Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la fabrication et le fonctionnement d'un dispositif microfluidique qui recrée in vitro des microenvironnements tumoraux et peut être utilisé pour tester des médicaments chimiothérapeutiques. Voici le dispositif microfluidique. Ce dispositif peut s'avérer utile dans les domaines suivants : tests simples de médicaments chimiothérapeutiques in vitro.

Il fournit des résultats cohérents et précis pour tester les tissus tumoraux tridimensionnels, et ce dispositif offre une représentation très fidèle de la tumeur in vivo. Les tumeurs existent dans des microenvironnements tridimensionnels, et la possibilité de les tester dans un tel environnement est significative. La première étape de la procédure consiste à assembler le dispositif, ce qui implique la fabrication d'une puce microfluidique par lithographie douce, le perçage de trous aux entrées et sorties, l'assemblage sur une lame de verre et la connexion de tubulures pour l'entrée et la sortie du flux.

Ensuite, les stéroïdes tumoraux multicellulaires uniformes sont générés pour être utilisés dans le dispositif à l'aide de la méthode de la goutte pendante. Les sphéroïdes sont alors introduits dans le dispositif, suivis d'agents de détection de l'apoptose et de médicaments chimiothérapeutiques. Enfin, une microscopie en temps différé est réalisée, puis une estimation mathématique des coefficients de diffusivité des médicaments permet de quantifier la capacité de pénétration de l'agent chimiothérapeutique.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la croissance tissulaire dans le dispositif, la formation de microenvironnements hétérogènes au sein du tissu et la diffusion du médicament dans le tissu grâce à l'utilisation de la microscopie à fluorescence en temps réel. La pénétration limitée des médicaments anticancéreux dans les tumeurs solides est une cause importante de leur échec. La plupart des modèles actuels de test des médicaments anticancéreux ne reproduisent pas la nature tridimensionnelle des tumeurs solides.

Nous avons mis au point un dispositif microfluidique composé de tissus tumoraux tridimensionnels perfusés en continu. Ce modèle représente de manière plus précise l'administration de médicaments aux tumeurs solides et leur élimination systémique. Les stéroïdes tumoraux multicellulaires constituent un modèle bien établi de tissus tumoraux tridimensionnels.

Dans cette procédure, la méthode de la goutte pendante est utilisée pour créer des sphéroïdes destinés à être utilisés dans le dispositif microfluidique. Cette méthode permet la formation de sphéroïdes homogènes en un court laps de temps. L'essai de médicaments chimiothérapeutiques in vitro sur des tissus tridimensionnels peut aider à sélectionner les médicaments de manière plus efficace par rapport aux monocouches de cellules.

Mélangez le PDMS et l'agent de réticulation provenant de l'élastomère de silicone selon un rapport pondéral de neuf pour un. Versez ensuite ce mélange sur le modèle maître afin d'obtenir une couche de caoutchouc de quatre millimètres d'épaisseur. Pour éliminer les bulles d'air, laissez durcir à 60 degrés Celsius pendant cinq heures.

Détachez le PDMS durci du moule pour obtenir un tampon présentant les motifs de flux sur l'élastomère. Ensuite, à l'aide d'un poinçon de biopsie d'un millimètre et demi monté sur une perceuse, percez des trous pour les entrées et les sorties. Retirez tout débris.

Soumettez le côté motif du tampon et une lame de verre propre à un plasma d'oxygène pendant huit minutes. Dans un graveur à plasma d'oxygène, mettez immédiatement en contact les surfaces traitées afin de former une liaison entre elles. Maintenez l'assemblage à 60 degrés Celsius sur un réchauffeur de lames pendant au moins cinq heures.

Pour renforcer la liaison, connectez un tube en PTFE de 0,032 pouces de diamètre interne aux entrées et sorties du dispositif microfluidique. À l’aide d’une interface composée de raccords mâles à visserie fixe attachés à des raccords femelles à emboîtement, ces raccords spécifiques permettent de faire passer facilement les tubes sans les rompre. Enfin, configurez l’assemblage d’écoulement à l’aide de vannes d’arrêt et d’un raccord en Y, puis fixez le dispositif sur le microscope. Après avoir monté le dispositif, reliez les tubes aux entrées et sorties appropriées pour finaliser la configuration d’écoulement.

