Hyperinsulinémique euglycémique-Clamp chez le rat conscient

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la sensibilité à l'insuline chez le rat conscient non entravé. Cela est réalisé en cathétérisant d'abord l'artère carotide gauche. Ensuite, la veine jugulaire droite est cathétérisée afin d'obtenir des résultats optimaux.

Les cathéters sont rincés quotidiennement afin de maintenir leur perméabilité pendant une période de récupération postopératoire de cinq jours. En fin de compte, les résultats obtenus grâce au clamp hyperinsulinémique euglycémique permettent de déterminer les débits d'infusion de glucose au niveau de l'organisme entier. Le principal avantage de cette technique réside dans l'obtention de mesures directes des débits d'élimination du glucose au niveau de l'organisme entier à des concentrations élevées d'insuline physiologique.

Les cathéters artériel et veineux doivent être préparés avant l'intervention chirurgicale. Le cathéter doit avoir des extrémités émoussées, être rempli de solution saline héparinisée et stérilisé à l'éthanol, avec un fil de contention solidement fixé à 2,7 ou 3,2 centimètres d'une extrémité, respectivement pour les cathéters artériel et veineux. Des rats mâles adultes de type Sprague-Dawley d'environ 300 grammes sont utilisés dans cette procédure.

Enregistrez le poids initial de l'animal et utilisez ce poids pour surveiller le gain de poids après la chirurgie. Travaillez dans un domaine chirurgical aseptique. Anesthésiez le rat avec 3 % d'isoflurane en le plaçant dans une boîte anesthésique.

Transférez l'animal hors de la zone chirurgicale et préparez le site d'incision en éliminant les poils autour du cou et des épaules. Une fois les poils retirés, placez l'animal dans un cône nasal afin de maintenir l'anesthésie avec environ 2 % d'isoflurane. Immobilisez l'animal sur la table chirurgicale.

Veillez à ce que le rat soit complètement anesthésié en vérifiant la présence de réflexes plantaires ou oculaires. Nettoyez le site de l'incision avec de l'éthanol à 70 %, suivi d'une friction au Betadine, puis à nouveau avec de l'éthanol à 70 %. La première étape de la procédure consiste à pratiquer une petite incision médiane verticale de 10 millimètres au-dessus du sternum.

Utilisez des pinces courbes de microdissection pour disséquer par émoussage le tissu et exposer le muscle sterno-mastoïdien gauche. Réfléchissez ce muscle afin de mettre au jour environ un centimètre de l'artère carotide gauche. Placez les pinces de microdissection sous l'artère carotide pour la maintenir en place tout en écartant délicatement les tissus conjonctifs.

Il est important d'isoler le nerf vague de l'artère sans endommager ni l'artère ni le nerf. Utilisez une suture en soie stérile 4-0 pour ligaturer l'extrémité céphalique. Pincez le vaisseau avec des pinces microchirurgicales à dissection crantées.

Percez le ligature. Terminez par un adaptateur de prélèvement multiple ven eject de calibre 21. Retirez le bouchon en acier inoxydable du cathéter et utilisez un introduiseur de cathéter stérile pour guider dans l'artère.

Utilisez une pince pour vous assurer que le cathéter est bien en place. Partiellement. Ouvrez la pince de dissection microchirurgicale, pincez l'artère et continuez à insérer le cathéter jusqu'au niveau de la bille. À ce stade, l'extrémité du cathéter doit se trouver dans l'arc aortique.

Placer deux sutures sous la bille et une au-dessus, puis rincer la ligne avec une solution saline héparinée à 10 unités par millilitre. Pour confirmer que le cathéter pourra prélever, rebrancher l'extrémité externe du cathéter à l'aide d'un bouchon en acier inoxydable. Ensuite, disséquer émoussément les tissus afin d'exposer la veine jugulaire externe droite, isoler soigneusement la veine et ligaturer la céphalique.

Terminer par un point de suture en soie. Perforer la veine avec une aiguille de calibre 21. Éjecter l'adaptateur d'échantillonnage multisélectif.

