La stimulation mécanique des cellules souches en utilisant cyclique uniaxiale souche

Bonjour, je suis Song Li. Je suis professeur adjoint au Département de génie biologique de l'université de Californie à Berkeley. Et je suis Kyle Kapinsky. Je suis candidat au doctorat également en génie biologique à l'université de Californie à Berkeley.

Aujourd'hui, nous allons présenter un protocole de stimulation mécanique de cellules souches par une déformation cyclique uniaxiale. Les recherches menées dans notre laboratoire portent sur l'ingénierie cellulaire et tissulaire, en particulier dans le système cardiovasculaire. Nous nous intéressons à la biologie mécanique des cellules souches en raison de plusieurs applications potentielles.

La première est que nous souhaitons comprendre l'effet des facteurs mécaniques sur le développement, par exemple, le développement embryonnaire. La deuxième est que nous nous intéressons au contrôle de la différenciation des cellules souches in vitro ou dans un réactif intestinal. Et troisièmement, nous nous intéressons à la manière dont les cellules souches réagissent aux facteurs mécaniques cardiovasculaires in vivo, par exemple après une transplantation.

Afin d'étudier tous ces aspects, nous disposons d'un bioréacteur sur mesure dans lequel nous pouvons ensemencer des cellules sur des membranes élastiques, puis étirer ces membranes de manière contrôlée pendant une durée définie, avec une déformation définie et une vitesse de déformation définie. Nous allons maintenant vous guider à travers toutes les étapes nécessaires à la mise en place de ce protocole. À l'aide d'un savon de laboratoire, n'importe quel détergent convient, appliquez du savon sur les deux faces de la membrane et frottez soigneusement afin d'éliminer tout débris éventuellement présent sur la membrane. Tout élément susceptible d'interférer avec les cellules doit être retiré.

Et je fais cela manuellement. Ensuite, une fois que j'estime avoir bien nettoyé les deux côtés, je rince à l'eau une dernière fois. Puis, à partir de là, je veux m'assurer qu'il est bien stérile et que tous les micro-particules ont été éliminés.

Je vais donc prendre cette membrane et la placer dans un bécher contenant de l'alcool à 70 %. Laissez complètement pénétrer le liquide. Ensuite, vous pouvez prendre le bécher en entier et le placer dans un bain à ultrasons pour une durée de 10 minutes.

À présent que nous avons placé la membrane micropaternée dans une boîte carrée, nous voulons vérifier que le côté du motif est bien orienté vers nous. Je vais donc prendre un flacon pulvérisateur contenant de l’alcool et vaporiser légèrement la face supérieure de cette membrane. Vous pouvez maintenant observer le liquide qui s’écoule et révèle ces sillons.

Donc, cela confirme que le côté du motif est orienté vers le haut et qu’il est correctement positionné. Nous avons maintenant effectué l’étape d’irradiation UV de nuit, et vous pouvez voir que toutes les chambres, tous les bâti des chambres ainsi que les membranes elles-mêmes se trouvent dans la hotte, où elles ont passé la nuit sous UV. Il s’agit de notre étape finale de stérilisation.

Alors, ce que je souhaite faire maintenant est de traiter au plasma toutes les membranes, et je vais en sortir une ou deux à la fois, que je garderai dans leurs boîtes stériles pour les transporter vers l'appareil à plasma. Maintenant que la pression sous vide est relâchée, je peux retirer la chambre. Là encore, cette manipulation n'est pas complètement stérile, mais je vais la réutiliser par la suite.

Travaillez donc relativement rapidement afin que le plasma reste en place, vous devez utiliser une pince. Et encore une fois, ceci est très important. Assurez-vous de ne pas laisser tomber la membrane ni d'en modifier l'orientation.

Donc, pour l'instant, seule la surface supérieure a été traitée au plasma, et je vais la remettre dans ma boîte relativement stérile, côté plasma vers le haut, remettre le couvercle en place, puis la transporter sous la hotte. Maintenant que la membrane a été traitée au plasma, je vais la remettre sous la hotte et la traiter avec de la gélatine à 2 %, en poids par volume.

On observe que la solution continue de s'écouler selon le motif. Elle est également très hydrophile, car elle a subi un traitement au plasma. La solution s'étale donc au lieu de former des gouttelettes ; si vous retournez accidentellement la membrane, la solution remonterait immédiatement et vous sauriez ainsi que vous travaillez sur le mauvais côté.

Veillez donc à ce que la solution s'étale uniformément. Une fois que vous avez effectué cette opération pour toutes vos membranes, fermez simplement la hotte et allumez le rayonnement UV pendant 30 minutes. À ce stade, la membrane a été exposée aux UV avec de la gélatine déposée à sa surface pendant une demi-heure, ce qui est suffisant pour permettre l'absorption de la gélatine par la surface.

