Name: Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Apprenez à isoler et à cultiver des cellules souches neurales à partir du cerveau embryonnaire de souris E14 en utilisant le test de neurosphère. Cette méthode permet d'étudier le développement cérébral et la biologie des cellules souches.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation Overstreet.

1. Configuration de base Avant de procéder à la dissection: <ol><li> Volume approprié de milieu complet NSC est préparée en mélangeant NeuroCult NSC moyen basale et NeuroCult NSC Suppléments prolifération à un ratio 9:1, respectivement. </li><li> Le milieu est chauffé dans un bain d'eau à 37 ° C. </li><li> Froid tamponné HEPES milieu essentiel minimum (HEM) à forte concentration d'antibiotiques (10%) est préparé pour la dissection et l'objet à laver. Alternativement, le NSC milieu basal avec une supplémentation en antibiotiques peuvent également être utilisés à cette fin. </li><li> 25-30 ml de SEM le rhume contenant des antibiotiques est distribué dans des tubes stériles 50 ml pour la collecte des embryons. </li><li> Plusieurs 10cm en plastique des boîtes de Petri sont nécessaires pour maintenir les embryons et le cerveau lors de la dissection et aussi pour tenir les tissus disséqués. </li><li> Les outils chirurgicaux, nécessaire pour éliminer les embryons (gros ciseaux, petits ciseaux pointus, pinces grandes, petites pinces courbées) ou pour la dissection du cerveau embryonnaire (petite pince, pinces fines courbes, coudée à 45 ° pinces fines, et de petits ciseaux) sont stérilisés à l'aide billes de verre stérilisateur à 250 ° C ou d'autres méthodes disponibles autoclave. </li><li> Microscope à dissection est lavée à l'alcool 70% et mis en place dans une hotte à flux laminaire ou PC2. </li></ol> 2. Récolte E14 cerveau de souris et de micro-dissection: <ol><li> Un temps accouplés souris enceinte est anesthésié au 14 ème jour de gestation en fonction de son protocole d'animaux institutionnelle approuvée. </li><li> La dislocation cervicale est effectuée pour s'assurer que l'animal ne souffre pas la douleur et la détresse. </li><li> La souris anesthésiée est posé sur le dos sur un document papier absorbant, et l'abdomen est rincé à l'éthanol à 70% pour stériliser la région. </li><li> La peau de l'abdomen est saisie en utilisant une grande pince, puis la peau et le fascia sous-jacent est coupé avec de grands ciseaux pour exposer la cavité abdominale et les cornes utérines. </li><li> Les utérus sont retirés avec une pince et des ciseaux et de petits sont transférés dans un tube contenant 50 ml conique HEM froid. </li><li> Les tissus utérins sont transférés à la hotte, puis rincée une fois ou deux fois avec un volume suffisant de produits frais HEM froide stérile pour éliminer les contaminants possibles comme le sang et les cheveux. </li><li> Les tissus utérins sont ensuite transférés dans une boîte de Petri contenant 10cm HEM froid. </li><li> Les cornes utérines sont ouverts à l'aide de petites pinces et ciseaux courbes et les embryons sont transférés dans un plat de 10cm de nouvelles, qui contient HEM froid. </li><li> Les chefs des embryons sont séparés au niveau de la moelle épinière cervicale et transféré à une autre boîte de Pétri contenant HEM froid. </li><li> La boîte de Pétri est transféré sous un microscope à dissection pour enlever le cerveau du crâne. </li><li> Les têtes sont organisées avec une pince fine incurvée du côté caudal afin que la face dorsale des têtes sont vers le haut. En utilisant des micro-ciseaux, d'abord une coupe horizontale est faite au-dessus des yeux et a ensuite continué dans la ligne médiane du front vers l'arrière de la tête. Assurez-vous de couper à travers la peau et le crâne et de ne pas endommager le cerveau sous-jacent. </li><li> Le cerveau est enlevé du crâne en poussant les bords de la section coupée dans un mouvement vers l'arrière à l'aide de la pince courbe. Cette procédure est poursuivie jusqu'à ce que tous les cerveaux sont retirés de ces crânes. </li><li> Le cerveau est resté stable en utilisant la pince incurvée de sorte que la face dorsale est tournée vers le haut, puis en utilisant microciseaux une coupe est réalisée à travers le cortex de chaque hémisphère s'étend du bulbe olfactif à l'arrière de l'hémisphère pour exposer les éminences ganglionnaires. </li><li> Utilisation de la pince courbée dans une main et la pince coudée à 45 ° dans l'autre, les volets coupe de cortex sont répartis et les éminences ganglionnaires sont disséquées. </li><li> Le tissu disséqué est placé dans une boîte de Pétri stériles 10cm, et cette procédure est répétée jusqu'à ce que tous les cerveaux ont été micro-disséqués. </li><li> Morceaux de tissus sont recueillies à l'aide de 1 mL de milieu NSC dans un bout de 1 mL pipette et transférée dans un tube à centrifuger de 15 ml. </li><li> Tissu est ensuite dissocié soigneusement, mais doucement en appuyant sur la pointe de la pipette au fond du tube et la