Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs In vitro

L’objectif global de cette procédure est de démontrer la fabrication et le fonctionnement d’un dispositif microfluidique qui recrée des microenvironnements tumoraux in vitro et peut être utilisé pour tester des médicaments chimiothérapeutiques. Il s’agit du dispositif microfluidique. Cet appareil peut être utile dans les domaines suivants, test facile pour les médicaments chimiothérapeutiques in vitro.

Il fournit des résultats cohérents et précis pour tester le tissu tumoral tridimensionnel, et cet appareil fournit une représentation très précise de la tumeur in vivo. Les tumeurs existent dans les microenvironnements 3D et la capacité de tester dans l’un d’entre eux est significative. La première étape de la procédure consiste à assembler le dispositif, ce qui implique la fabrication d’une puce microfluidique à l’aide de la lithographie douce, le perçage de trous aux entrées et aux sorties, le collage à une lame de verre et la connexion du tube pour l’entrée et la sortie de l’écoulement.

Ensuite, les stéroïdes tumoraux multicellulaires uniformes sont générés pour être utilisés dans l’appareil en utilisant la méthode de la goutte suspendue. Les sphéroïdes sont ensuite introduits dans l’appareil, suivis de l’apoptose, des agents de détection et des médicaments chimiothérapeutiques. Enfin, une microscopie à intervalle de temps est effectuée, suivie d’une estimation mathématique des coefficients de diffusivité du médicament pour quantifier la capacité de pénétration de l’agent chimiothérapeutique.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la croissance tissulaire dans la formation de microenvironnements hétérogènes au sein du tissu et la diffusion du médicament dans le tissu grâce à l’utilisation de la microscopie à fluorescence à intervalle de temps. La pénétration limitée des médicaments anticancéreux dans les tumeurs solides est une cause importante de leur échec. La plupart des modèles actuels de test de médicaments anticancéreux n’imitent pas la nature tridimensionnelle des tumeurs solides.

Nous avons développé un dispositif microfluidique composé de tissus tumoraux tridimensionnels perfusés en continu. Ce modèle représente plus précisément l’administration de médicaments aux tumeurs solides et leur clairance systémique. Les stéroïdes tumoraux multicellulaires sont un modèle bien établi de tissus tumoraux tridimensionnels.

Dans cette procédure, la méthode de la goutte suspendue est utilisée pour créer des stéroïdes à utiliser dans le dispositif microfluidique. Cette méthode permet la formation de stéroïdes cohérents dans un court laps de temps. L’essai de médicaments chimiothérapeutiques in vitro dans des tissus tridimensionnels peut aider à dépister les médicaments de manière plus efficace par rapport aux monocouches de cellules.

Mélangez le PDMS et l’agent de durcissement de l’élastomère de silicium dans un rapport de poids de neuf pour un. Versez ensuite ce mélange sur le maître pour former un dégazage éblouissant de quatre millimètres d’épaisseur. Pour éliminer les bulles d’air, durcissez à 60 degrés Celsius pendant cinq heures.

Décollez le PDMS durci du moule pour obtenir un tampon de caractéristiques d’écoulement sur l’élastomère. Ensuite, à l’aide d’un poinçon de biopsie d’un millimètre et demi monté sur une perceuse, appuyez sur les trous de perforation pour les entrées et les sorties. Retirez tous les débris.

Soumettez le côté caractéristique du timbre et une lame de verre propre à un plasma d’oxygène pendant huit minutes. Dans un graveur au plasma d’oxygène, mettez immédiatement les surfaces traitées en contact pour former un lien entre elles. Maintenez l’ensemble à 60 degrés Celsius sur un chauffe-lames pendant au moins cinq heures.

Pour renforcer la liaison, connectez des tubes en PTFE de 0,032 pouce de diamètre intérieur aux entrées et sorties du dispositif microfluidique. À l’aide d’une interface de connecteurs de leurre mâle fixés à des connecteurs de leurre femelle barbelés, ces connecteurs spécifiques sont utilisés pour permettre de les traverser facilement sans se casser. Enfin, configurez l’ensemble d’écoulement à l’aide de vannes d’arrêt et d’un connecteur en Y, montez l’appareil sur le microscope Après avoir monté l’appareil, connectez le tube aux entrées et sorties appropriées pour terminer la configuration de l’écoulement.