À ce stade, je souhaite rincer la membrane deux fois avec du PBS stérile et j'ajoute généralement environ 10 ml dans une boîte carrée, puis je rince délicatement à l’aide de la main, en évitant de toucher la surface de la membrane, avant d’aspirer le PBS. Je répète cette opération une fois de plus, puis après le deuxième rinçage, je laisse la membrane dans le PBS, ce qui aide à la lubrifier et facilite son assemblage dans la chambre. Si vous laissez la membrane sèche, elle risque davantage de se déchirer ou de se briser d’une manière ou d’une autre.

Voici donc le deuxième lavage. Aspirez à nouveau une fois pour vous assurer que toute la gélatine a été retirée de la membrane. Ensuite, laissez votre membrane dans environ 10 millilitres de PBS stérile.

Et si vous travaillez avec plusieurs membranes, répétez ce processus pour chacune d’elles. Ensuite, vous serez prêts pour le montage. Prenez un des cadres, qui se compose en fait de deux pièces, mais qui sont généralement préassemblées.

Ainsi, l'une des pièces est la pièce en T ici, et l'autre pièce fait partie du cadre, qui va maintenir la membrane elle-même. Il existe donc une deuxième pièce du cadre qui ressemble à ceci. Et vous pouvez voir qu'elle possède une rainure.

C'est là que le joint sera inséré pour maintenir la membrane en place. La seconde pièce présente une deuxième rainure destinée à un autre joint, de manière à maintenir les deux côtés de la membrane. En prenant cette pièce, placez-la sur le cadre comme ceci, retournez le cadre et saisissez l'une des vis d'autoclave.

Insérez la vis dans la partie supérieure ; vous pouvez la serrer légèrement à la main au départ, puis utilisez l'une des clés hexagonales pour la serrer complètement. À ce stade, j'ai un cadre assemblé et la membrane sera placée sur le dessous de cette manière, comme si ma main était la membrane. Cela signifie que je veux le côté qui est soit structuré, soit traité au plasma et au gélatine.

Je veux que cela soit orienté vers le haut de cette manière. Donc, si je le retourne accidentellement et que le côté avec la gélatine est maintenant vers le bas, cela posera un problème majeur pour l'expérience. Ainsi, lorsque je l'assemble, je veux que le côté avec le motif soit orienté vers le haut, mais j'effectuerai l'assemblage à l'envers.

Donc, lorsque je sors la membrane, assurez-vous que le côté du motif soit orienté vers le bas. En prenant une membrane, souvenez-vous que le côté du motif est actuellement vers le haut. Je la sors du PBS et je la dispose sur le cadre comme ceci.

Ainsi, les deux côtés sont actuellement à peu près équivalents. Il est acceptable de toucher les bords de la membrane avec les doigts, mais évitez de toucher le côté opposé. Maintenant que je l'ai retournée de cette manière, le côté du motif est désormais orienté vers le bas, ce qui facilite l'assemblage. Prenez deux joints et placez-les dans le PBS.

Je le fais généralement rouler d'avant en arrière. J'humidifie donc tout le joint, ce qui lubrifie le joint de la même manière que j'ai lubrifié la membrane dans le PBS. Si vous utilisez des joints secs sur une membrane sèche, il est beaucoup plus probable que quelque chose va se déplacer.

La méthode que j'utilise consiste à tirer légèrement plus d'un côté que de l'autre, car lors de l'insertion du joint, si j'insère le joint de ce côté, il va entraîner la membrane dans ce sens, et ce côté deviendra alors un peu plus court. Commencez donc avec une extrémité légèrement raccourcie ici. Prenez un joint, placez-le en travers de manière à ce qu'il soit bien équitable des deux côtés.

Et en exerçant une pression uniforme, appuyez fermement, utilisez vos pouces ou les extrémités de vos pouces, mais pas vos ongles, car vous risqueriez de couper accidentellement la membrane et de la déchirer. Une fois l’insertion effectuée, je prends l’arrière de ma pince et m’en sers pour appuyer vers le bas. Soyez encore une fois prudent pour ne pas appuyer trop fort ni glisser et toucher la membrane, car vous pourriez la couper ou la déchirer accidentellement à ce stade, auquel cas vous devriez remplacer la membrane et recommencer depuis le début.