suspension de pipetage de haut en bas. De cette façon, les mottes sont divisés en cellules individuelles. Le pipetage est réalisé de telle sorte que 3-4 fois une suspension laiteuse comme est atteint. Ensuite, la suspension est autorisé à s'installer pendant 1-2 minutes afin que les touffes non dissociée précipités. </li><li> Près de la suspension cellulaire entière est transférée à l'autre tube, puis un autre 1 mL de milieu NSC est ajouté à la mottes restantes et dissocié de cellule unique, comme décrit. </li><li> Le contenu des tubes sont regroupées et centrifugé pendant 5 minutes à température ambiante, à 700rpm (110g). </li><li> Le surnageant est aspiré vers le hors réelles de granulés, et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de milieu complet NSC. </li><li> Le milieu est doucement introduit à la pipette haut et bas pouravoir une suspension cellulaire homogène et unique. </li><li> 10 ul de la suspension cellulaire est mélangé avec 90 ul de bleu trypan pour effectuer un comptage des cellules. </li><li> Enfin, les cellules sont étalées à la densité de 2x10 5 cellules / mL dans NSC milieu complet supplémenté avec 20ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF). 5 ml de milieu est utilisé pour T25, T75 pour les 20 ml et 40 ml pour T175 flacons. </li><li> Neurosphères sont formés dans les 5-7 jours lors d'une incubation à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. Dans 6-7 jours, les sphères doit mesurer entre 150-200 microns et sera prêt à la sous-culture (de passage). </li></ol> 3. Le repiquage et l'expansion du CNS embryonnaires: <ol><li> Lorsque les neurosphères sont prêts pour la sous-culture (150-200 um de diamètre), le milieu avec des sphères suspendues est retiré de la flacons, placé dans une taille de stériles tube approprié la culture de tissus, et centrifugé à 700 rpm (110 g) pendant 5 min à la température ambiante. </li><li> Le surnageant est éliminé et les sphères sont remis en suspension dans 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA. </li><li> La suspension cellulaire est ensuite incubée dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2-3 min, puis un volume égal d'inhibiteur de trypsine du soja est utilisé pour arrêter l'activité de la trypsine. </li><li> La suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas pour s'assurer que la trypsine a été complètement inactivé. </li><li> La suspension cellulaire est centrifugée à 700 rpm (110g) pendant 5 min. Ensuite, le surnageant est éliminé et les cellules sont resuspendues dans 1 ml de milieu complet NSC. </li><li> 10 ul de la suspension cellulaire est mélangé avec 90 ul de bleu trypan pour effectuer un comptage des cellules. </li><li> Les cellules sont étalées à une concentration de 5x10 4 cellules / mL dans le NSC milieu complet supplémenté avec 20ng / ml EGF dans une fiole de culture de la taille des tissus appropriés. 5 ml de milieu est utilisé pour T25, T75 pour les 20 ml et 40 ml pour T175 flacons. </li><li> Neurosphères secondaires sont formées dans les 5-7 jours lors d'une incubation à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: En premier embryon NSC culture, la majorité des cellules deviennent hypertrophiques et attacher à la culture de tissus plats sur placage. Alors que la majorité des cellules meurent ou se différencier, après 2-3 jours, les cellules prolifératives font de petits amas de cellules qui se détachent du substrat (figure 1). Formation de grands agrégats sphéroïdaux dans les 48 premières heures de la culture ne doit pas être confondu avec les sphères primaires. La formation d'agrégats dépend principalement de la quantité de débris et de mottes de tissu non dissociée de la culture. Neurosphères sont vrais phase brillante et devenir plus sphérique que la taille augmente (figure 2). Microspikes Petite apparaît sur la surface extérieure des sphères viable et saine (figure 3). Après 5-7 jours, les sphères doivent être rondes mais pas compacté et doit mesurer entre 150 et 200 um de diamètre. Si neurosphères sont autorisés à devenir trop volumineux (après 9-10 jours de culture), ils pourraient former des agrégats ou à devenir de couleur sombre à cause de la mort cellulaire au centre de la sphère (voir vidéo). Grand neurosphères pourrait éventuellement commencer à se différencier in situ (fixation sur le substrat et la migration vers la périphérie). Il est également difficile de dissocier neurosphères grandes et les sous-culture. <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Primaire E14 NSC culture 3 jours après l'étalement. Les flèches indiquent les clusters prolifération des CNS. Le grossissement est de; 20x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Primaire E14 NSC culture de 7 jours après l'étalement. Le grossissement est de; 10x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Seul passage E14 neurosphères 5 jours après placage. Notez le micro-pointes (flèches) à la périphérie des sphères. Grossissement original; 20x