Retirez le bouchon en acier inoxydable du cathéter et utilisez un introduiseur de cathéter stérile pour l'insérer jusqu'à la bille. Fixez deux points de suture sous la bille et un au-dessus. Puis rincez la ligne avec une solution saline glacée contenant 10 unités par millilitre d'héparine.

Pour confirmer que le cathéter pourra prélever, rebrancher l'extrémité externe du cathéter avec un bouchon en acier inoxydable à l'aide d'une aiguille courte de calibre 14 passée sous la peau, puis pratiquer une incision dans le dos, entre les omoplates. Ensuite, faire passer les cathéters à travers l'aiguille afin qu'ils émergent par le dos du rat. Environ quatre centimètres de chaque cathéter doivent être visibles.

Coupez 0,5 centimètre de tube médical Tigon S 50 HL et placez-le autour des deux cathéters externes. Fixez-le avec du ruban adhésif bleu pour les veines et rouge pour les artères. Vérifiez à nouveau les cathéters pour vous assurer de leur perméabilité, puis rincez-les et remplissez-les avec une solution saline héparinée à 150 unités par millilitre afin d'éviter la formation de caillots.

Fermer toutes les incisions avec un fil de soie 3-0. Placer le rat en position prona sur une cage propre préalablement réchauffée, avec de la nourriture facilement accessible. Une fois que le rat a retrouvé une capacité locomotrice complète et qu’il est pleinement éveillé, le réintroduire dans sa cage d’origine.

Laisser le rat se remettre pendant trois à cinq jours en surveillant quotidiennement toute infection, douleur et variation de poids. Il est important de maintenir la perméabilité du cathéter tout au long de l'étude. Chaque jour suivant l'intervention, remplir des seringues de un millilitre à embout conique avec une solution saline héparinée à 150 unités par millilitre et les boucher avec une aiguille courte de 22 gauge.

L'aiguille contondante est insérée dans 20 centimètres de tube PE 50 muni à l'autre extrémité d'un raccord en acier inoxydable de calibre 23. Veillez à éliminer toutes les bulles d'air de la ligne. Pincez la ligne artérielle externalisée du rat à l'aide de pinces hémostatiques, juste en dessous du bouchon.

Retirer le bouchon en acier du cathéter à l’aide d’une autre pince hémostatique. Insérer le raccord de tubulure relié à la seringue dans la ligne artérielle, puis relâcher les pinces hémostatiques obstruant le cathéter artériel externalisé. Ensuite, aspirer le sang artériel présent dans le cathéter vers l’intérieur de la seringue.

Si le cathéter ne s'aspirationne pas facilement, il peut être nécessaire de pousser très doucement une petite quantité de solution à travers le cathéter afin de déloger l'extrémité. Le cathéter est alors considéré comme dégagé. Lorsque le sang atteint la seringue, pincez le tube P 50 près de la seringue d'un millilitre et jetez la seringue.

Remplacez par une nouvelle seringue remplie de solution saline glacée héparinée. Ouvrez le clamp du tube et, tout en tenant la nouvelle seringue droite, tapez doucement sur la seringue pour faire remonter les bulles d'air vers le haut et les éliminer de la ligne. Injectez la solution saline héparinée jusqu'à ce que la ligne du cathéter soit claire et débarrassée du sang.

Pincez la ligne artérielle juste en dessous du raccord du tube. Retirez le connecteur de la seringue de la ligne du cathéter artériel et remplacez-le par le bouchon en acier inoxydable. Relâchez les pinces hémostatiques obstruant le cathéter artériel externe.

Répétez cette procédure pour la ligne veineuse. En raison de la faible pression veineuse, le prélèvement peut ne pas être possible. En général, si la solution saline héparinée peut être administrée avec une résistance minimale, il est probable que le cathéter soit bien positionné dans la veine.

Avant de commencer la procédure, les animaux doivent être pesés, les solutions préparées et le dispositif de serrage assemblé. Une fois l'animal pesé et la perméabilité du cathéter confirmée, placez-le dans un petit récipient contenant de la litière qui limite, sans restreindre, ses mouvements. Les rats utilisés dans cette étude sont privés de nourriture pendant au moins cinq heures et ont atteint les critères de gain de poids postopératoire. Le poids du rat détermine la quantité d'insuline requise ici.