Donc, un côté est maintenant inséré, mais l'autre côté est encore lâche. Retournez l'ensemble, prenez le deuxième joint, assurez-vous qu'il est humide et placez-le par-dessus, exactement comme précédemment. Ensuite, j'utilise généralement la pince pour saisir effectivement la membrane et la tendre légèrement, car si elle est trop lâche, il y aura trop de jeu dans la membrane et il sera impossible d'observer les cellules.

Vous souhaitez donc que ce soit tendu, mais pas excessivement, afin qu’il ne soit pas étiré. S’il est pré-étiré, cela affectera l’expérience, car la membrane est déjà sous tension et vous risquez de la déchirer. Vous ajouterez une légère tension en appuyant sur le joint. À ce stade, cela semble assez tendu.

Il est peut-être un peu lâche d'un côté, mais je vais corriger cela dans un instant. Ensuite, à nouveau, en exerçant une pression relativement uniforme, appuyez simplement avec les bouts de vos pouces ou de vos doigts. À ce stade, vous pouvez constater qu'un côté est assez tendu.

Il est droit sur toute la largeur du côté opposé. Il y a un petit jeu dans la membrane à cet endroit, ce qui fait qu'elle se recourbe légèrement. Ce que je vais donc faire, c'est enfoncer complètement ce côté, comme précédemment, lentement et uniformément sur toute la longueur du joint.

Et vous pouvez constater que cela a éliminé la majeure partie du jeu. Nous venons donc de terminer les 30 minutes d'UV des côtés arrière des cadres et des membranes, et maintenant nous devons retourner toutes les membranes afin qu'elles soient exposées aux UV sur leur côté avant, de sorte que tout soit complètement stérile. À ce stade, nous allons également désigner certains compartiments comme étant soumis à une tension ou servant de témoins.

Vous pouvez donc voir que j'ai déjà étiqueté mes chambres en indiquant contrôle d'étirement, contrôle d'étirement. Et les chambres d'étirement nécessitent une vis supplémentaire. J'ai donc placé la vis supplémentaire pour la chambre d'étirement sur le dessus de la face inférieure du couvercle ici.

Prenez simplement le cadre et retournez-le. Et s’il s’agit d’une chambre d’étirement, cela signifie que je dois remplacer quelques vis. Si c’est une chambre témoin, tout reste identique.

Et lorsque cette barre se déplace d'avant en arrière, la membrane elle-même n'est pas étirée, elle se déplace simplement avec la barre. Si je veux que la membrane s'étire, je dois fixer la seconde partie du cadre à cette extrémité sur le fond de la chambre afin qu'elle reste immobile. Ensuite, lorsque la barre se déplacera uniquement à cette partie du cadre, elle oscillera d'avant en arrière.

Pour ce faire, prenez la vis supplémentaire et insérez-la dans le trou fileté de cette partie du cadre. Utilisez la clé hexagonale et serrez la vis. Ne serrez pas trop, car ces chambres en poly-sulfone sont un peu fragiles ; vous risqueriez de fissurer une chambre. Serrez simplement suffisamment pour que cette partie du cadre ne puisse pas bouger.

Une fois la première vis en place, vous pouvez dévisser cette vis, qui maintenait les deux parties du cadre ensemble, et faites attention à ne pas laisser tomber la vis sur la membrane, car cela pourrait endommager une partie de la gélatine que vous y avez semée. Une fois que la vis est suffisamment desserrée, retirez le tournevis hexagonal, saisissez la vis avec la pince et placez-la dans le deuxième trou de vis. Utilisez ensuite à nouveau le tournevis hexagonal pour serrer la deuxième vis.

Une fois que cette partie du cadre est fixée avec les deux vis, j'obtiens une chambre configurée pour l'étirement. Ainsi, lorsque cette barre se déplace d'avant en arrière dans la machine d'étirement, on peut observer que la membrane elle-même s'étire effectivement. J'aime faire cela plusieurs fois pour m'assurer qu'il n'y a aucun problème avec ma membrane.

S'il y a une fissure pour une raison quelconque, puis que la membrane se déchire, je le saurai avant le début de l'expérience et je pourrai insérer une membrane différente. Vous déplacez donc celle-ci sur le côté, prenez la suivante, et dans ce cas, elle est étiquetée comme une chambre témoin. Ainsi, pour la chambre témoin, tout ce que j'ai à faire est de la retourner.

Maintenant, lorsqu’il est placé dans la machine, il se déplacera d’avant en arrière sans s’étirer. Répétez ensuite le processus pour le nombre de chambres et de membranes que vous avez. Chacune d’elles étant soit un témoin d’étirement, refermez le capot et exposez les faces supérieures des membranes à la lumière UV pendant 30 minutes.

