Name: Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs In vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 18 s
Description: Découvrez la fabrication d'un dispositif microfluidique pour recréer des microenvironnements tumoraux in vitro et tester des chimiothérapies. Cette méthode permet d'évaluer la diffusion de médicaments comme la doxorubicine dans des tissus 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national de la santé de subvention # 1R01CA120825-01A1, la recherche biomédicale en collaboration (PRC) de l&#39;Université du Massachusetts à Amherst, et la bourse Isenberg pour Bhushan J. Toley. Nous tenons à souligner la précieuse contribution de James Schafer, le vidéaste, le narrateur, et rédacteur en chef de cette vidéo.

1. Fabrication de périphériques La réplication des caractéristiques microfluidiques dans les matériaux élastomères est basée sur la méthode décrite par Duffy et al 1. <ol><li> Élastomère Mix (polydiméthylsiloxane; PDMS) et l'agent de durcissement à partir du Kit élastomère de silicone (Dow Corning, Midland, MI) dans un rapport pondéral de 9:1 à verser sur le maître pour former une couche de 4 mm d'épaisseur. Dégazer pour enlever les bulles d'air et durcir le mélange à 60 ° C pendant 5 heures. Peler durcie du moule PDMS pour obtenir un tampon de caractéristiques d'écoulement de l'élastomère. </li><li> Percez des trous pour les entrées et les sorties à l'aide d'une biopsie de 1,5 mm (Miltex, York, PA) monté sur une perceuse à colonne. Retirez tout débris. </li><li> Soumettre le côté caractéristiques du timbre et une lame de verre propre à un plasma d'oxygène pendant 8 minutes dans un plasma d'oxygène graveur. Amener les surfaces traitées en contact immédiatement pour former une liaison entre eux. Maintenir l'ensemble à 60 ° C sur une lame chaude pendant au moins 5 heuress pour renforcer le lien. </li><li> Connectez 0.032 "ID Tuyau en PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) pour les entrées et sorties à l'aide d'une interface de connecteurs luer lock mâle attaché à barbelés connecteurs femelles luer lock (Qosina, Edgewood, NY). </li><li> Mettre en place l'ensemble d'écoulement à l'aide robinets et un connecteur en Y (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Figure 1). Monter l'appareil sur le microscope. Fixer seringues de tubage à l'aide 20G 1.5 "aiguilles (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Formation de sphéroïdes uniformes Sphéroïdes sont formées par la méthode de la goutte suspendue 2,3. <ol><li> Trypsiniser cellules sous une hotte de culture cellulaire stérile. </li><li> Centrifuger les cellules trypsinisées à 2000 rpm pendant 5 minutes et remettre en suspension dans 6 ml de milieu frais. Diluer la solution mère à une concentration finale désirée (tableau 1). </li><li> Retirez le couvercle d'une plaque de 48 puits et placez-le à l'envers dans le sterilized capot. Régions circulaires correspondant à chaque puits sont apparents sur la couverture. Remplir chaque puits de la plaque avec 1 ml d'eau stérilisée pour maintenir l'humidité. Mettez une goutte de 20 ul de la solution diluée de cellules dans chaque région circulaire à l'aide d'une micropipette. Retourner avec précaution le couvercle et placez-le sur la plaque ainsi, faire en sorte que les gouttes ne touche pas les bords des puits. </li><li> Incuber la plaque de puits à 37 ° C pendant un nombre spécifié de jours (tableau 1). Un sphéroïde se former dans chaque goutte suspendue. </li></ol> 3. Introduction de sphéroïdes dans le dispositif Reportez-vous à la figure 1 et le tableau 2 pour cette section. <ol><li> Stériliser le dispositif de rinçage avec de l'éthanol 70% introduit à travers l'entrée d'écoulement. Par la suite, rincer avec du PBS suivie d'HEPES tampon milieu de culture cellulaire. Laisser la seringue moyen F S attaché à la tubulure. </li><li> Dessinez 2-3 sphéroïdes en P seringue S, appuyez sur la seringue pour éliminer les bulles d'air, etattacher à l'entrée du dispositif d'emballage. </li><li> Ouvert entrée de la vanne V Pin et près Fin V. Ouvrir la vanne de sortie Pout V et V près Fout. Tenez la seringue d'emballage verticale avec l'aiguille pointée vers le bas; regarder sphéroïdes se déposent au fond de la seringue dans le connecteur luer-lock de l'aiguille. Poussez le piston de la seringue d'emballage et de sphéroïdes montres entrer dans le tube et le débit dans l'appareil. Parce que la vanne de sortie emballage est ouvert, un sphéroïde pénètre dans