Quatre milliunités par kilogramme par minute sont administrées à un débit de deux microlitres par minute. Préparez une solution de dextrose à 50 % et assurez-vous qu'il y a suffisamment des deux solutions pour durer environ deux heures ; ici, des seringues de trois millilitres sont utilisées. Vous êtes maintenant prêt à assembler l'appareil de fixation.

Installez les lignes et les pompes d'infusion comme indiqué ici. Placez les seringues de glucose et d'insuline sur la pompe à seringue. Serrez les lignes et laissez le rat se détendre pendant 30 minutes avant de commencer l'expérience.

Pour commencer la procédure, prélevez un échantillon de base de l'insuline et un échantillon d'hématocrite ; le prélèvement de l'hématocrite assure le maintien du volume sanguin tout au long de l'expérience. En général, les taux d'hématocrite ne devraient pas diminuer de plus de 10 % par rapport à la valeur initiale. Obtenez un échantillon de glucose de base et déterminez le taux de glucose à fixer.

Ici, nous effectuons le clamp à une glycémie de 5 millimolaire. Après chaque prélèvement sanguin, rincer la ligne artérielle avec un petit volume de sérum physiologique hépariné à 10 unités par millilitre afin d'éviter la formation de caillots. Une fois le niveau de glucose à clampler déterminé, commencer l'infusion de la solution d'insuline.

Enregistrez la glycémie toutes les cinq à dix minutes et ajustez le débit d'infusion de glucose selon les besoins jusqu'à l'obtention d'un état d'équilibre. Ce processus repose généralement sur des essais successifs et peut durer de 30 minutes à plus de deux heures. La quantité de glucose nécessaire pour maintenir la glycémie dépend du protocole expérimental.

Les espèces et conditions présentes afin d'être considérées comme stabilisées exigent que trois mesures consécutives se situent dans une plage définie. Trois mesures différant d'environ un millimolaire l'une de l'autre impliquent que les taux de glucose ont atteint un état stable. Le débit d'infusion de glucose nécessaire pour maintenir la glycémie pendant une période de 30 minutes peut être enregistré, et des échantillons sanguins supplémentaires peuvent être prélevés durant ce laps de temps, au minimum.

Un deuxième échantillon de plasma pour l'insuline et l'hématocrite doit être prélevé une fois la procédure de clamp terminée. Les animaux peuvent être utilisés pour des tests supplémentaires ou euthanasiés afin de prélever les tissus pour une analyse ultérieure. Selon l'animal, les lignes de cathéter peuvent rester perméables de cinq à sept jours lorsqu'elles sont correctement réalisées.

La procédure de serrage peut mesurer la sensibilité à l'insuline à l'état stationnaire. Il est essentiel d'enregistrer les taux d'insuline et de glucose, ainsi que les débits d'infusion de glucose et les valeurs d'hématocrite. L'état stationnaire est atteint lorsque les taux de glucose restent compris dans une plage d'un millimolaire l'un par rapport à l'autre sur une période de 30 minutes.

Le débit d'infusion de glucose indique le niveau de glucose exogène nécessaire pour maintenir une glycémie stable, lorsque cela est possible ; ce débit doit être représenté en fonction du temps plutôt qu'en un seul point temporel moyen. Les concentrations d'insuline à jeun et sous clampage doivent être indiquées. Ces mesures confirment que l'insuline a été correctement administrée et permettent de détecter d'éventuelles différences de réponse à l'insuline entre les groupes traités. La mesure de l'hématocrite au départ, puis à nouveau après la procédure, assure que les taux n'ont pas diminué de plus de 5 % par rapport à la valeur initiale au cours de l'expérience suivant cette procédure.

D'autres méthodes, comme l'administration de traceurs isotopiques, peuvent être utilisées pour évaluer l'utilisation du glucose au niveau de l'organisme entier et spécifique aux tissus.