Nous venons donc de désinfecter par UV toutes les chambres ainsi que les côtés supérieurs des cadres des membranes pendant 30 minutes. Tout est maintenant stérilisé et correctement assemblé, et nous sommes prêts à ensemencer les cellules. Dans ce cas précis, j'ensemence des cellules souches mésenchymateuses que je prélève à partir de boîtes de 10 centimètres de diamètre.

Ainsi, pour chaque membrane, surtout si j'utilise une membrane avec motif comme dans ce cas, vous pouvez semer approximativement dans la zone carrée où se trouve le motif. Je souhaite semer uniquement sur cette zone structurée. Si vous utilisez une membrane sans motif, vous devez tout de même semer dans une zone à peu près identique, afin d'éviter que le liquide ne s'approche trop des bords.

Si le liquide est trop près des bords, il peut déborder et alors vos cellules mourront avant que vous ne puissiez vraiment les semer. Et dans la zone où vous effectuez le semis, vous devez déposer la quantité appropriée de cellules. Ainsi, lorsque je réalise l'expérience, je souhaite que cette zone soit assez confluente.

Donc, si j'utilise une boîte de 10 centimètres, je veux environ un tiers de plaque confluente sur cette surface. Dans ce cas, pour les cellules souches mésenchymateuses, cela représente environ 250 000 cellules. Cette valeur variera selon le type cellulaire utilisé.

J'ai déjà détaché mes cellules de la plaque et je les ai resuspendues dans le volume approprié. Je souhaite déposer un millilitre de solution cellulaire sur chaque membrane. Dans ce cas précis, j'ai environ 250 000 cellules souches mésenchymateuses par millilitre de solution.

Donc, j'utilise un P1000 et je m'assure que la solution est bien homogénéisée. Je pipette plusieurs fois vers le haut et vers le bas, puis je prélève un millilitre dans la pipette, et je veux m'assurer de semer uniquement sur cette zone. J'effectue donc le semis très lentement en utilisant de petites gouttes sur la zone structurée.

Et vous pouvez effectivement observer que, parce qu'il s'agit d'un motif, cela forme de petits ovales dans cette direction, car il détecte réellement ces sillons. Ils ne forment donc pas des cercles complets. Dans ce cas, ils ont davantage une forme ovale.

Ensuite, j'observe toute cette zone, sans toutefois m'approcher trop près des bords pour l'instant. Je ne veux pas aller trop loin et vider complètement ma pipette de sa solution. Puis, j'utilise la pipette pour répartir effectivement la solution près des bords, en essayant de ne pas déborder.

Je ne veux aucune cellule sur la zone non traitée, et il est un peu difficile d'atteindre le bord le plus proche de vous. Normalement, je fais donc pivoter soigneusement ceci pour traiter le dernier bord. Cela devrait répartir les cellules de manière assez uniforme.

Et maintenant, ils sont tous en place. Mais vous devez faire attention à ne pas renverser les cellules. Veillez donc à ne pas passer la main au-dessus et à ne pas bouger trop rapidement.

Ensuite, je l'écarte pour ne plus être gêné. Je veux recouvrir le tout et simplement déposer les cellules ensemencées par-dessus. Pour cela, vous utilisez ce couvercle, qui comporte en réalité deux orifices différents.

Il y a un trou plus profond de ce côté et un autre plus peu profond de ce côté-ci, qui permet l'entrée des gaz. Vous devez vous assurer que le trou le plus profond s'aligne avec cette partie en T ici. Sinon, ce sera trop serré si vous utilisez le trou peu profond.

En la plaçant ainsi, cela recouvrira entièrement la chambre. Ensuite, vous devez répéter le processus avec toutes vos chambres restantes, puis laisser reposer l'ensemble dans la hotte pendant 30 minutes afin que les cellules se déposent au fond et commencent à s'attacher aux membranes. Après cela, nous allons fixer toutes les chambres avec du ruban adhésif et les transférer dans la hotte ou dans l'incubateur pour qu'elles reposent encore une heure et s'attachent complètement aux membranes.

D'accord, nous venons de terminer la phase durant laquelle les cellules ont été laissées au repos sur les membranes pendant une demi-heure. Maintenant, je souhaite exposer les cellules à une température de 37 degrés et à une atmosphère contenant 5 % de CO2, conditions assurées par l'incubateur lui-même. Je dois donc transférer les échantillons de la hotte à l'incubateur.

Pour ce faire, vous devez simplement être extrêmement prudent et ne pas incliner les chambres dans une quelconque direction, sinon la solution cellulaire pourrait glisser. Dans ce cas, vous devrez fondamentalement recommencer depuis le début. À présent que les cellules ont passé une heure dans la chambre de l’incubateur, elles sont fermement fixées à la surface.