Comme le montre cette figure, cette configuration permet la facilité et la polyvalence d’emballer un sphéroïde dans l’appareil ou de créer un flux de fluide à travers l’appareil à emballer. Ouvrez la vanne d’entrée de garniture VPN et la vanne de sortie de garniture VP pour sortir une tumeur. L’OID peut ensuite passer à travers l’entrée et s’écouler dans la chambre de culture où le poteau dans cette chambre maintiendra la tumeur en place pour s’écouler dans le milieu.

Fermez les vannes de garniture et ouvrez la vanne d’entrée de débit VF vers l’intérieur et la vanne de sortie de débit VF vers l’extérieur pour initier la formation d’un PHE uniforme. En utilisant la méthode de la goutte suspendue, des cellules de glace de trypsine sous une hotte de culture. Prélevez les cellules de trypsine résultantes de la centrifugeuse.

Diluer la solution mère à la concentration désirée en se référant au premier tableau. Ensuite, retirez le couvercle d’une plaque à 48 puits et placez-la à l’envers. Dans une hotte stérilisée, remplissez chaque puits de la plaque avec un millilitre d’eau stérilisée.

Pour maintenir l’humidité, placez une gouttelette de 20 microlitres de solution cellulaire diluée dans chaque région circulaire du couvercle. À l’aide d’une micro-pipette, retournez soigneusement le couvercle et placez-le sur la plaque, en veillant à ce que les gouttes ne touchent pas les bords des puits. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius.

Reportez-vous au tableau un pour la durée de l’incubation en fonction de la cellule particulière utilisée, un stéroïde se formera dans chaque goutte suspendue. Commencez par stériliser l’appareil en le rinçant avec de l’éthanol à 70 % par l’entrée du flux. Poursuivez avec un rinçage de PBS, puis de milieu de culture cellulaire tamponné H-E-P-E-S.

Laissez la seringue moyenne, fixez-la à la tubulure. Ensuite, aspirez deux à trois stéroïdes dans la seringue de robinet. Pour éliminer les bulles d’air, fixez la seringue à l’entrée de l’emballage de l’appareil.

Ouvrez la vanne d’admission VPN et fermez VFN, ouvrez la vanne de sortie VP et fermez VF. Tenez la seringue d’emballage à la verticale avec l’aiguille pointant vers le bas. Regardez comment le stéroïde se dépose au fond de la seringue dans le connecteur de verrouillage de leurre de l’aiguille.

Poussez le piston sur la seringue d’emballage et observez le PHE pénétrer dans le tube et s’écouler dans l’appareil, car seule la vanne de sortie de l’emballage est ouverte. Un stéroïde entrera dans la chambre de l’appareil et sera retenu par des poteaux à l’arrière. Une fois à l’intérieur de la chambre, le sphéroïde S s’adapte à la forme de la chambre et acquiert une géométrie rectangulaire.

Fermez la soupape d’entrée VPN et la soupape de sortie VP montez la seringue SF sur la pompe à seringue. Cette pompe est actionnée par un ordinateur à l’aide d’une pompe à seringue pro valve d’entrée ouverte VFN et d’une valve de sortie VF out. Commencez l’écoulement du fluide dans l’appareil à trois microlitres par minute.

L’incubation du sphéroïde pendant 24 heures est suivie de l’introduction d’agents de détection de l’apoptose. Avant d’introduire l’apoptose, la détection ou les agents thérapeutiques, permettent l’équilibre du sphéroïde jusqu’à 24 heures pour établir les gradients de nutriments et les microenvironnements. Fermez ensuite la vanne VFN.

Arrêtez le tire-seringue. Retirez la seringue de la pompe et remplacez-la par la seringue contenant un milieu avec 0,25 microlitres par mil de marqueur CASP glow red active Caspase three. Lavez l’appareil avec la solution en rinçant manuellement 0,7 millilitre dans l’appareil.

Montez ensuite la seringue sur la pompe. Redémarrez le débit et ouvrez la vanne VFN. Sur une période de cinq à huit heures, la phase trois du cph actif du gant de fût se diffusera dans les tissus et deviendra plus fluorescente dans les régions apoptotiques L’agent détectant l’apoptose à cette concentration est maintenu dans toutes les solutions d’écoulement ultérieures.