la chambre de l'appareil et être conservé par les postes à l'arrière (Fig. 2). </li><li> Fermer entrée de la vanne V Pin et Pout sortie de la vanne V. Monter la seringue S F sur une pompe à seringue. Ouvrir le robinet et la vanne V Fin V Fout. Type de fluide dans le dispositif à 3 pi / min. </li></ol> 4. Présentation de l'agent apoptose de détection (CaspGLOW) Après l'emballage des chambres avec sphéroïdes, pour permettre l'équilibrage up à 24 heures pour établir des gradients de nutriments et micro-environnements, avant l'introduction de l'apoptose ou de la détection d'agents thérapeutiques. Parce que les tissus dans des chambres sont en contact avec des murs impénétrables du haut et du bas, il n'ya pas de gradients de nutriments le long de l'épaisseur (0,15 mm) du tissu. Après 24 heures d'incubation, les couches de cellules le long de l'épaisseur du tissu est donc équivalent et que l'hétérogénéité est dans une direction s'éloignant du canal d'écoulement. <ol><li> Couper V Fin, arrêter la pompe seringue, retirez F seringue S de la pompe et la remplacer par une seringue ayant moyennes contenant 0,25 ug / ml de CaspGLOW Red active Caspase-3 marqueur (rouge-DEVD-FMK, Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Vider manuellement les 0,7 ml de cette solution à travers le dispositif pour assurer le déplacement des personnes âgées à moyen terme. Monter la seringue de la pompe, redémarrez l'écoulement, et ouvert V Fin. Sur une période de 5-8 heures, la détection de l'apoptose diffuse agents en til tissu fluorescent et lumineuses dans les régions apoptotiques. Agent de l'apoptose détecter à cette concentration est maintenue dans toutes les solutions de flux ultérieurs dans le dispositif. </li></ol> Note: <ol class="lroman"><li> L'hétérogénéité des tissus peut être confirmé par l'obtention de profils d'intensité de fluorescence linéaire tel que décrit dans la section 6. Les profils doivent montrer gradients spatiaux dans l'apoptose, ce qui confirme que le tissu est hétérogène en ce qui concerne la viabilité des cellules. </li><li> CaspGLOW vert active Caspase-3 marqueur (fluorescéine-DEVD-FMK, Biovision) peuvent également être utilisés pour détecter l'apoptose. Ce marqueur contient la fluorescéine fluorophore vert au lieu de la rhodamine fluorochrome rouge. </li></ol> 5. Présentation de l'agent thérapeutique <ol><li> Suivez la procédure des étapes 4.1 à 4.2 pour introduire 10 uM chlorhydrate de doxorubicine (Dox; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) contenant l'apoptose agent de détection. </li><li> Continuer écoulement du therapeUTIC solution d'agent pendant une période de temps déterminée. Vanne d'arrêt V Fin et éteindre la pompe à seringue. Remplacez la seringue traitement avec une seringue contenant un milieu frais apoptose agent de détection. Permettre l'écoulement du milieu frais pendant 24 -36 heures tout en surveillant continuellement les tissus au microscope. </li></ol> 6. Time-lapse de microscopie et estimation des coefficients Diffusivité médicaments Pour obtenir plus propres données de fluorescence, d'acquérir toutes les images en mettant l'accent sur le microscope les basses couches de tissus. Parce qu'il n'y a pas de gradients de nutriments dans le sens vertical (voir la section 4), les couches inférieures de cellules sont de bons représentants de toutes les autres couches ci-dessus. <ol><li> Le processus d'acquisition a été automatisé en utilisant un script personnalisé dans IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Acquérir des images transmises lumière et de la fluorescence du sphéroïde emballé à un grossissement de 10x toutes les 30 minutes (figure 3A). Acquire une image de la fluorescence de fond avant l'introduction de Dox. Pour tenir compte de la grande taille de la chambre (1000 x 300 um um), l'acquisition de deux images adjacentes et les tuiles ensemble 4. </li><li> Pour l'estimation mathématique des coefficients de diffusivité de drogue, la première étape consiste à générer des profils d'intensité moyennes linéaires de Dox fluorescence en utilisant ImageJ. Sélectionner une région rectangulaire d'intérêt (ROI) entourant le tissu dans la chambre. Utilisez la commande Profil Terrain pour générer un profil d'intensités moyennes en fonction de la distance entre le canal d'écoulement. Répétez l'opération pour jusqu'à 3 points de temps différents. </li><li> Obtenir une image de fluorescence de fond avant l'introduction Dox pour mesurer l'autofluorescence de