Name: Respirométriques évaluation phosphorylation oxydative dans la saponine perméabilisées fibres cardiaques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Découvrez comment évaluer la phosphorylation oxydative mitochondriale dans des fibres cardiaques perméabilisées à la saponine. Cette méthode de respirométrie haute résolution permet de mesurer précisément la fonction mitochondriale in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette étude a été financée par les Instituts canadiens de recherche en santé et Génome Canada. JS détient bourses d&#39;aide salariale de l&#39;Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation du Canada et l&#39;Association canadienne du diabète. Le laboratoire tient à souligner l&#39;aide technique des instruments Oroboros lors de l&#39;acquisition de la technique des fibres perméabilisées saponine.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+solubilities+of+media+used+in+electrochemical+respiration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements.</a> Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).</li>
<li>Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+fails+to+reduce+cerebral+oxygen+consumption+early+after+non-hemorrhagic+closed+head+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats.</a> J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+conformance+of+cellular+respiration.+A+perspective+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology.</a> Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>O, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retarded+diffusion+of+ADP+in+cardiomyocytes%3A+possible+role+of+mitochondrial+outer+membrane+and+creatine+kinase+in+cellular+regulation+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).</li>
<li>Endo, M., Kitazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-C+coupling+studies+in+skinned+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Aspects+of+Cardiac+Muscle%22%5BJournal%5D)">E-C coupling studies in skinned cardiac fibers.</a> Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).</li>
<li>Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+saponin+on+biological+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Action of saponin on biological cell membranes.</a> Nature. , 196-952 (1962).</li>
<li>Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipids of mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).</li>
<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
<li>Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkladal%2C+D+%22What+is+Controlling+Life%3F%22">What is Controlling Life?</a>. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Drug-Induced+Mitochondrial+Dysfunction%22">Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction</a>. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).</li>
</ol>

La technique de la saponine perméabilisées fibres cardiaques offre un compromis unique entre in vitro et in vivo l&#39;évaluation de la consommation d&#39;oxygène des mitochondries OXPHOS. Avantages de cette technique comprennent une augmentation pertinence physiologique par rapport aux mitochondries isolées de l&#39;architecture cellulaire est préservée. Alors que la membrane plasmique est dégradé, les structures membranaires intracellulaires, y compris 12 des mitochondries, 14, 14</su...

<table><tbody><tr><td>Éthanol à 100 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 70 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5&amp;#8242;-sel monopotassique de diphosphate dihydraté (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin essentiellement dépourvue d'acides gras&amp;#8211;gratuit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5&amp;#8242;-sel de disodium de triphosphate hydraté (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl cyanure de p-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothréitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Éthylène glycol-bis-(2-amino&amp;#8211;thyléther)-N,N,N&amp;#8242;, N&amp;#8242;acide éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Acide glutamique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Acide lactobionique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>acide malique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,&amp;rsquo;-Tétraméthyl-p-phénylènediamine, chlorhydrate (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Phosphocréatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cyanure de potassium</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate monobasique de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Roténone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital de sodium</td><td>Ceva Santé Animale</td><td>1715 138</td><td>Conc. 54,7 mg/ml</td></tr><tr><td>pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Acide succinique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glace</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en polypropylène de 15 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en polypropylène de 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Pinces à bijoutier droites</td><td>George Tiemann &amp;et Cie</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Pinces à embouts incurvés pour bijoutier</td><td>George Tiemann &amp;et Cie</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux droits</td><td>George Tiemann &amp;et Cie</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel stérile</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;Filtres à seringue m</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de Petri en verre</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire en polystyrène, 12 puits</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur magnétique</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Microbars</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Balance de pesée</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;syringe micro-à piston Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;syringe micro-à l'aiguille Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;syringe micro-à l'aiguille Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Flacons pression Nalgene</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Plats de pesée en polystyrène</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

respirométriques évaluation phosphorylation oxydative dans la saponine perméabilisées fibres cardiaques

