Plaque de microtitrage biofilm essai de formation
30 janvier 2011
Le test décrit un moyen rapide pour mesurer la formation de biofilm au début de bactéries et de champignons. Cette méthode utilise une plaque de microtitration comme substrat pour la formation de biofilms microbiens et le biofilm est visualisée en utilisant la souche de cristal violet. Le test fournit soit un test qualitatif ou quantitatif pour la formation de biofilm tôt.
L'objectif général de cette procédure est d'établir et d'étudier des biofilms dans une microplaque. Cela est réalisé en ajoutant d'abord une culture bactérienne dans une plaque de 96 puits. Ensuite, la culture est incubée à la température et pendant le temps appropriés, selon le micro-organisme, afin de colorer le biofilm.
Du violet de cristal est ajouté dans chaque puits contenant des bactéries, puis les bactéries sont lavées. Enfin, les puits sont photographiés et les bactéries sont quantifiées. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'accumulation et la formation de biofilms au fil du temps par la mesure du violet de cristal.
Le principal avantage de cette méthode est qu'elle permet aux chercheurs d'évaluer rapidement la formation de biofilms chez des organismes bactériens et fongiques. Elle peut également être adaptée pour des criblages génétiques à haut débit ou pour identifier de nouveaux composés thérapeutiques inhibant la formation de biofilms. Préparez une culture de cinq millilitres ensemencée la veille de la souche sauvage de pseudomonas, d'aerogen ou d'une souche mutante.
Dans du milieu LB, diluez 10 microlitres de culture dans un millilitre de milieu minimal M 63 frais, supplémenté en magnésium, sulfate, glucose et acides casamino. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez 100 microlitres de la culture diluée dans des puits distincts d’une plaque ronde à 96 puits. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant quatre à 24 heures afin de permettre la formation de biofilm.
Une fois les biofilms formés, retirez la plaque de l'incubateur et jetez les surnageants de culture en retournant la plaque et en secouant pour éliminer le liquide. Ensuite, immergez délicatement la plaque dans un petit récipient d'eau afin de rincer les cellules non liées ou les composants du milieu éventuellement responsables d'une coloration de fond. Secouez l'eau, essuyez la plaque et répétez le lavage.
Une fois la plaque propre, ajouter 125 microlitres par puits d'une solution de violet de crésyl à 0,1 %. Pour colorer les cellules, incuber la plaque à température ambiante pendant 10 à 15 minutes.
Ensuite, laver la plaque trois ou quatre fois comme indiqué précédemment. Après le dernier lavage, sécher soigneusement la plaque en l'essuyant vigoureusement sur une pile de serviettes en papier afin d'éliminer le liquide excédentaire, poser la plaque à l'envers et la laisser sécher à l'envers pendant quelques heures. Une fois la plaque sèche, les puits peuvent être photographiés à l'aide d'un appareil photo numérique pour évaluer la qualité des biofilms.
Comme illustré ici, les bactéries mobiles telles que Pseudomonas aeruginosa à gauche et Pseudomonas fluorescens à droite ont tendance à former des biofilms au niveau de l'interface air-liquide lors de la croissance du biofilm. En revanche, les bactéries de type Staphylococcus oris, non mobiles, forment des biofilms au fond des puits. Afin de quantifier les biofilms, ajouter d'abord 125 microlitres d'acide acétique à 30 % dans chaque puits, y compris un puits témoin contenant uniquement de l'acide acétique, puis incuber la plaque à température ambiante pendant 10 à 15 minutes afin de permettre la solubilisation du violet de crésyl retenu par les biofilms.
Ensuite, transférez 125 microlitres de colorant solubilisé de chaque puits vers une nouvelle plaque microtitration 96 puits à fond plat. À l'aide d'un lecteur de plaques, quantifiez l'absorbance de chaque puits à une longueur d'onde de 550 nanomètres. La concentration de violet de cristal dans chaque puits est proportionnelle au nombre de cellules présentes dans le biofilm.
Ce graphique montre une quantification de la formation et de l'accumulation de biofilm par Pseudomonas fluorescens au fil du temps lors d'une incubation à 37 degrés Celsius. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer un test de biofilm en microplaque de 96 puits, utilisé conjointement avec d'autres méthodes telles que la microscopie. Cette technique peut contribuer de manière significative à notre compréhension de la formation des biofilms.
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Aperçu
Cet essai décrit une méthode rapide pour mesurer la formation précoce de biofilm chez les bactéries et les champignons en utilisant une plaque de microtitration. Le biofilm est visualisé par coloration au violet de crésyl, permettant une analyse à la fois qualitative et quantitative.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Recherche sur les biofilms
- Développement de tests
Contexte
- Les biofilms sont des communautés de micro-organismes qui adhèrent aux surfaces.
- L'étude de la formation des biofilms est essentielle pour comprendre le comportement microbien.
- Le violet de cristal est un colorant couramment utilisé pour visualiser les biofilms.