tissu. Soustraire l'intensité de fond de fluorescence moyenne des profils d'intensité obtenus et normaliser chaque profil correspondant à l'intensité maximale pour obtenir <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="c"> (X, t) (Fig. 3B). </li><li> L'étape suivante consiste à évaluer l'efficacité coefficient de diffusion D de Dox au sein du tissu tumoral. Dox diffusion peut être représentée par l'équation suivante 5 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Équation 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="L'équation 1"> où erfc est la fonction d'erreur complémentaire, x est la distance dans le tissu de la chaîne, et t est le temps après l'introduction de Dox (voir Fig. 3). Utilisez le schéma itératif suivant à chaque point de temps considéré: <ul><li> Devinez une valeur de D </li><li> Calculer côté droit de l'équation à chaque position x </li><li> Calculer la somme des carrés des erreurs (résiduelle) entre les deux parties </li><li> Modifier D pour minimiser le résidu </li></ul></li><li> Moyenne des valeurs optimales de D obtenue à chaque point temporel pour estimer le coefficient de diffusion effectif moyen de Dox dans le tissu. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: &lt;p = classe "jove_content"&gt; Les dispositifs microfluidiques fourni 1mm x 0,3 mm x 0,15 mm optiquement chambres de culture accessibles pour la croissance de tissu tumoral à trois dimensions. Sphéroïdes tumoraux multicellulaires ont volé dans ces chambres et ont été retenus par deux postes de filtre à l'arrière. La méthode de la goutte suspendue a permis la formation rapide de sphéroïdes de taille uniforme et la forme de plusieurs lignées cellulaires. Sphéroïdes ont été cultivées avec succès sur l'appareil pour un maximum de 3 jours. La croissance dans les chambres a été associée à une modification reproductible des micro-environnements au sein de sphéroïdes. L'apoptose dans les cellules ont été moins à proximité du canal d'écoulement et plus profondément dans les tissus. Le dispositif a été utilisé pour estimer le coefficient de diffusion de la doxorubicine dans le tissu tumoral. La valeur obtenue de 8,75 x 10 -7 cm -1 2 s est en accord avec la valeur de 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 signalé précédemment 6 dans le cancer du sein humain. <table border="1"><tbody><tr><td> Lignée cellulaire </td><td> Concentration cellulaire nécessaire </td><td> Temps d'incubation </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 cellules / uL </td><td> 2-3 jours </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 cellules / uL </td><td> 3-4 jours </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 cellules / uL </td><td> 5-6 jours </td></tr></tbody></table> Tableau 1 Paramètres. Pour Sphéroïdes goutte suspendue <table border="1"><tbody><tr><td> Partie </td><td> Description </td></tr><tr><td> S F </td><td> Seringue flux </td></tr><tr><td> S P </td><td> Emballage seringue </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Soupape d'admission de flux </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Emballage soupape d'admission </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Vanne de sortie de flux </td></tr><tr><td> Pout V </td><td> Emballage vanne de sortie </td></tr></tbody></table> Seringues Tableau 2. Vannes et dans la configuration de débit <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 Schéma de l'écoulement de l'installation V et V Fin Fout:. Entrée de débit et de vannes de sortie; V Pin et Pout V: entrée d'emballage et de soupapes d'échappement; S F et S P: Débit et des seringues d'emballage. La seringue d'emballage et de conditionnement soupapes d'admission et de sortie sont utilisés lors d'un sphéroïde est effectué dans la chambre. La seringue d'écoulement et de débit d'entrée et valves de sortie sont utilisés pour s'écouler ensuite milieu. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Schéma d'un sphéroïde pris au piège dans une chambre sur l'appareil. Un sphéroïde s'écoule dans la chambre de l'appareil et est bloqué par deux pos filtrect à l'arrière de la chambre. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Diffusion doxorubicine dans le tissu tumoral sur l'appareil. A. Fusionné transmise image lumineuse et fluorescente rouge de tissu, indiquant l'emplacement et la concentration de doxorubicine (en rouge). La barre d'échelle représente 250 um. B. Profil normalisé intensité linéaire de la fluorescence de la doxorubicine.