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Enquête sur la fonction mitochondriale représente un paramètre important de la physiologie cardiaque que les mitochondries sont impliquées dans le métabolisme énergétique, le stress oxydatif, l&#39;apoptose, le vieillissement, encéphalomyopathies mitochondriale et la toxicité des médicaments. Dans ce contexte, les technologies pour mesurer la fonction mitochondriale cardiaques sont en demande. Une technique qui emploie une approche intégrative pour mesurer la fonction mitochondriale est respirométriques phosphorylation oxydative (OXPHOS) analyse. Le principe de l&#39;évaluation OXPHOS respirométriques est centrée autour de la mesure de la concentration en oxygène en utilisant une électrode de Clark. Comme le faisceau de fibres perméabilisées consomme l&#39;oxygène concentration en oxygène, dans les baisses de chambre fermée. En utilisant des protocoles de titration sélectionnée substrat-inhibiteur découplant, les électrons sont fournis à des sites spécifiques de la chaîne de transport d&#39;électrons, ce qui permet l&#39;évaluation de la fonction mitochondriale. Avant l&#39;analyse respirométriques de la fonction mitochondriale, mécaniques et chimiques des techniques de préparation sont utilisées pour perméabiliser le sarcolemme des fibres musculaires. Perméabilisation chimique emploie saponine de façon sélective perforer la membrane cellulaire tout en conservant l&#39;architecture cellulaire. Ce document décrit en détail les étapes impliquées dans la préparation de saponine peau fibres cardiaques pour mesurer la consommation d&#39;oxygène afin d&#39;évaluer OXPHOS mitochondriale. De plus, le dépannage des conseils ainsi que des substrats spécifiques, les inhibiteurs et découpleurs qui peuvent être utilisées pour déterminer la fonction des mitochondries dans des sites spécifiques de la chaîne de transport d&#39;électrons sont fournis. Fait important, le protocole décrit peut être facilement appliquée à des tissus cardiaques et squelettiques de divers modèles animaux et des échantillons humains.

Préparation des fibres perméabilisées saponine en conjonction avec l&#39;analyse de phosphorylation oxydative respirométriques fournit une évaluation intégrative de la fonction mitochondriale. Respiration mitochondriale dans les états physiologiques et pathologiques peuvent refléter diverses influences réglementaires, y compris les interactions des mitochondries, la morphologie et la biochimie.

Respirométriques évaluation phosphorylation oxydative dans la saponine perméabilisées fibres cardiaques