Comme illustré sur cette figure, cette configuration permet facilement et de manière polyvalente d'insérer un sphéroïde dans le dispositif ou de créer un flux de milieu à travers le dispositif pour l'insertion. Ouvrez la vanne d'entrée d'insertion VPN et la vanne de sortie d'insertion VP pour une tumeur. L'OID peut alors passer par l'entrée et s'écouler dans la chambre de culture, où le poteau présent dans cette chambre maintiendra la tumeur en place pendant le passage du milieu.

Fermez les vannes de remplissage et ouvrez la vanne d'entrée d'écoulement VF in et la vanne de sortie d'écoulement VF out pour initier la formation de PHE uniformes. À l’aide de la méthode de la goutte pendante, traitez les cellules au trypsine sur glace sous hotte de culture. Récupérez les cellules au trypsine obtenues à partir de la centrifugeuse.

Diluez la solution mère à une concentration souhaitée en vous référant au tableau un. Ensuite, retirez le couvercle d'une plaque de 48 puits et placez-le à l'envers. Dans une hotte stérile, remplissez chaque puits de la plaque avec un millilitre d'eau stérilisée.

Pour maintenir l'humidité, déposez une goutte de 20 microlitres de solution cellulaire diluée dans chaque région circulaire du couvercle. À l’aide d’une micropipette, retournez délicatement le couvercle et placez-le au-dessus de la plaque, en veillant à ce que les gouttes ne touchent pas les bords des puits. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius.

Se référer au tableau un pour la durée de l'incubation selon le type de cellule utilisé, un stéroïde se formera dans chaque goutte suspendue. Commencer par stériliser l'appareil en le rinçant avec de l'éthanol à 70 % par l'entrée d'écoulement. Suivre par un rinçage successif au PBS, puis au milieu de culture cellulaire tamponné au H-E-P-E-S.

Laissez la seringue moyenne, fixez-la au tube. Ensuite, aspirez deux à trois stéroïdes dans le robinet de la seringue. Pour éliminer les bulles d'air, reliez la seringue à l'entrée de remplissage du dispositif.

Ouvrez la vanne d'entrée VPN et fermez VFN, ouvrez la vanne de sortie VP out et fermez VF out. Tenez la seringue de remplissage verticalement, avec l'aiguille orientée vers le bas. Observez le stéroïde qui s'accumule au fond de la seringue, dans le raccord fileté de l'aiguille.

Poussez le piston de la seringue de conditionnement et observez l'entrée du PHE dans le tube et son écoulement vers le dispositif, car seule la vanne de sortie de conditionnement est ouverte. Un stéroïde pénètre dans la chambre du dispositif et est retenu par des piliers situés à l'arrière. Une fois à l'intérieur de la chambre, le sphéroïde S s'adapte à la forme de la chambre et acquiert une géométrie rectangulaire.

Fermer la vanne d'entrée VPN et la vanne de sortie VP, puis monter la seringue de flux SF sur la pompe à seringue. Cette pompe est commandée par un ordinateur à l'aide du logiciel Syringe Pump Pro ; ouvrir la vanne d'entrée VFN et la vanne de sortie VF. Démarrer l'écoulement du milieu dans le dispositif à raison de trois microlitres par minute.

L'incubation des sphéroïdes pendant 24 heures est suivie par l'ajout d'agents de détection de l'apoptose. Avant d'ajouter des agents de détection de l'apoptose ou des agents thérapeutiques, laisser les sphéroïdes atteindre l'équilibre jusqu'à 24 heures afin d'établir des gradients de nutriments et des microenvironnements. Ensuite, fermer la vanne VFN.

Arrêtez la pompe à seringue. Retirez la seringue de la pompe et remplacez-la par la seringue contenant le milieu avec 0,25 microlitre par millilitre de marqueur Caspase trois actif CASP glow red. Lavez le dispositif avec la solution en rinçant manuellement 0,7 millilitre de celle-ci à travers le dispositif.

Ensuite, fixez la seringue sur la pompe. Redémarrez le débit et ouvrez le robinet VFN. Pendant une période de cinq à huit heures, l'agent actif rouge CPH de la phase trois s'infusera dans le tissu et fluorescera plus intensément dans les régions apoptotiques. L'agent de détection de l'apoptose est maintenu à cette concentration dans toutes les solutions de flux ultérieures.