<ol><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li>
<li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li>
<li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li>
<li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma%3A+branching+patterns+and+vessel+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li>
<li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+physiology+of+solid+tumors%3A+opportunities+%28and+problems%29+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li>
<li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La vascularisation des tumeurs sont rares et mal développés 7,8. Il ya des régions éloignées (&gt; 100 um) à partir des vaisseaux sanguins qui sont inaccessibles aux nutriments et les médicaments fournis si le 9 vasculaire. Le micro-environnement hétérogène résultant contribue à l&#39;efficacité limitée de plusieurs agents chimiothérapeutiques 10. Le dispositif microfluidique développée ici recrée un microenvironnement tumoral hétérogène, caractérisée par la prolifération, l&#39;apoptose...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Kit d&#39;élastomère de silicone </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex biopsie </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1,5 mm </td></tr><tr><td> Tuyau PTFE </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06417-31 </td><td> 0.032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Connecteur Luer mâle de verrouillage </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Barbed connecteur luer lock femelle </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Vanne d&#39;arrêt </td><td> Idex la santé et des sciences </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-connecteur </td><td> Idex la santé et des sciences </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1.5 &quot;aiguilles </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW fluorescéine </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Rouge </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhydrate de doxorubicine </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Lignée cellulaire humaine de carcinome du côlon </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Ligne d&#39;Ductal cellulaire Carcinome </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Human ligne cellulaire d&#39;adénocarcinome mammaire </td></tr></tbody></table>