L'étude de la fonction mitochondriale représente un paramètre important de la physiologie cardiaque, car les mitochondries sont impliquées dans le métabolisme énergétique, ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des fibres cardiaques perméabilisées à la saponine pour des mesures polarographiques. Cela est réalisé en premier lieu en excisant le cœur de la souris. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer mécaniquement des faisceaux de fibres cardiaques contenant au maximum six à huit fibres faiblement connectées.Ensuite, les faisceaux cardiaques sont chimiquement perméabilisés à l'aide de saponine. Les faisceaux cardiaques sont alors lavés pour éliminer toute saponine résiduelle ainsi que tout métabolite restant. Enfin, des résultats peuvent être obtenus, fournissant des informations sur la phosphorylation oxydative mitochondriale grâce à des mesures polarographiques.Bonjour, je suis Curtis Huey du laboratoire de la Dre Jane Sheer, du Département de biochimie et de biologie moléculaire de l'Université de Calgary. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de préparer des fibres cardiaques perméabilisées à la saponine. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour évaluer la phosphorylation oxydative mitochondriale in situ.Commençons. Pour commencer cette procédure, retirez un cœur marin et placez-le dans une boîte de Pétri contenant la solution RP sur de la glace. À l’aide d’un microscope stéréo, retirez soigneusement tout tissu conjonctif et toute graisse éventuelle.Coupez le cœur en deux le long du septum et prélèvez 10 à 25 milligrammes, en poids humide, de tissu en effectuant des incisions à partir de la surface de l'endocarde du ventricule gauche. Veillez à ce que l'incision suive l'orientation des fibres afin de minimiser les dommages mécaniques au myocarde. Placez l'échantillon de tissu disséqué dans une boîte de Pétri séparée contenant la solution RP placée sur de la glace.Couper le cœur en bandes longitudinales suivant l'orientation des fibres, d'un diamètre de un à 1,5 millimètre. Raccourcir les bandes à l’aide d’un scalpel à une longueur comprise entre deux et quatre millimètres, avec le plus grand soin et en utilisant des pinces fines et tranchantes. Séparer mécaniquement les faisceaux de fibres.Les faisceaux de fibres finaux doivent contenir au maximum six à huit fibres reliées par de petites zones de contact et pesant entre un et trois milligrammes de poids humide. Visuellement, le tissu cardiaque doit passer de sa couleur rouge d'origine à une teinte rose pâle. Commencez la préparation des faisceaux de fibres cardiaques en plaçant une plaque de 12 puits sur de la glace.Rincer les puits avec la solution RP afin de minimiser la contamination par le calcium. Ajouter trois millilitres de solution RP froide sur glace contenant 50 microgrammes par millilitre de saponine dans l'un des puits. Ensuite, transférer les faisceaux de fibres préparés mécaniquement dans le puits.Incuber les faisceaux de fibres pendant 20 minutes avec agitation douce sur de la glace. Rincer une nouvelle cavité avec la solution miroir cinq, puis pipeter 10 millilitres de miroir cinq glacé dans la nouvelle cavité. Transférer les faisceaux cardiaques dans la cavité et les incuber pendant 10 minutes avec agitation douce sur de la glace.Après l'incubation, répétez l'opération avec le miroir cinq. Lavez deux à trois fois avec du miroir cinq frais. Transférez les faisceaux cardiaques dans 10 millilitres de miroir cinq glacé à chaque fois.Les étapes répétées de lavage ont pour but d'assurer l'élimination de la saponine A-T-P-A-D-P et de tous les substrats résiduels des faisceaux de fibres juste avant l'analyse respiratoire. Déterminer la masse humide des faisceaux de fibres individuels en les tamponnant sur une surface absorbante à l’aide de pinces, en maintenant la fibre contre la surface pendant cinq secondes ou jusqu’à ce que toute l’humidité soit absorbée. À l’aide d’une autre surface absorbante, retirer l’excès de liquide des pinces.Déchirez l'échelle et placez le faisceau de fibres sur une platine en plastique pour la mesure de masse. Transférez le faisceau de fibres cardiaques vers un nouveau puits contenant du milieu Near-5 glacé. Le faisceau de fibres est désormais prêt pour l'évaluation de la consommation d'oxygène.Les titrages de validation suivants sont réalisés à l'aide d'un graphique d'injection de titrage XI à deux chambres. Ces expériences peuvent être effectuées selon un protocole individuel ou incluses dans un protocole de titrage, selon l'objectif expérimental et diagnostique des études de respirométrie. L'ERO GRA 2K utilisé ici peut mesurer la concentration en oxygène.L'appareil est connecté à un ordinateur équipé du logiciel DAT Lab, ce qui permet de rapporter les variations de concentration en oxygène sous forme de mesures en temps réel de la consommation d'oxygène tout au long de l'expérience. Avant de placer les fibres cardiaques dans les chambres du XI greffon, ajouter 2,1 millilitres de miroir cinq dans les logements contenant les capteurs polaro graphiques d'oxygène ou POS. Lorsque les chambres sont fermées, deux millilitres de miroir cinq seront présents dans la chambre du XI greffon.Prévoir un temps suffisant pour la saturation à l'air et l'équilibrage du miroir cinq à 37 degrés Celsius. Une fois l'équilibrage terminé, placer les échantillons de fibres cardiaques dans le miroir cinq contenu dans les chambres de greffe XI