La doxorubicine est introduite cinq à huit heures après l’introduction d’agents de détection de l’apoptose. Ce traitement est éliminé du système par rinçage. Pour ajouter des agents chimiothérapeutiques, suivez la procédure de détection de l’apoptose pour introduire 10 micromolaires de chlorhydrate de doxorubicine.

Remplacez ensuite la seringue de traitement par la seringue avec 0,7 millilitres de milieu. Continuez l’écoulement de l’agent thérapeutique pendant une période de temps déterminée. Fermez ensuite la vanne VFN et éteignez la pompe à seringue.

Retirez la seringue de traitement du pousse-seringue et remplacez-la par la seringue avec 0,7 millilitre de fluide. Laisser s’écouler le milieu frais pendant 24 à 36 heures tout en surveillant en permanence le tissu au microscope. L’ensemble du processus d’acquisition pour la microscopie à intervalle temporel a été automatisé à l’aide d’un script personnalisé dans le laboratoire IP, acquérez des images en lumière transmise et en fluorescence du PAX Foid à un grossissement de 10 x toutes les 30 minutes Pour l’estimation mathématique des coefficients de diffusivité des médicaments, la première étape consiste à générer des profils d’intensité linéaire moyens de la fluorescence docs à l’aide de l’image J.Sélectionnez une région rectangulaire d’intérêts, ou le retour sur investissement englobant le tissu de la chambre.

Utilisez la commande tracer le profil pour générer un profil d’intensités moyennes en fonction de la distance par rapport au canal d’écoulement. Répétez l’opération jusqu’à trois points temporels différents. Ensuite, soustrayez l’intensité moyenne de fluorescence de fond des profils d’intensité obtenus et normalisez chaque profil en utilisant l’intensité maximale correspondante pour obtenir C en fonction de X et T.Où C est la concentration normalisée de doxorubicine, la valeur de C varie entre zéro et un.

L’étape suivante consiste à évaluer le coefficient de diffusion effectif des docs dans les docs de tissu tumoral. La diffusion peut être représentée par l’équation suivante où ERFC est la fonction d’erreur complémentaire. X est la distance entre le tissu et le canal, et T est le temps écoulé après l’introduction de la doxorubicine.

Utilisez le schéma itératif suivant à chaque point temporel considéré. Devinez une valeur pour D.Calculez le membre droit de l’équation à chaque emplacement. X.Calculez la somme des erreurs quadratiques entre les deux côtés, modifiez D pour minimiser la moyenne résiduelle.

Les valeurs optimales de D obtenues à chaque point temporel permettent d’estimer le coefficient de diffusion effectif moyen de la doxorubicine dans le tissu. Les dispositifs microfluidiques ont fourni des chambres de culture optiquement accessibles d’un millimètre sur 0,3 millimètre sur 0,15 millimètre pour la croissance de tissu tumoral tridimensionnel. La méthode de la goutte suspendue a permis la formation rapide de PHE tumorale de taille et de forme constantes à partir de plusieurs lignées cellulaires.

Les PHE ont été cultivés avec succès sur l’appareil jusqu’à trois jours. La croissance dans les chambres a été associée à la modification reproductible des microenvironnements. Au sein de phe, l’apoptose s’est produite moins dans les cellules à proximité du canal d’écoulement et plus haut et plus profondément dans les tissus.

L’appareil a été utilisé pour estimer le coefficient de diffusion de la doxorubicine et du tissu tumoral. La valeur expérimentale correspondait à la valeur rapportée précédemment dans le cancer du sein humain lors de la tentative de cette procédure. Il est important d’être très prudent quant au maintien de la stérilité lors de l’introduction de PHE dans l’appareil, car cela doit être effectué en dehors de la culture cellulaire.

Vaporisez généreusement les seringues et les extrémités des tubes avec de l’éthanol pour assurer la stérilité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension du rôle de la pénétration limitée des médicaments dans les tumeurs. Nous avons démontré une technique permettant d’imiter l’administration et la clairance systémique de médicaments sur des tissus tumoraux tridimensionnels et de quantifier leur pénétration.

L’élimination des médicaments peu pénétrants simplifiera considérablement le processus de développement des médicaments anticancéreux.