dispositif microfluidique pour recréer un microenvironnement des tumeurs<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Nous avons développé un dispositif microfluidique qui imite la livraison et la clairance systémique de médicaments hétérogènes tridimensionnels tissus tumoraux in vitro. Les éléments nutritifs fournis par le système vasculaire ne parviennent pas à atteindre toutes les parties de tumeurs, ce qui donne lieu à des micro-environnements hétérogènes constitués de types de cellules viables, de repos et nécrotiques. Médicaments contre le cancer ne parviennent pas à pénétrer efficacement et de traiter tous les types de cellules en raison de cette hétérogénéité. Des monocouches de cellules cancéreuses ne pas imiter cette hétérogénéité, il est difficile de tester des médicaments anticancéreux avec un modèle in vitro approprié. Nos dispositifs microfluidiques ont été fabriquées à partir de PDMS en utilisant la lithographie douce. Multicellulaires sphéroïdes tumoraux, formées par la méthode de la goutte suspendue, ont été insérés dans des chambres de contrainte et rectangulaires sur le dispositif de perfusion et maintenu à support continu sur un côté. La forme rectangulaire des chambres sur le dispositif créé dégradés linéaires dans les tissus. Colorants fluorescents ont été utilisés pour quantifier ela variabilité e dans l&#39;apoptose dans les tissus. Les tumeurs de l&#39;appareil ont été traités avec la doxorubicine fluorescente chimiothérapeutique drogue, time-lapse microscopie a été utilisé pour contrôler sa diffusion dans les tissus, et le coefficient de diffusion effectif a été estimé. La méthode de la goutte suspendue a permis la formation rapide de sphéroïdes uniformes de plusieurs lignées de cellules cancéreuses. Le terminal est activée croissance des sphéroïdes pour un maximum de 3 jours. Les cellules se trouvant à proximité de faire circuler l&#39;agent apoptotique sont très peu et loin de ceux de la chaîne sont plus apoptotique, ainsi fidèlement imitant les régions adjacentes dans les tumeurs des vaisseaux sanguins. La valeur estimée du coefficient de diffusion d&#39;accord avec la doxorubicine une valeur précédemment rapportés dans le cancer du sein humain. Parce que la pénétration et la rétention de médicaments dans les tumeurs solides affecte leur efficacité, nous pensons que ce dispositif est un outil important pour comprendre le comportement de la drogue, et qui développe des thérapies contre le cancer.

Nous présentons la procédure pour la fabrication et le fonctionnement d&#39;un dispositif microfluidique qui recrée hétérogènes micro-environnements tumoraux<em&gt; In vitro</em&gt;. La variabilité dans l&#39;apoptose au sein du tissu tumoral a été quantifiée en utilisant des colorants fluorescents et le coefficient de diffusion effectif de la doxorubicine médicament chimiothérapeutique dans le tissu tumoral a été évalué.

Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs<em&gt; In vitro</em

Nous avons développé un dispositif microfluidique qui simule l'administration et la clairance systémique de médicaments vers des tissus tumoraux tridimensionnels hétérogènes dans...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la fabrication et le fonctionnement d'un dispositif microfluidique qui recrée in vitro des microenvironnements tumoraux et peut être utilisé pour tester des médicaments chimiothérapeutiques. Voici le dispositif microfluidique. Ce dispositif peut s'avérer utile dans les domaines suivants : tests simples de médicaments chimiothérapeutiques in vitro.Il fournit des résultats cohérents et précis pour tester les tissus tumoraux tridimensionnels, et ce dispositif offre une représentation très fidèle de la tumeur in vivo. Les tumeurs existent dans des microenvironnements tridimensionnels, et la possibilité de les tester dans un tel environnement est significative. La première étape de la procédure consiste à assembler le dispositif, ce qui implique la fabrication d'une puce microfluidique par lithographie douce, le perçage de trous aux entrées et sorties, l'assemblage sur une lame de verre et la connexion de tubulures pour l'entrée et la sortie du flux.Ensuite, les stéroïdes tumoraux multicellulaires uniformes sont générés pour être utilisés dans le dispositif à l'aide de la méthode de la goutte pendante. Les sphéroïdes sont alors introduits dans le dispositif, suivis d'agents de détection de l'apoptose et de médicaments chimiothérapeutiques. Enfin, une microscopie en temps différé est réalisée, puis une estimation mathématique des coefficients de diffusivité des médicaments permet de quantifier la capacité de pénétration de l'agent chimiothérapeutique.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la croissance tissulaire dans le dispositif, la formation de microenvironnements hétérogènes au sein du tissu et la diffusion du médicament dans le tissu grâce à l'utilisation de la microscopie à fluorescence en temps réel. La pénétration limitée des médicaments anticancéreux dans les tumeurs solides est une cause importante de leur échec. La plupart des modèles actuels de test des médicaments anticancéreux ne reproduisent pas la nature tridimensionnelle des tumeurs solides.Nous avons mis au point un dispositif microfluidique composé de tissus tumoraux tridimensionnels perfusés en continu. Ce modèle représente de manière plus précise l'administration de médicaments aux tumeurs solides et leur élimination systémique. Les stéroïdes tumoraux multicellulaires constituent un modèle bien établi de tissus tumoraux tridimensionnels.Dans cette procédure, la méthode de la goutte pendante est utilisée pour créer des sphéroïdes destinés à être utilisés dans le dispositif microfluidique. Cette méthode permet la formation de sphéroïdes homogènes en un court laps de temps. L'essai de médicaments chimiothérapeutiques in vitro sur des tissus tridimensionnels peut aider à sélectionner les médicaments de manière plus efficace par rapport aux monocouches de cellules.Mélangez le PDMS et l'agent de réticulation provenant de l'élastomère de silicone selon un rapport pondéral de neuf pour un. Versez ensuite ce mélange sur le modèle maître afin d'obtenir une couche de caoutchouc de quatre millimètres d'épaisseur. Pour éliminer les bulles d'air, laissez durcir à 60 degrés Celsius pendant cinq heures.Détachez le PDMS durci du moule pour obtenir un tampon présentant les motifs de flux sur l'élastomère. Ensuite, à l'aide d'un poinçon de biopsie d'un millimètre et demi monté sur une perceuse, percez des trous pour les entrées et les sorties. Retirez tout débris.Soumettez le côté motif du tampon et une lame de verre propre à un plasma d'oxygène pendant huit minutes. Dans un graveur à plasma d'oxygène, mettez immédiatement en contact les surfaces traitées afin de former une liaison entre elles. Maintenez l'assemblage à 60 degrés Celsius sur un réchauffeur de lames pendant au moins cinq heures.Pour renforcer la liaison, connectez un tube en PTFE de 0,032 pouces de diamètre interne aux entrées et sorties du dispositif microfluidique. À l’aide d’une interface composée de raccords mâles à visserie fixe attachés à des raccords femelles à emboîtement, ces raccords spécifiques permettent de faire passer facilement les tubes sans les rompre. Enfin, configurez l’assemblage d’écoulement à l’aide de vannes d’arrêt et d’un raccord en Y, puis fixez le dispositif sur le microscope. Après avoir monté le dispositif, reliez les tubes aux entrées et sorties appropriées pour finaliser la configuration d’écoulement.Comme illustré sur cette figure, cette configuration permet facilement et de manière polyvalente d'insérer un sphéroïde dans le dispositif ou de créer un flux de milieu à travers le dispositif pour l'insertion. Ouvrez la vanne d'entrée d'insertion VPN et la vanne de sortie d'insertion VP pour une tumeur. L'OID peut alors passer par l'entrée et s'écouler dans la chambre de culture, où le poteau présent dans cette chambre maintiendra la tumeur en place pendant le passage du milieu.Fermez les vannes de remplissage et ouvrez la vanne d'entrée d'écoulement VF in et la vanne de sortie d'écoulement VF out pour initier la formation de PHE uniformes. À l’aide de la méthode de la goutte pendante, traitez les cellules au trypsine sur glace sous hotte de culture. Récupérez les cellules au trypsine obtenues à partir de la centrifugeuse.Diluez la solution mère à une concentration souhaitée en vous référant au tableau un. Ensuite, retirez le couvercle d'une plaque de 48 puits et placez-le à l'envers. Dans une hotte stérile, remplissez chaque puits de la plaque avec un millilitre d'eau stérilisée.Pour maintenir l'humidité, déposez une goutte de 20 microlitres de solution cellulaire diluée dans chaque région circulaire du couvercle. À l’aide d’une micropipette, retournez délicatement le couvercle et placez-le au-dessus de la plaque, en veillant à ce que les gouttes ne touchent pas les bords des puits. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius.Se référer au tableau un pour la durée de l'incubation selon le type de cellule utilisé, un stéroïde se formera dans chaque goutte suspendue. Commencer par stériliser l'appareil en le rinçant avec de l'éthanol à 70 % par l'entrée d'écoulement. Suivre par un rinçage successif au PBS, puis au milieu de culture cellulaire tamponné au H-E-P-E-S.Laissez la seringue moyenne, fixez-la au tube. Ensuite, aspirez deux à trois stéroïdes dans le robinet de la seringue. Pour éliminer les bulles d'air, reliez la seringue à l'entrée de remplissage du dispositif.Ouvrez la vanne d'entrée VPN et fermez VFN, ouvrez la vanne de sortie VP out et fermez VF out. Tenez la seringue de remplissage verticalement, avec l'aiguille orientée vers le bas. Observez le stéroïde qui s'accumule au fond de la seringue, dans le raccord fileté de l'aiguille.Poussez le piston de la seringue de conditionnement et observez l'entrée du PHE dans le tube et son écoulement vers le dispositif, car seule la vanne de sortie de conditionnement est ouverte. Un stéroïde pénètre dans la chambre du dispositif et est retenu par des piliers situés à l'arrière. Une fois à l'intérieur de la chambre, le sphéroïde S s'adapte à la forme de la chambre et acquiert une géométrie rectangulaire.Fermer la vanne d'entrée VPN et la vanne de sortie VP, puis monter la seringue de flux SF sur la pompe à seringue. Cette pompe est commandée par un ordinateur à l'aide du logiciel Syringe Pump Pro ; ouvrir la vanne d'entrée VFN et la vanne de sortie VF. Démarrer l'écoulement du milieu dans le dispositif à raison de trois microlitres par minute.L'incubation des sphéroïdes pendant 24 heures est suivie par l'ajout d'agents de détection de l'apoptose. Avant d'ajouter des agents de détection de l'apoptose ou des agents thérapeutiques, laisser les sphéroïdes atteindre l'équilibre jusqu'à 24 heures afin d'établir des gradients de nutriments et des microenvironnements. Ensuite, fermer la vanne VFN.Arrêtez la pompe à seringue. Retirez la seringue de la pompe et remplacez-la par la seringue contenant le milieu avec 0,25 microlitre par millilitre de marqueur Caspase trois actif CASP glow red. Lavez le dispositif avec la solution en rinçant manuellement 0,7 millilitre de celle-ci à travers le dispositif.Ensuite, fixez la seringue sur la pompe. Redémarrez le débit et ouvrez le robinet VFN. Pendant une période de cinq à huit heures, l'agent actif rouge CPH de la phase trois s'infusera dans le tissu et fluorescera plus intensément dans les régions apoptotiques. L'agent de détection de l'apoptose est maintenu à cette concentration dans toutes les solutions de flux ultérieures.La doxorubicine est introduite cinq à huit heures après l'ajout des agents de détection de l'apoptose. Ce traitement est éliminé du système par rinçage. Pour ajouter des agents chimiothérapeutiques, suivez la procédure de détection de l'apoptose afin d'introduire 10 micromolaire de chlorhydrate de doxorubicine.Remplacez ensuite la seringue de traitement par celle contenant 0,7 millilitre de milieu. Poursuivez l'écoulement de l'agent thérapeutique pendant une période fixe. Fermez ensuite le robinet VFN et arrêtez la pompe à seringue.Retirer la seringue de traitement de la pompe à seringue et la remplacer par une seringue contenant 0,7 millilitre de milieu. Laisser circuler du milieu frais pendant 24 à 36 heures tout en surveillant continuellement le tissu au microscope. L'ensemble du processus d'acquisition pour la microscopie en temps réel a été automatisé à l'aide d'un script personnalisé dans IP Lab, acquérant toutes les 30 minutes des images en lumière transmise et en fluorescence du PAX Foid à un grossissement de 10 x. Pour l'estimation mathématique des coefficients de diffusivité du médicament, la première étape consiste à générer des profils d'intensité linéaires moyens de la fluorescence de Docs à l'aide d'ImageJ. Sélectionner une région d'intérêt rectangulaire, ou ROI, englobant le tissu dans la chambre.Utilisez la commande de profil de tracé pour générer un profil d'intensités moyennes en fonction de la distance par rapport au canal d'écoulement. Répétez cette opération pour jusqu'à trois points temporels différents. Ensuite, soustrayez l'intensité moyenne de fluorescence de fond des profils d'intensité obtenus et normalisez chaque profil en utilisant l'intensité maximale correspondante afin d'obtenir C en fonction de X et T. Où C représente la concentration normalisée de doxorubicine, la valeur de C variant de zéro à un.L'étape suivante consiste à évaluer le coefficient de diffusion effectif des docs dans le tissu tumoral docs. La diffusion peut être représentée par l'équation suivante, où ERFC est la fonction d'erreur complémentaire. X est la distance dans le tissu à partir du canal, et T est le temps écoulé après l'administration de la doxorubicine.Utilisez le schéma itératif suivant à chaque instant considéré. Proposez une valeur pour D. Calculez le membre de droite de l'équation à chaque emplacement. X. Calculez la somme des carrés des erreurs entre les deux membres, puis modifiez D afin de minimiser la moyenne des résidus.Les valeurs optimales de D obtenues à chaque point temporel permettent d'estimer le coefficient de diffusion effectif moyen de la doxorubicine dans le tissu. Les dispositifs microfluidiques offrent des chambres de culture optiquement accessibles d'un millimètre sur 0,3 millimètre sur 0,15 millimètre pour la croissance de tissus tumoraux tridimensionnels. La méthode de la goutte suspendue permet une formation rapide de PEH tumorales de taille et de forme constantes à partir de plusieurs lignées cellulaires.Des EHP ont été correctement cultivées sur le dispositif pendant jusqu'à trois jours. La croissance dans les chambres a été associée à une modification reproductible des microenvironnements. Au sein des EHP, l'apoptose était moindre chez les cellules situées à proximité du canal d'écoulement, et plus élevée en profondeur dans le tissu.L'appareil a été utilisé pour estimer le coefficient de diffusion de la doxorubicine dans le tissu tumoral. La valeur obtenue expérimentalement était conforme à celle rapportée précédemment dans le cancer du sein humain. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de faire preuve d'une extrême prudence pour maintenir l'asepsie lors de l'écoulement du PHE dans l'appareil, car cette étape doit être effectuée en dehors de la culture cellulaire.Pulvérisez généreusement de l'éthanol sur les capuchons des seringues et les extrémités des tubulures afin d'assurer la stérilité. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre le rôle de la pénétration limitée des médicaments dans les tumeurs. Nous avons démontré une technique permettant de simuler l'administration et l'élimination systémique de médicaments sur des tissus tumoraux tridimensionnels et de quantifier leur pénétration.L'élimination des médicaments à faible pénétration simplifiera considérablement le processus de développement de médicaments anticancéreux.