agitées par des barres magnétiques en polyodine. Barres agitatrices revêtues de fluorure.Augmentez la concentration en oxygène des chambres GRAT à une valeur comprise entre 250 et 550 micromolaires à l’aide d’une seringue remplie d’oxygène. Attendez cinq à dix minutes afin que la concentration en oxygène se stabilise, en utilisant une seringue Hamilton de 10 microlitres. Ajoutez 10 microlitres de glutamate à deux molaire dans la chambre pour obtenir une concentration finale de 10 millimolaire.Ensuite, utilisez une seringue Hamilton séparée pour ajouter cinq microlitres de malate à 800 millimolaire afin d'obtenir une concentration finale de deux millimolaire dans la chambre. Ce titrage permet de déterminer la respiration soutenue par le complexe I en conditions basales. Le flux d'oxygène devrait se stabiliser environ cinq minutes après le titrage, ce qui permet de déterminer la consommation d'oxygène à l'état deux, correspondant à la consommation d'oxygène.En l'absence de DP après deux à cinq minutes de consommation d'oxygène stable, utiliser une microsyringe Hamilton de 25 microlitres pour ajouter 20 microlitres de 500 millimoles de DP afin d'obtenir une concentration finale saturante de cinq millimolaire. Cette concentration permet d'atteindre une saturation supérieure à 90 %, ce qui autorise la détermination de l'état maximal. Trois. La respiration mitochondriale via le complexe I autorise deux à cinq minutes supplémentaires de consommation d'oxygène stable.Ensuite, utilisez une microsyringe Hamilton de 10 microlitres pour ajouter cinq microlitres de cytochrome C à quatre millimolaire afin d'obtenir une concentration finale de 10 micromolaire. La concentration en oxygène à ce stade est utilisée pour effectuer une analyse de contrôle qualité de l'intégrité de la membrane mitochondriale externe. Après deux à cinq minutes supplémentaires de consommation d'oxygène stable, ajoutez un microlitre d'ACIN à quatre milligrammes par millilitre pour inhiber la synthase ATP.Cette étape de titrage sert à valider l'intégrité de la membrane interne mitochondriale. Après l'évaluation de l'oxyphosphorylation par méthode respirométrique, prélever l'échantillon pour la détermination du poids sec ou d'un marqueur mitochondrial. Ensuite, retirer le miroir numéro cinq des chambres en verre du XI Grat.Lavez les chambres au moins trois fois avec de l'eau distillée. Rincez ensuite les chambres au moins trois fois supplémentaires avec de l'éthanol à 100 %. Pour éliminer les inhibiteurs solubles dans l'éthanol, tels que l'oligomycine.Suivez par deux lavages supplémentaires avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, ajoutez de l’éthanol à 70 % et laissez-le imbiber les chambres de greffe XI pendant 30 minutes afin de les stériliser. Enfin, lavez les chambres contenant les POS au moins cinq fois avec de l’eau doublement distillée ; la consommation d’oxygène dans des fibres cardiaques correctement préparées est évaluée par le protocole de contrôle qualité, comme indiqué ; le rapport de contrôle respiratoire, ou RCR, représente le couplage entre la consommation d’oxygène et la phosphorylation oxydative dans les préparations de fibres perméabilisées.Le RCR est le taux de respiration à l'état trois par rapport à l'état deux, ou alternativement l'état trois divisé par l'état quatre ; des préparations bien couplées, comme celles du myocarde, donnent un RCR compris entre trois et six. Le titrage du cytochrome C est utilisé comme validation d'une préparation tissulaire adéquate. Le cytochrome C est une protéine située dans l'espace intermembranaire au niveau de la membrane interne mitochondriale.Lorsque la membrane externe des mitochondries est intacte, le cytochrome C endogène reste dans l'espace intermembranaire et la titration de cytochrome C exogène a un effet négligeable sur la respiration. En revanche, si la membrane externe des mitochondries est endommagée, le cytochrome C endogène peut être libéré de l'espace intermembranaire et inhibera la respiration jusqu'à l'ajout de cytochrome C exogène, permettant ainsi d'évaluer l'influence de facteurs pathologiques ou de stress expérimentaux sur l'intégrité de la membrane mitochondriale externe. L'ajout de CIN est utilisé pour évaluer les modifications de la respiration de fuite, qui correspond à la consommation d'oxygène n'apportant aucune contribution au DP. Les fibres sous contrôle de phosphorylation ou de type sauvage devraient être sensibles à l'ajout de CIN et présenter une réduction significative du flux d'oxygène.Un faible RCR et une sensibilité réduite à l'oligomycine, entraînant un flux d'oxygène relativement élevé, indiquent des lésions de la membrane mitochondriale interne durant la préparation. L'absence de réponse aux titrations de substrat, d'inhibiteur et de découplage, comme observée ici, peut indiquer des périodes d'incubation prolongées des faisceaux de fibres sasin et décapées dans les solutions RP et mirror five. Les travaux ultérieurs devraient minimiser les intervalles entre la mise à mort de l'animal et les mesures de consommation d'oxygène.Nous venons de vous montrer comment préparer des faisceaux de fibres cardiaques pour des mesures polarographiques. Il est important de se rappeler que lors de l'exécution de cette procédure, il faut faire preuve d'une extrême prudence lors de la séparation mécanique des fibres cardiaques. Voilà donc tout ce qu'il faut savoir.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

