Name: Détection des métalloprotéinases matricielles fonctionnelle par zymographie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez la détection des métalloprotéinases matricielles par zymographie sur gel de gélatine. Cette méthode permet d'analyser l'activité enzymatique dans les surnageants de culture cellulaire et les fluides biologiques.

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Nous tenons à remercier le Dr S. Ressler (Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Baylor College of Medicine) pour suggérer l&#39;utilisation de protéines de concentrateurs d&#39;augmenter la concentration de MMP dans les surnageants de culture cellulaire. Ce projet a été soutenu par des subventions du Fonds de Mme Clifford Elder Graham White de recherche dotées et le NIH / NIAMS (AR059838) à CB. Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.

1. Chargement et exécution du gel <ol><li> Tous les échantillons doivent être préparés de manière adéquate afin de maintenir la fonction des enzymes et utilisé immédiatement après la collecte ou conservés congelés à -80 ° C. Les échantillons ne doivent pas contenir d'agents réducteurs (par exemple, une β-mercaptoéthanol) ou être bouillie avant le gel. </li><li> Ouvrir le sachet contenant un gel à l'intérieur d'une cassette, rincer la cassette avec de l'eau déminéralisée. <ul><li> Retirer le ruban de protection de la partie inférieure de la cassette et le peigne du haut du gel. </li><li> Rincer les puits trois fois avec le tampon de fonctionnement (diluée à 1X dans de l'eau déminéralisée). </li><li> Placer le gel dans la mini-cellule, assurant que le petit côté de la cassette visages vers l'intérieur. Verrouiller en place avec le Wedge Tension Gel. La mini-cellule permet d'exécuter un ou deux gels en parallèle. </li><li> Remplissez le haut (intérieur) de chambre avec 1X tampon courant au dessus du niveau des puits, vérifiez s'il ya des fuites. En cas de fuite, éliminer le tampon et de repositionner le gel. </li><li> Remplir la chambre basse avec 1X tampon. </li></ul></li><li> Charge 10 uL du marqueur moléculaire de la protéine dans un puits. <ul><li> Mélanger une quantité égale de gel-tampon de chargement et de l'échantillon et la charge dans les puits du gel en utilisant un gel des conseils de chargement (changé entre chaque échantillon). Ces puits peuvent être chargés avec un maximum de 20 uL totale. </li></ul></li><li> Placer le couvercle sur la cellule et de mini-connecter les cordons d'électrode à l'alimentation. Mettre l'alimentation sous tension et réglez-le fonctionner à 125 V constante pendant 90 minutes. Vérifiez la formation de petites bulles sur le fil de la chambre basse, indiquant la circulation du courant. </li><li> Lorsque vous exécutez votre premier gel, de suivre les progrès de la migration toutes les 15 minutes, en utilisant le bleu de bromophénol inclus dans le tampon de chargement comme un indicateur. Laissez le long de gel jusqu'à ce que le colorant indicateur atteint le bas du gel. </li></ol> 2. Renaturation et de développement du gel <ol><li> Pour chaque gel, préparer 100 ml de tampon 1X renaturation et 200 mL de tampon de dénaturation, à la fois dans de l'eau déminéralisée. </li><li> Lorsque le colorant bleu de bromophénol suivi atteint le bas du gel, interrupteur de l'alimentation hors tension, ouvrez la cellule Mini-, et enlever le gel. Séparez les deux côtés de la cassette en utilisant le couteau gel (ou d'une spatule de pesage). Couper un coin pour marquer la direction du gel. </li><li> Retirer délicatement le gel de la cassette et placer dans un récipient avec 100 ml de tampon de renaturation. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Retirer le tampon de renaturation et ajouter 100 ml de tampon pour développer le gel. