique (HA).Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des surfaces microstructurées à l'acide hyaluronique et comment les utiliser pour étudier la réponse des cellules cancéreuses.

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Micropatterns adhésif qui normalisent l'architecture cellulaire peut être utilisé pour augmenter la sensibilité dans la détection des effets des médicaments, améliorer la reproductibilité et de simplifier l'acquisition automatique d'images et d'analyse. Une telle technologie bénéficieront tests de dépistage de drogue / siARN, réalisée sur conventionnelles soutient la culture cellulaire et par conséquent souffrent d'excès de cellule à cellule variabilité.

Amélioration de la visualisation et l&#39;analyse quantitative des effets des drogues utilisant des cellules Micropatterned

Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser verre avec des taches de protéines nanométriques entourées par une bicouche lipidique fluide. Ces substrats sont compatibles avec la microscopie optique de pointe et devraient servir de plate-forme pour les études d'adhésion cellulaire et la migration.

Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches

Une méthode pour obtenir nanopatterns inégale dendrimère-basé qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD) surface densité locale est décrite et appliquée pour l’étude de la différenciation cellulaire adhésion et chondrogéniques.

Nanopatterns inégale dendrimère-basé à localement gouvernes adhésivité : une méthode pour diriger la différenciation chondrogéniques

Cette étude démontre l’utilité et la facilité de la mesure d’extension quantitative de membrane cellulaire et sa corrélation avec la capacité adhésive des cellules. Comme un exemple représentatif, nous montrons ici que Dickkopf-protéine 3 (DKK3) favorise la formation de lobopodia accrue et l’adhérence cellulaire dans le corticosurrénalome cellules in vitro.

Caractérisation des Extensions de la Membrane cellulaire et d’étudier leur rôle dans le Cancer Cell Adhesion dynamique

Nous présentons ici un protocole pour étendus balayage sonde nanolithographie activé par l’alignement itératif de sonde tableaux, ainsi que l’utilisation de modèles lithographiques pour études sur les interactions de surface cellulaire.

Grande surface balayage sonde nanolithographie facilitée par alignement automatisé et son Application à la Fabrication de substrat pour les études de Culture de cellules

Nous présentons ici un protocole pour la culture de cellules de glioblastome dérivé de patient dans les biomatériaux orthogonalement accordable conçu pour imiter la matrice de cerveau en trois dimensions. Cette approche fournit une in vitro, une plate-forme expérimentale qui conserve plusieurs caractéristiques de in vivo glioblastoma cellules généralement perdus dans la culture.

L’acide hyaluronique basée Hydrogels pour 3-Dimensional Culture de cellules de glioblastome dérivé de Patient

Une plaque d’imagerie basée sur HMCA est présentée pour la performance de série invasion. Cette plaque facilite la formation des sphéroïdes en trois dimensions (3D) tumeur et la mesure de l’invasion des cellules du cancer dans la matrice extracellulaire (ECM). La quantification de dosage d’invasion est obtenue par analyse semi-automatique.

Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

Le composant de complément C1q est une molécule pro-inflammatoire fortement exprimée dans le microenvironnement de tissu qui peut interagir avec la matrice extracellulaire. Ici, nous décrivons une méthode pour tester comment C1q lié à l'acide hyaluronique affecte l'adhérence cellulaire.

Évaluation de l'interaction entre le complément protéique C1q et l'acide hyaluronique dans la promotion de l'adhérence cellulaire

La lithographie quasi UV et la microscopie à force de traction sont combinées pour mesurer les forces cellulaires sur des hydrogels à micromotifs. La libération ciblée de cellules individuelles induite par la lumière permet un grand nombre de mesures sur le même échantillon.

Contrôle de l’adhérence des cellules à l’aide de techniques de modelage d’hydrogel pour des applications en microscopie à force de traction

Nous décrivons les améliorations apportées à une méthode standard de mesure des forces de traction cellulaire, basée sur l’impression par microcontact avec une seule étape de motif soustractif de réseaux de points de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels mous. Cette méthode permet une fabrication plus simple et plus cohérente de motifs d’îlots, essentiels pour contrôler la forme des amas de cellules.

Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs

Nous présentons une méthode de réplication du microenvironnement tumoral du gliome sur le front invasif qui intègre le flux de liquide interstitiel. Ce modèle est un hydrogel hyaluronane-collagène I dans un insert de culture tissulaire où une tête de pression de fluide peut être appliquée. L’invasion peut être quantifiée et les cellules peuvent être isolées ou lysées.

Un modèle photopolymérisable d’acide hyaluronique-collagène du microenvironnement invasif du gliome avec flux interstitiel

Découvrez la fabrication de surfaces micropatternées pour étudier les interactions entre l'acide hyaluronique et les cellules cancéreuses. Cette méthode par photolithographie permet de visualiser l'adhésion et la migration cellulaire.

Surfaces Micropatterned pour étudier les interactions acide hyaluronique avec les cellules cancéreuses

Explorer plus de vidéos