respirometric-oxidative-phosphorylation-assessment-saponin

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Le protocole suivant décrit la préparation et l’utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d’oxydation du glucose et des acides gras dans le cœur isolé du rat actif. Les méthodes utilisées pour l’analyse des échantillons et l’interprétation des données sont également abordées.

Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

Ce travail démontre la faisabilité d’une technique de spectroscopie par résonance magnétique du phosphore-31 in vivo (31PMRS) pour quantifier la capacité de phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) dans le muscle squelettique humain.

Phosphore-31 Spectroscopie par résonance magnétique: un outil de mesure In Vivo Capacité mitochondrial phosphorylation oxydative dans le muscle squelettique humain

Haute résolution de respirométrie est utilisé pour déterminer la consommation d'oxygène des mitochondries. Cette technique est simple de déterminer les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale »(I-IV) de la fréquence respiratoire, la capacité maximale du système de transport d'électrons mitochondriale, et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale.

Haute résolution Respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale dans perméabilisées et des cellules intactes

Ce protocole décrit le calorespirometry, la mesure directe et simultanée de dissipation de la chaleur et la respiration, qui fournit une approche non invasive pour évaluer le métabolisme énergétique. Cette technique est utilisée pour évaluer la contribution des voies aérobies et anaérobies à l’utilisation de l’énergie en contrôlant le flux d’énergie cellulaire totale.

Calorespirometry : Une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire

Ici, nous introduisons une méthode pour l'utilisation d'un cathéter optique intra-ventriculaire dans les cœurs perfus pour effectuer la spectroscopie absorbante à travers la paroi cardiaque. Les données obtenues fournissent des informations solides sur la tension de l'oxygène tissulaire ainsi que l'utilisation du substrat et le potentiel membranaire simultanément avec des mesures de performance cardiaque dans cette préparation omniprésente.

Cathéter de lumière à tir latéral intra-cardiaque pour la surveillance du métabolisme cellulaire à l'aide de la spectroscopie d'absorption transmurale des cœurs de mammifères perfusés

L’évaluation de la phosphorylation oxydative à l’aide de respiromètres à haute résolution est devenue une partie intégrante de l’analyse fonctionnelle des mitochondries et du métabolisme énergétique cellulaire. Ici, nous présentons des protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire à l’aide de respiromètres haute résolution à chambre et à microplaques et discutons des principaux avantages de chaque appareil.

La respirométrie à haute résolution pour évaluer la bioénergétique dans les cellules et les tissus à l’aide de respiromètres à chambre et à plaques

La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.

Évaluation de la fonction mitochondriale dans le nerf sciatique par respirométrie à haute résolution

Les chevaux ont une capacité d’exercice aérobique exceptionnelle, faisant du muscle squelettique équin un tissu important pour l’étude de la physiologie de l’exercice équin ainsi que de la physiologie mitochondriale des mammifères. Cet article décrit des techniques pour l’évaluation complète de la fonction mitochondriale dans le muscle squelettique équin.

Fluoro-respirométrie à haute résolution du muscle squelettique équin

L’analyse de la fonction mitochondriale des spermatozoïdes par respirométrie à haute résolution permet de mesurer la consommation d’oxygène des spermatozoïdes se déplaçant librement dans un système à chambre fermée. La technique peut être appliquée pour mesurer la respiration dans les spermatozoïdes humains, ce qui fournit des informations sur les caractéristiques et l’intégrité mitochondriales des spermatozoïdes.

Respirométrie à haute résolution pour évaluer la fonction mitochondriale chez les spermatozoïdes humains

Ici, nous décrivons une méthode complète pour mesurer la phosphorylation oxydative mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques perméabilisées fraîches à partir de muscles humains ou de souris. Cette méthode permet de quantifier en temps réel la respiration mitochondriale et d’évaluer la préférence pour le carburant et la flexibilité métabolique tout en préservant les réseaux mitochondriaux existants et l’intégrité de la membrane.

Mesure de la respiration mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques humaines et murines par respirométrie à haute résolution

Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour quantifier le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire des ventricules de poisson-zèbre adultes ex vivo afin de caractériser leur capacité métabolique oxydative et glycolytique.

Évaluation de l’activité métabolique des ventricules entiers régénérateurs de poisson-zèbre ex vivo à l’aide d’un test de flux extracellulaire

Découvrez comment évaluer la phosphorylation oxydative mitochondriale dans des fibres cardiaques perméabilisées à la saponine. Cette méthode de respirométrie haute résolution permet de mesurer précisément la fonction mitochondriale in situ.

Respirométriques évaluation phosphorylation oxydative dans la saponine perméabilisées fibres cardiaques

Explorer plus de vidéos