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Retirez le tampon en développement et ajouter 100 ml de tampon plus de développement pour le gel. Incuber une nuit (16-18 heures) à 37 ° C. </li><li> Retirez le tampon en développement et rincer trois fois (5 minutes chacun) avec de l'eau déminéralisée sous agitation douce à température ambiante. </li><li> Balayage du gel pour sauver le positionnement exact des bandes standards de protéines car elles deviendront moins ou pas visible après coloration du gel. </li><li> Tache le gel en ajoutant 20 mL de SimplyBlue Safestain au gel. Incuber pendant 1 heure à température ambiante sous agitation douce. </li><li> Retirez le SafeStain SimplyBlue et de-tacher le gel dans 100 mL ou plus d'eau déminéralisée pendant une heure à température ambiante sous agitation douce. </li><li> Pour de meilleurs résultats, remplacez l'eau déminéralisée frais et incuber pendant une heure ou plus à température ambiante sous agitation douce. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Retirer délicatement le gel de l'eau et le placer dans une feuille de plastique protectrice. </li><li> Analyser le gel avec une résolution de 300 dpi ou plus. Enregistrez l'image au format TIFF (figure 1A). </li><li> Mesure des intensités groupe avec ImageJ (ou autre logiciel similaire). <ul><li> Ouvrez le fichier TIFF dans ImageJ (figure 1A). </li><li> Visualisez en noir et blanc en sélectionnant "Image&gt;&gt; Type 8-bit" (figure 1B). </li><li> Utilisez l'outil de sélection rectangulaire aux lignes de la première bande, dessinant un rectangle au moins deux fois supérieure à ce qu'elle est large (ce qui est une exigence de logiciels). </li><li> Appuyez sur "1" ou sélectionnez "Analyser&gt; Gels&gt; Sélectionner la voie d'abord» et la bande seront présentées. </li><li> Un nouveau rectangle apparaît, déplacez-le vers la bande suivante et sélectionnez «Analyser&gt; Gels&gt; Sélectionner ruelle à côté". Répétez jusqu'à ce que toutes les bandes sont sélectionnés (figure 1B). </li><li> Appuyez sur "3" ou sélectionnez "Analyser&gt; Gels voies&gt; Terrain" pour générer le tracé le profil de chaque bande (figure 1C). </li><li> Utilisez la sélection de la ligne droite (devrait déjà être sélectionné automatiquement) pour tracer des lignes de base de sorte que le pic d'intérêt est un espace entièrement clos. </li><li> Sélectionnez l'outil baguette magique et cliquez à l'intérieur de chaque pic pour le sélectionner. </li><li> Sélectionnez "Analyser&gt; Gels pics&gt; Label" pour obtenir une table avec la région pour chaque pic sélectionné. Ces données peuvent être tracées en tant que tels (F1D IGURE) ou peut être normalisée à la valeur d'une bande choisie. Cette normalisation est particulièrement important lorsque la mise en commun des valeurs de plusieurs gels de reproduire pour déterminer la signification statistique des résultats. </li></ul></li></ol> 4. Les résultats représentatifs Nous montrons un gel à 11 puits chargés avec différents surnageants de culture cellulaire contenant différentes quantités de MMP-2 (figure 1A). L'observation directe de ce gel montre des différences évidentes dans les concentrations de MMP-2 entre certains des puits. Par exemple, il est clair que les puits n ° 4 et 5 contiennent beaucoup plus que de la MMP-2 et n ° 11 ou même bien # 10. Pour la quantification objective des bandes, nous avons utilisé la densitométrie avec le logiciel ImageJ (figure 1B-D), confirmant une différence d'environ 4 fois dans la MMP-2 et des montants compris entre 11 et # # puits 4 et 5 et une différence d'environ 2 fois dans MMP-2 et des montants compris entre # 10 et # puits 4 et 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Détection de la MMP-2 par zymographie gélatine. Une image, scannée d'un gel de gélatine. Nombre des puits sont indiqués en haut du gel. B, le gel de même que dans une montre en noir et blanc d'une densitométrie. Chaque bande a été sélectionné avec un rectangle dans ImageJ. C, deux exemples de profils de densitométrie pour le gel représenté en A et B (bandes # 4 et # 11). Une ligne droite a été élaboré à la base de chaque pic de créer une zone fermée. D, Terrain des domaines de pointe pour le gel représenté en A et B avant (à gauche) et après (à droite) la normalisation de la densité de la bande n ° 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Ce chiffre montre comment zymographie peut être utilisé comme une technique semi-quantitative. Nous avons chargé des dilutions en série (les étapes de 1:1 dilutions) dans 7 puits consécutifs et mesuré la densité de la bande pour les deux pro-MMP-2 et MMP-2.