À ce stade, j'ai retiré la chambre de l'incubateur et je l'ai replacée soigneusement dans la hotte, en la transportant très prudemment, comme précédemment, afin de ne pas renverser de milieu sur la membrane. Vous devez ajouter 20 mils de milieu dans la chambre d'étirement.

Et dans ce cas, j'utilise une combinaison spéciale de milieu car il est légèrement sensible à la contamination ; il est parfaitement conçu pour empêcher toute contamination. J'utilise du DM plus 10 % de FBS, plus 1 % de pénicilline, de streptomycine, puis un supplément de 1 % de fungizone afin d'éviter la prolifération de champignons. En prenant 20 mL de milieu, je vais soigneusement les ajouter dans la chambre d'étirement.

Nous pouvons constater que le milieu n'est pas tombé en dehors de la membrane elle-même et a été ajouté à l'extrémité de la chambre ici, de sorte que le milieu passe d'abord sous la membrane, puis au-dessus de sa surface. Procédez lentement afin de ne pas perturber complètement les cellules. Ensuite, refermez soigneusement et mettez fermement le couvercle en place.

À ce stade, vous n'avez plus à vous soucier de perturber les cellules ni de les laisser se détacher de la membrane. Vous pouvez donc manipuler l'échantillon avec un peu moins de précaution. Vous devez choisir la quantité appropriée de contrainte.

Et le fonctionnement de cette machine repose sur une roue tournante à laquelle est fixé un bras, et ce bras peut modifier sa longueur selon l'insertion de la pièce préfabriquée que vous placez au centre de la roue. Ainsi, lorsqu'elle tourne, le bras effectue un mouvement d'aller-retour, ce qui entraîne un déplacement similaire de cette plateforme. Les chambres sont fixées à celle-ci.

Ils se déplacent donc eux aussi alternativement en avant et en arrière. Ainsi, si je souhaite appliquer une déformation de 5 %, j’utilise une pièce préfabriquée portant l’inscription « cinq », qui correspond à une longueur prédéterminée et calculée à l’avance afin de positionner correctement le bras. J’insère donc cette pièce au centre de la roue, puis j’attache le bras, je m’assure qu’il est bien en place, et je serre le tout à l’aide de la clé hexagonale pour assurer le fixation finale.

Une fois que tout est mis en place, il se trouve en position zéro, le tout étant verrouillé. Nous sommes maintenant prêts à installer les chambres. Ce sont les chambres que je viens de transporter.

Elles ont les cellules en haut, placez-la soigneusement en position unique et assurez-vous que la barre s'enclenche en place. Vous devez vous assurer qu'elle est poussée dans ce sens afin qu'elle soit verrouillée en position zéro. Ne la poussez pas complètement vers l'arrière, sinon vous risquez de pré-entraîner la membrane.

Ensuite, fixez-le en place à l’aide de cet élément de fixation pour qu’il ne bouge pas. Puis, vous actionnez l’interrupteur pour le mettre en marche. Vous pouvez observer qu’il y a eu un léger sursaut au départ.

Parfois, cela arrive, cela coince, mais ensuite cela repart généralement assez facilement. Et toutes les barres bougent désormais d'avant en arrière à 60 cycles par seconde. Ici, en bas, cela indique 600.

Cela devrait en fait être 60,0. Et vous pouvez modifier la fréquence si vous le souhaitez. Une fois que les cellules ont effectivement été soumises à un stress mécanique dans votre système, nous le faisons généralement pendant environ deux à cinq jours, mais vous pouvez le faire pendant une durée plus courte ou plus longue si vous le désirez.

Une fois que vous avez terminé et que vous avez un point final défini, vous pouvez retirer les chambres, puis utiliser les cellules présentes sur ces membranes pour étudier divers aspects. Ce que nous faisons habituellement consiste à utiliser plusieurs techniques, notamment la microanalyse par électrophorèse sur gel 2D. Nous analysons également l'expression génique par PCR ou le dosage des protéines par immunotransfert.

En plus de simplement lyser les cellules, vous pouvez également les colorer directement sur la membrane afin de rechercher par exemple une immunofluorescence de protéines spécifiques, ou bien vous pouvez même libérer les cellules de la membrane, puis les colorer et les faire passer dans un cytomètre en flux. Il existe donc de nombreuses possibilités différentes, de nombreux éléments différents que vous pouvez analyser. Et bien sûr, il existe également différentes variantes de l'appareil, si vous souhaitez utiliser des membranes à motifs microscopiques de types différents ou simplement des matériaux, des revêtements variés, toutes sortes de modifications que vous pouvez apporter à cette méthode.