La doxorubicine est introduite cinq à huit heures après l'ajout des agents de détection de l'apoptose. Ce traitement est éliminé du système par rinçage. Pour ajouter des agents chimiothérapeutiques, suivez la procédure de détection de l'apoptose afin d'introduire 10 micromolaire de chlorhydrate de doxorubicine.

Remplacez ensuite la seringue de traitement par celle contenant 0,7 millilitre de milieu. Poursuivez l'écoulement de l'agent thérapeutique pendant une période fixe. Fermez ensuite le robinet VFN et arrêtez la pompe à seringue.

Retirer la seringue de traitement de la pompe à seringue et la remplacer par une seringue contenant 0,7 millilitre de milieu. Laisser circuler du milieu frais pendant 24 à 36 heures tout en surveillant continuellement le tissu au microscope. L'ensemble du processus d'acquisition pour la microscopie en temps réel a été automatisé à l'aide d'un script personnalisé dans IP Lab, acquérant toutes les 30 minutes des images en lumière transmise et en fluorescence du PAX Foid à un grossissement de 10 x. Pour l'estimation mathématique des coefficients de diffusivité du médicament, la première étape consiste à générer des profils d'intensité linéaires moyens de la fluorescence de Docs à l'aide d'ImageJ. Sélectionner une région d'intérêt rectangulaire, ou ROI, englobant le tissu dans la chambre.

Utilisez la commande de profil de tracé pour générer un profil d'intensités moyennes en fonction de la distance par rapport au canal d'écoulement. Répétez cette opération pour jusqu'à trois points temporels différents. Ensuite, soustrayez l'intensité moyenne de fluorescence de fond des profils d'intensité obtenus et normalisez chaque profil en utilisant l'intensité maximale correspondante afin d'obtenir C en fonction de X et T. Où C représente la concentration normalisée de doxorubicine, la valeur de C variant de zéro à un.

L'étape suivante consiste à évaluer le coefficient de diffusion effectif des docs dans le tissu tumoral docs. La diffusion peut être représentée par l'équation suivante, où ERFC est la fonction d'erreur complémentaire. X est la distance dans le tissu à partir du canal, et T est le temps écoulé après l'administration de la doxorubicine.

Utilisez le schéma itératif suivant à chaque instant considéré. Proposez une valeur pour D. Calculez le membre de droite de l'équation à chaque emplacement. X. Calculez la somme des carrés des erreurs entre les deux membres, puis modifiez D afin de minimiser la moyenne des résidus.

Les valeurs optimales de D obtenues à chaque point temporel permettent d'estimer le coefficient de diffusion effectif moyen de la doxorubicine dans le tissu. Les dispositifs microfluidiques offrent des chambres de culture optiquement accessibles d'un millimètre sur 0,3 millimètre sur 0,15 millimètre pour la croissance de tissus tumoraux tridimensionnels. La méthode de la goutte suspendue permet une formation rapide de PEH tumorales de taille et de forme constantes à partir de plusieurs lignées cellulaires.

Des EHP ont été correctement cultivées sur le dispositif pendant jusqu'à trois jours. La croissance dans les chambres a été associée à une modification reproductible des microenvironnements. Au sein des EHP, l'apoptose était moindre chez les cellules situées à proximité du canal d'écoulement, et plus élevée en profondeur dans le tissu.

L'appareil a été utilisé pour estimer le coefficient de diffusion de la doxorubicine dans le tissu tumoral. La valeur obtenue expérimentalement était conforme à celle rapportée précédemment dans le cancer du sein humain. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de faire preuve d'une extrême prudence pour maintenir l'asepsie lors de l'écoulement du PHE dans l'appareil, car cette étape doit être effectuée en dehors de la culture cellulaire.

Pulvérisez généreusement de l'éthanol sur les capuchons des seringues et les extrémités des tubulures afin d'assurer la stérilité. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre le rôle de la pénétration limitée des médicaments dans les tumeurs. Nous avons démontré une technique permettant de simuler l'administration et l'élimination systémique de médicaments sur des tissus tumoraux tridimensionnels et de quantifier leur pénétration.

L'élimination des médicaments à faible pénétration simplifiera considérablement le processus de développement de médicaments anticancéreux.