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
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</ol>

Nous avons démontré comment effectuer une analyse des zymographique MMP-2 dans les surnageants de culture cellulaire. La quantité d&#39;échantillon à charger sur un gel doit être déterminée empiriquement en fonction de l&#39;origine et la MMP d&#39;intérêt. Chargement trop peu va empêcher la détection pendant le chargement trop peut conduire à une saturation car il ya tellement seul substrat une protéase peuvent digérer dans le domaine de la bande. Si nécessaire, l&#39;échantillon peut être dilué dans de l&#39;eau déminéralisée avant de les mélanger avec le tampon de chargement ou le temps de développement peuvent réduire d&#39;une nuit à 4 heures. Il est également possible de concentrer les protéines dans une solution utilisant des concentrateurs (par exemple le numéro de catalogue Millipore UFC803024). Si les bandes restent à peine visible, il peut être nécessaire de développer les gels pour une plus longue période de temps, même jusqu&#39;à 48 heures. Lors de la préparation des échantillons à partir de surnageants de culture de tissus, il convient de noter que sérum de veau fœtal (et autres sérums) contient les MMP qui peuvent affecter les résultats. Pour cette raison, nous recueillons l&#39;ensemble de nos surnageants après culture dans un milieu sans sérum. Les lavages décrits aux paragraphes 2.9 et 2.10 du protocole sont nécessaires pour supprimer le fond coloration des bandes digérées. Fois plus de temps lavez va supprimer plus de fond, mais aussi de baisser la coloration du substrat à travers le gel. Si les temps de lavage plus long sont nécessaires, nous vous conseillons de balayage du gel de toutes les quelques heures pour choisir le scanner avec le meilleur contraste. Cette technique peut être utilisée pour détecter les autres MMPs. Par exemple, la MMP-9 peuvent être détectés sur des gels de gélatine, et aussi dans une moindre mesure de MMP-1, MMP-8 et MMP-13 que la gélatine n&#39;est pas leur substrat préféré. MMP-1 et MMP-13 sont les meilleurs détecté sur zymographie collagène tout en caséine est le substrat préféré pour la MMP-11 et permet également la détection de la MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 et MMP-13 9. MMP-7 (matrilysine) et collagénases (MMP-1 et MMP-13) sont difficiles à détecter quand il est présent à de faibles niveaux de la caséine ou des gels de gélatine. Ajout de l&#39;héparine à l&#39;échantillon au moment du chargement du gel améliore significativement la limite de détection de la MMP-7. Pour MMP-1 et MMP-13, l&#39;héparine doit être ajouté au gel après la course électrophorétique est déjà en cours 12. Depuis zymographie mesures d&#39;activité enzymatique après dénaturation et la renaturation des enzymes, il permettra de mesurer l&#39;activité de toutes les MMP présents dans l&#39;échantillon. Ce sont des enzymes, des pro-enzymes, les enzymes et lié à des inhibiteurs endogènes (par exemple, TIMP-2). Il est cependant possible de déterminer le niveau d&#39;activation de MMP dans l&#39;échantillon en comparant la densité de la bande de l&#39;enzyme active et de celle du pro-enzyme, ce qui aura un poids légèrement supérieur moléculaire. Zymographie n&#39;est souvent pas suffisante pour identifier une MMP. Comparaison du niveau de migration d&#39;un RPM avec connues standards de poids moléculaire ne l&#39;aide dans l&#39;identification, mais il convient de noter que certaines de ces normes contiennent un agent réducteur et que lorsqu&#39;ils sont utilisés dans des conditions non réductrices, ils peuvent indiquer des poids moléculaires différents 9. Une option consiste à charger une MMP solubles recombinantes sur le même gel que les échantillons d&#39;essai. Les MMP peuvent toutefois être associés à d&#39;autres protéines, induisant un changement de poids moléculaire apparent. Inhibiteurs de MMP sélectifs peuvent être ajoutés au gel (ou partie d&#39;un coupé dans la moitié de gel) pendant l&#39;incubation dans un tampon de développement comme outils pharmacologiques à l&#39;identité de la MMP de interest.A seconde technique (Western Blot, immunocytochimie, ou ELISA) est recommandée pour aider à l&#39;identification de la MMP d&#39;intérêt. Il est à noter que les limites de détection pour Western Blot sont souvent bien inférieurs à ceux des gels zymographique, pouvant conduire à de faux résultats négatifs lors de l&#39;utilisation de cette technique.