- Cette méthode permet une évaluation rapide du développement des biofilms.
Objectif de l'étude
- Mettre en place un test fiable pour la formation précoce de biofilms.
- Quantifier l'accumulation de biofilm au fil du temps.
- Faciliter l'étude des interactions microbiennes dans les biofilms.
Méthodes utilisées
- Ajouter la culture bactérienne dans une plaque microtitration à 96 puits.
- Incuber la culture à la température et pendant le temps appropriés.
- Ajouter le violet de crésyl pour colorer le biofilm.
- Laver les puits et prendre une photographie pour quantifier la formation du biofilm.
Résultats principaux
- Les résultats montrent l'accumulation de biofilms au fil du temps.
- Des données quantitatives peuvent être obtenues à partir des mesures au violet de crésyl.
- Le test permet une visualisation claire de la formation des biofilms.
Conclusions
- Cette méthode est efficace pour l'étude de la formation précoce des biofilms.
- Elle peut être appliquée à diverses espèces bactériennes et fongiques.
- Le test améliore la compréhension des dynamiques microbiennes des biofilms.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Le test de formation de biofilm en microplaque permet une évaluation rapide et à haut débit du développement précoce des biofilms, soutenant ainsi la validation de cibles dans la découverte d'agents antimicrobiens. En quantifiant l'accumulation de biofilm par coloration au violet de crésyl, cette méthode fournit des données reproductibles et quantitatives qui aident à réduire les risques associés aux candidats thérapeutiques ciblant l'adhésion microbienne et la persistance. Cette approche évolutive est applicable à divers systèmes bactériens et fongiques, facilitant le criblage précoce de composés modulant les biofilms.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en identifiant les gènes et facteurs nécessaires à l'initiation du biofilm, tels que les adhésines, les pili et les voies du di-GMP cyclique.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à des criblages d'invalidation fonctionnelle chez des souches microbiennes dans des conditions standardisées.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en distinguant les composés qui inhibent la formation précoce du biofilm de ceux qui n'ont aucun effet.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes microbiens validés pour le criblage de composés en aval en établissant des paramètres reproductibles de formation de biofilm.
- Valeur opérationnelle : Assure la normalisation des tests grâce à des étapes standardisées d'incubation, de coloration et de quantification utilisant un format de plaque 96 puits.
- Extensibilité : Met en évidence la préparation au criblage et la réutilisation de la plateforme pour des criblages génétiques et des bibliothèques de composés sur plusieurs souches microbiennes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence translationnelle : Relie les données sur la formation précoce du biofilm aux profils de résistance phénotypique, soutenant une détection mécanistique des risques liés aux candidats antimicrobiens.
- Continuité préclinique : Permet des décisions d'orientation fondées sur les risques en associant l'inhibition du biofilm in vitro à la tolérance aux antibiotiques et aux effecteurs immunitaires.
- Alignement des biomarqueurs : Soutient le développement de biomarqueurs translationnels grâce à des paramètres quantifiables corrélés aux phénotypes de tolérance associés au biofilm.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'identification de la cible à l'optimisation du composé précurseur, en particulier pour les programmes anti-infectieux ciblant la résistance médiée par les biofilms.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses concernant les voies d'adhésion microbienne et de formation de biofilms par perturbation génétique et chimique.
- Criblage : Décrit la préparation du test grâce à la formation normalisée de biofilms et à la quantification par violet de crésyl, permettant une évaluation fiable des composés.
- Analytique : Met en évidence des mesures quantitatives d'absorbance à 550 nm, permettant la comparaison de la biomasse de biofilm entre différentes conditions et souches.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les données précoces d'inhibition du biofilm et leur pertinence préclinique en modélisant les mécanismes de tolérance observés dans les infections chroniques.
- Réutilisation en entreprise : Présente la méthode comme une plateforme de criblage réutilisable pour des programmes antimicrobiens, antifongiques et antibiofilms, appliquée à plusieurs modèles de pathogènes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation de cibles grâce à une réduction mesurable de la formation de biofilm après une intervention génétique ou pharmacologique.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité dans des formats 96 puits pour des applications à haut débit.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'orientation (go/no-go) lors de l'identification de composés candidats, en réduisant les faux positifs grâce à une quantification orthogonale du biofilm.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque des composés selon leur inhibition dose-dépendante de la formation précoce de biofilm.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microbiologie en matière de technique stérile, de préparation des cultures et de manipulation des biofilms.
- Suppose l'accès à des lecteurs de plaques capables de mesurer l'absorbance à 550 nm et à des microplaques standards de 96 puits.
- Exige une standardisation entre équipes des durées d'incubation, des étapes de lavage et des protocoles de coloration afin de minimiser la variabilité entre puits.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'extension à des organismes non modèles ou à des champignons possédant des propriétés d'adhésion différentes.
- Comprend des limites pratiques telles que l'impossibilité de modéliser l'architecture des biofilms matures ou les phénotypes dépendants du flux, comme indiqué dans la source.