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Procédé pour la culture d'une monocouche de cellules endothéliales sur toute la surface intérieure 3D d'un dispositif microfluidique avec microvasculaire taille canaux (&lt;30 um) est décrite.

Microfluidique endothélialisée pour étudier les interactions microvasculaires dans Hémopathies

Dans cette vidéo, nous générons des microtumeurs à partir de cellules tumorales dérivées de patients à l’aide de biogel humain 3D. Ces microtumeurs ressemblent beaucoup au microenvironnement tumoral in vivo et servent de plates-formes potentielles pour les tests de médicaments.

Génération de microtumeurs : une technique de culture in vitro pour cultiver des microtumeurs 3D afin d’analyser la réponse au traitement médicamenteux

Méthodes pour créer des tissus tumoraux humains 3D comme systèmes d'essai sont décrits. Ces technologies sont basées sur un échafaudage décellularisé biologique vascularisé (BioVaSc), les cellules primaires humaines et d'une lignée cellulaire tumorale, qui peut être cultivée dans des conditions statiques ainsi que dans des conditions dynamiques dans un bioréacteur d'écoulement.

génie tissulaire d&#39;un être humain 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Système de tumeur de test

Nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable pour imiter le microenvironnement tumoral (TME). Le modèle consiste en une culture cellulaire mixte, permet la génération simplifiée de populations cellulaires individuelles hautement enrichies sans utiliser le marquage fluorescent ou le tri cellulaire, et permet d’étudier la communication intercellulaire au sein du TME dans des conditions normales ou de stress.

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Nous présentons un modèle microfluidique de cancer sur puce, la technologie « Accélérateur d'évolution », qui fournit une plate-forme contrôlable pour des études quantitatives à long terme en temps réel de la dynamique du cancer dans des conditions environnementales bien définies à une cellule unique niveau. Cette technologie devrait servir de modèle in vitro pour la recherche fondamentale ou le développement de médicaments précliniques.

Génération de gradients de médicaments hétérogènes à travers les populations cancéreuses sur un accélérateur d'évolution microfluidique pour l'observation en temps réel

Ici, nous présentons un protocole pour préparer et cultiver un micro-environnement métastatique de tumeur de barrière de cerveau de sang et puis quantifiant son état utilisant l’imagerie confocale et l’intelligence artificielle (apprentissage automatique).

Quantification du micro-environnement de tumeur métastatique du cerveau à l’aide d’un modèle 3D à puce d’organe sur une puce, d’apprentissage automatique et de tomographie confocale

Nous présentons un système microfluidique pour les études à haut débit sur les machines de vie complexes, qui se compose de 1500 unités de culture, une gamme de pompes périsaltiques améliorées et un module de mélange sur place. La puce microfluidique permet d’analyser in vivo les conditions micro-environnementales très complexes et dynamiques.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire, la biologie du cancer nécessite de nouveaux outils in vitro et informatiques pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié. Nous décrivons des protocoles pour exploiter les co-cultures microfluidiques immunitaires contre les tumeurs dans des contextes 2D et 3D, compatibles avec la surveillance dynamique et multiparamétrique des fonctions cellulaires.

Modèles de co-culture microfluidique pour disséquer la réponse immunitaire dans des microenvironnements tumoraux in vitro

Ici, nous fournissons une puce microfluidique et un système microfluidique de circulation automatiquement contrôlé et très efficace qui récapitule le microenvironnement initial de la néovascularisation, permettant aux cellules endothéliales (CE) d'être stimulées simultanément par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions simultanées du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF).

Modèle microfluidique pour imiter l&apos;événement initial de la néovascularisation

Ce protocole présente un modèle de tumeur sur puce physiologiquement pertinent pour effectuer des recherches fondamentales et translationnelles à haut débit sur le cancer humain, en faisant progresser le dépistage des médicaments, la modélisation des maladies et les approches de médecine personnalisée avec une description des procédures de chargement, d’entretien et d’évaluation.

Établissement d’un modèle physiologique de micro-tumeurs vascularisées humaines pour la recherche sur le cancer

Ici, nous présentons des protocoles qui détaillent les instructions pour la mise en œuvre de cultures cellulaires 3D utilisant des matrices de collagène et de collagène-agarose dans un système microphysiologique. Ces protocoles prennent en charge la co-culture de sphéroïdes de tubule proximal rénal et de carcinome rénal, simulant des conditions in vivo et permettant une investigation avancée des interactions entre les cellules cancéreuses du rein.

Co-culture microfluidique d’épithélium rénal sain et tumoral pour modéliser la progression du cancer du rein

Découvrez la fabrication d'un dispositif microfluidique pour recréer des microenvironnements tumoraux in vitro et tester des chimiothérapies. Cette méthode permet d'évaluer la diffusion de médicaments comme la doxorubicine dans des tissus 3D.

Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs

Explorer plus de vidéos