<table><tbody><tr><td>Appareil d'électrophorèse Xcell SureLock Mini-Cell avec marquage CE</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation électrique (modèle 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Gels zymogrammes de gélatine Novex 10 %, 1,0 mm, 12 puits</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Colorant bleu pour tampon de charge des gels</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de chargement pour gels</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>Standard de poids moléculaire des protéines</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de migration Novex Tris-Glycine-SDS</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de renaturation zymogramme Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de développement zymogramme Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>Colorant SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Scanner Epson Perfection 4490 Photo</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>Rédigé par W. Rasband, NIH/NIMH</td></tr></tbody></table>

détection des métalloprotéinases matricielles fonctionnelle par zymographie

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Les métalloprotéinases matricielles (MMP) sont des endopeptidases contenant du zinc. Ils dégradent les protéines par clivage des liaisons peptidiques. Plus de vingt MMP ont été identifiés et sont séparés en six groupes en fonction de leur structure et leur spécificité de substrat (collagénases, gélatinases, le type de membrane [MT-MMP], stromélysines, matrilysins, et autres). Les MMP jouent un rôle crucial dans l&#39;invasion cellulaire, la dégradation du cartilage, le remodelage des tissus, cicatrisation des plaies, et l&#39;embryogenèse. Ils participent donc à la fois dans les processus normaux et dans la pathogenèse de plusieurs maladies, telles que la polyarthrite rhumatoïde, le cancer ou maladie pulmonaire obstructive chronique 1-6. Ici, nous allons nous concentrer sur la MMP-2 (gélatinase A, collagénase de type IV), une MMP largement exprimé. Nous allons démontrer comment détecter la MMP-2 dans les surnageants de culture cellulaire par zymographie, une couramment utilisé, une technique simple, et pourtant très sensible d&#39;abord décrite en 1980 par C. Heussen et EB Dowdle 7-10. Cette technique est semi-quantitatif, il peut donc être utilisée pour déterminer les niveaux de MMP dans les échantillons de test lorsque les concentrations de MMP connus recombinant sont chargés sur le même gel 11. Les solutions contenant les MMP (par exemple, les surnageants de culture cellulaire, l&#39;urine ou le sérum) sont chargés sur un gel de polyacrylamide contenant du sulfate de sodium dodécyl (SDD; pour linéariser les protéines) et de la gélatine (substrat pour MMP-2). Le tampon de l&#39;échantillon est conçu pour augmenter la viscosité de l&#39;échantillon (pour faciliter le chargement du gel), fournissent une teinture de suivi (bleu de bromophénol, à surveiller la migration de l&#39;échantillon), fournir des molécules dénaturant (pour linéariser les protéines), et de contrôler le pH de l&#39;échantillon. Les protéines sont alors autorisés à migrer sous un courant électrique dans un tampon de migration conçu pour fournir un taux de migration constante. La distance de migration est inversement corrélée avec le poids moléculaire de la protéine (petites protéines se déplacer plus rapidement à travers le gel de protéines de grande taille et donc ne migrent plus loin dans le gel). Après migration, le gel est placé dans un tampon de renaturation des protéines pour permettre de retrouver leur structure tertiaire, nécessaires à l&#39;activité enzymatique. Le gel est ensuite placé dans un tampon de développement conçu pour permettre à la protéase à digérer son substrat. Le tampon contient également le développement p-aminophénylmercurique acétate (AFPA) pour activer le non-protéolytiques pro-MMP en MMP actives. La prochaine étape consiste à coloration du substrat (gélatine dans notre exemple). Après le lavage l&#39;excès de colorant hors gel, les zones de la digestion de protéase apparaissent comme des bandes claires. Le plus clair de la bande, le plus concentré de la protéase qu&#39;il contient. Intensité de coloration de bande peut alors être déterminée par densitométrie, en utilisant un logiciel tel que ImageJ, permettant une comparaison de l&#39;échantillon.

Ce protocole décrit une analyse basée sur les activités de détection des métalloprotéinases matricielles dans les surnageants de culture ou de fluides corporels.

Détection des métalloprotéinases matricielles fonctionnelle par zymographie

Les métalloprotéinases matricielles (MMP) sont des endopeptidases contenant du zinc. Elles dégradent les protéines par clivage des liaisons peptidiques. Plus de vingt MMP ont été...

L'objectif général de cette procédure est de détecter les métalloprotéinases matricielles fonctionnelles. Cela est réalisé en préparant d'abord l'échantillon pour la zymographie en ajoutant un tampon de charge dépourvu d'agents réducteurs. Ensuite, le gel de gélatine ZY-Graham est chargé avec l'échantillon et la migration est poursuivie jusqu'à ce que le colorant marqueur atteigne l'extrémité du gel.Après l'électrophorèse, le gel est renaturé, développé, coloré puis décoloré. La dernière étape de la procédure consiste à numériser le gel pour l'analyse des données. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant l'activité de la métalloprotéinase matricielle dans les échantillons par analyse de la densité des bandes.Bonjour, je viens du laboratoire de la Dre Kristin Bitten, du Département de physiologie moléculaire et de biophysique au LER College of Medicine. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de détecter les métalloprotéinases matricielles par phy. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les métalloprotéinases matricielles sécrétées par des cellules primaires en culture.Étudions cela de plus près. Avant le début de ce protocole, préparez soigneusement toutes les métalloprotéinases matricielles ou MMP afin de préserver l'activité enzymatique. Les échantillons peuvent être utilisés immédiatement ou stockés à moins 80 degrés Celsius.Ici, la MMP-2, également connue sous le nom de gélatinase A ou collagénase de type IV, est utilisée pour démontrer la visualisation de l'activité des MP par zymographie. Une fois les enzymes MMP préparées, obtenez un sachet de gel de gélatine à 10 % contenant un gel à l'intérieur d'une cassette. Rincez la cassette avec de l'eau déionisée.Retirez le ruban protecteur du bas de la cassette et le peigne du haut du gel. Rincez les puits trois fois avec du tampon de migration SDS tris glycine.Placer le gel dans un appareil d'électrophorèse mini-cell en s'assurant que le côté le plus étroit de la cassette soit orienté vers l'intérieur. Fixer le gel en place à l'aide de l'encoche de tension du gel. Remplir la chambre supérieure de l'appareil avec du tampon de migration SDS-tris glycine au-dessus du niveau des puits et vérifier la présence de fuites.Remplissez également la chambre inférieure du dispositif d'électrophorèse sur gel avec du tampon de migration. Ensuite, chargez 10 microlitres de marqueur protéique de poids moléculaire. Mélangez une quantité égale de l'échantillon avec un tampon de charge pour gel, qui ne contient pas d'agents réducteurs.Contrairement à la PAGE-SDS classique, ne pas faire bouillir les échantillons et les charger directement dans les puits du gel. À l’aide de pipettes adaptées pour le chargement des gels, ces puits peuvent contenir jusqu’à 20 microlitres de volume. Placer le couvercle sur la mini-cellule et brancher les câbles d’électrode à l’alimentation électrique.Mettre l'alimentation sous tension et régler le gel pour une électrophorèse à 125 volts constants pendant 90 minutes. Vérifier la formation de petites bulles sur le fil de la chambre inférieure, indiquant la circulation du courant, lors de l'exécution du premier gel. Surveiller l'avancement de la migration toutes les 15 minutes à l'aide du bleu de bromophénol inclus dans le tampon de charge, utilisé comme indicateur pour chaque gel.Préparez 100 millilitres de tampon Rena xmo gram une fois, et 200 millilitres de tampon de développement xmo gram, les deux dans de l'eau déionisée. Lorsque le colorant traceur bleu de bromophénol atteint le bas du gel, éteignez l'alimentation électrique. Ouvrez la mini-cellule et retirez le gel.Séparez les deux côtés de la cassette. À l’aide d’un couteau à gel, découpez un coin pour marquer le sens du gel. Retirez délicatement le gel de la cassette et placez-le dans un récipient contenant 100 millilitres de tampon Rena.Incuber le gel pendant 30 minutes à température ambiante avec un agitation douce, retirer le tampon Rena et ajouter 100 millilitres de tampon de développement au gel. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec une agitation douce. Puis, retirer le tampon de développement et ajouter 100 millilitres supplémentaires de tampon de développement frais au gel.Incuber le gel toute la nuit à 37 degrés Celsius. Après l'incubation nocturne, retirer le tampon de développement et laver le gel en l'incubant avec de l'eau déionisée et un agitation douce. Répéter ce lavage deux fois pendant cinq minutes à température ambiante.Placer le gel sur un protecteur en plastique et éliminer les bulles. Ensuite, numériser le gel à l'aide d'un scanner photo pour enregistrer la position exacte des bandes de la règle protéique, car elles deviendront à peine visibles après la coloration du gel.Colorer le gel en ajoutant 20 millilitres de colorant Simply Blue Safe au gel. Incuber le gel pendant une heure à température ambiante. Sous agitation douce, retirer le colorant Simply Blue Safe et maintenir le gel dans 100 millilitres d'eau déionisée à température ambiante sous agitation douce.Après une heure, remplacez par de l'eau déionisée fraîche et poursuivez l'incubation du gel pendant au moins une heure. Pour analyser les données par cytométrie, retirez délicatement le gel de l'eau et placez-le dans une pochette plastifiée. À l'aide d'un scanner photo, numérisez le gel avec une résolution de 300 points par pouce ou supérieure.Enregistrez l'image au format TIFF. Ouvrez le fichier TIFF dans ImageJ ou un logiciel de quantification similaire pour mesurer les intensités des bandes. Visualisez l'image en noir et blanc en sélectionnant le type d'image 8 bits.Utilisez l'outil de sélection rectangulaire pour délimiter la première bande en dessinant un rectangle dont la hauteur est au moins deux fois supérieure à la largeur. Sélectionnez analyser les gels. Choisissez la première colonne, et la bande sera sélectionnée.Ensuite, un nouveau rectangle apparaîtra. Déplacez-le vers la bande suivante et sélectionnez Analyser les gels, puis sélectionnez la voie suivante. Répétez ce processus jusqu'à ce que toutes les bandes soient sélectionnées.Sélectionnez « Analyser les gels » puis « Tracer les bandes » pour générer le tracé de profil pour chaque bande. Utilisez la sélection rectiligne pour tracer des lignes de base de manière à ce que le pic d'intérêt forme une zone entièrement délimitée. Sélectionnez l'outil baguette magique et cliquez à l'intérieur de chaque pic pour le sélectionner.Sélectionnez l'option analyser les gels et marquer les pics afin d'obtenir un tableau contenant la surface de chaque pic sélectionné. Ces données peuvent être tracées telles quelles ou normalisées par rapport à la valeur d'une bande choisie. Cette normalisation est particulièrement importante lorsqu'on regroupe les valeurs provenant de plusieurs gels réplicats afin de déterminer la signification statistique des résultats.Chaque puits du gel illustré ici a été chargé avec une culture cellulaire différente. Des surnageants contenant différentes quantités de MMP-2. L'observation directe de ce gel révèle des différences évidentes de concentrations en MMP-2 entre certains puits.Par exemple, il est clair que les puits quatre et cinq contiennent beaucoup plus de MMP-2 que les puits 10 et 11. Pour une quantification objective des bandes, la cytométrie densitométrique a été utilisée avec le logiciel Image J. Ce logiciel a révélé une différence d'environ quatre fois dans le niveau de MMP.Deux quantités comprises entre, eh bien, les puits 11 et les puits 4 et 5. De même, une différence par un facteur deux dans les quantités de MMP-2 a été observée entre les puits 10 et les puits 4 et 5. Nous vous montrons simplement comment détecter des paramètres fonctionnels.La persistance du métal par xog. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de ne pas faire bouillir votre échantillon. Sinon, vous ne pourrez voir aucune bande sur votre gel.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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