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

Le test est Neurosphère la méthode de choix pour l&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules souches neurales 1-5 raison de sa simplicité et de reproductibilité. Ce test est un outil précieux pour production à grande échelle des cellules précurseurs du SNC indifférencié, qui pourrait être utilisé à la fois in vitro et in vivo. Il convient de souligner que neurosphères pourrait être généré à la fois du bona fide des cellules souches neurales et les progéniteurs plus restreint. Par conséqu...

* Pour faire HEM, mélanger 110L paquet de MEM and160ml d&#39;HEPES 1M et porter le volume à 8,75 L à l&#39;aide d&#39;eau distillée. Réglez le pH final à 7,4 et le stocker à 4 ° C.

Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test neurosphère

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Dans les mammifères, les cellules souches agit comme une source de cellules indifférenciées de maintenir la genèse des cellules et de renouvellement dans les différents tissus et organes pendant la durée de vie de l&#39;animal. Ils peuvent éventuellement remplacer les cellules qui sont perdues dans le processus de vieillissement ou dans le processus de blessure et de maladie. L&#39;existence de cellules souches neurales (NSC) a d&#39;abord été décrit par Reynolds et Weiss (1992) dans le système nerveux des mammifères adultes central (SNC) en utilisant un système de culture sans sérum roman, l&#39;essai de Neurosphère (NSA). En utilisant ce dosage, il est également possible d&#39;isoler et d&#39;élargir NSCs de différentes régions du SNC embryonnaire. Ces NSCs dans élargi in vitro sont multipotentes et peuvent donner lieu à trois principaux types de cellules du SNC. Alors que la NSA semble relativement simple à réaliser, attention aux procédures démontré ici est nécessaire afin d&#39;obtenir des résultats fiables et cohérents. Cette vidéo montre pratiquement la NSA pour générer et développer NSCs du jour embryonnaire du tissu cérébral de 14 souris et fournit les détails techniques, on peut obtenir pour les cultures Neurosphère reproductibles. La procédure comprend la récolte d&#39;embryons de souris E14, microdissection cerveau pour récolter les éminences ganglionnaires, la dissociation des tissus récoltés dans le milieu de NSC pour gagner une suspension cellulaire unique, et enfin plaquage cellules en culture NSA. Après 5-7 jours de culture, les neurosphères résultant primaires sont passées à élargir le nombre des CNS pour des expériences futures.

Ce protocole vidéo démontre l&#39;application du test Neurosphère pour l&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules souches neurales de la éminences ganglionnaires du jour embryonnaire 14 cerveau de souris.

Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère

Chez les mammifères, les cellules souches servent de source de cellules indifférenciées pour maintenir la genèse et le renouvellement cellulaire dans différents tissus et organes tout au long de la vie...

L'objectif de ce protocole vidéo est d'isoler et d'expander des cellules souches neuronales à partir du cerveau de souris embryonnaire en utilisant le test de formation de neurosphères. La procédure comprend la collecte d'embryons de souris E14, suivie d'une microdissection cérébrale pour prélever les éminences ganglionnaires, la dissociation du tissu collecté afin d'obtenir une suspension monocellulaire, et enfin la mise en culture des cellules sous forme de neurosphères. Bonjour, je suis Hassan Ali du laboratoire du Dr Brent Frennels à l'Institut du Cerveau Mite de l'Université de Floride.Aujourd'hui, je vais vous montrer comment établir une culture de neurosphères à partir du cerveau de souris embryonnaire en utilisant le test des neurosphères. Nous utilisons couramment ce test dans notre laboratoire pour isoler et amplifier les cellules souches neuronales. Bon, commençons.Anesthésier une souris femelle gravide accouplée au moment voulu. Au jour 14 de gestation, pratiquer une dislocation cervicale et rincer l'abdomen avec de l'éthanol à 70 %. Saisir la peau au-dessus de l'abdomen à l'aide de grandes pinces, puis couper la peau et la fascia sous-jacente avec de grands ciseaux.Pour exposer la cavité abdominale et les cornes utérines, retirez les cornes utérines contenant les embryons et transférez-les dans un tube conique de 50 ml contenant du him froid. Après avoir transféré les tissus utérins dans la hotte PC2, retirez le him du tube de 50 ml et rincez les tissus avec un volume suffisant de him froid frais pour éliminer les contaminants tels que le sang et les poils ; effectuez deux à trois rinçages de cette manière. Transférez les tissus utérins dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du him froid.Ouvrir les cornes utérines à l’aide de petites pinces courbes et de ciseaux, puis transférer les embryons dans une nouvelle boîte contenant du hem froid. Répéter cette procédure jusqu’à ce que tous les embryons aient été récoltés. Ensuite, placer les embryons sous le microscope stéréoscopique.Séparez les têtes des embryons au niveau de la moelle épinière cervicale et transférez-les dans une autre boîte de Pétri contenant du hém. Tenez la tête avec une pince courbe fine en utilisant des ciseaux microchirurgicaux. Effectuez d'abord une incision horizontale au-dessus du nez, puis poursuivez l'incision en ligne médiane depuis le front vers l'arrière de la tête.Veillez à couper à travers la peau et le crâne sans endommager le cerveau sous-jacent. Retirez le cerveau du crâne en poussant les bords de la section découpée vers l'arrière à l'aide de la pince courbe. Poursuivez cette procédure jusqu'à ce que tous les cerveaux soient retirés des crânes.Immobilisez le cerveau à l’aide de la pince courbe de manière à ce que la face dorsale soit orientée vers le haut, puis, à l’aide de ciseaux microchirurgicaux, incisez le cortex de chaque hémisphère depuis les bulbes olfactifs jusqu’à l’arrière de l’hémisphère. Pour exposer les éminences ganglionnaires, maintenez le cerveau en place, disséquez entièrement l’éminence ganglionnaire à l’aide d’une pince angulée à 45 degrés et transférez-la dans une autre boîte de Pétri. L’éminence ganglionnaire est clairement visible ici, avec ses parties médiale et latérale.Vous pouvez également disséquer les éminences ganglionnaires en retirant les tissus environnants à l’aide de fines pinces. Vous pouvez aussi couper toute l’éminence en une moitié médiale et une moitié latérale, si vous souhaitez cultiver des cellules provenant de l’une de ces régions.Répétez cette procédure jusqu'à ce que tous les cerveaux aient été microdisséqués. Utilisez un millilitre de milieu de cellules souches neuronales pour recueillir les fragments de tissu et transférez-les dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Laissez les agrégats de tissu se déposer dans le tube de 15 millilitres afin de ne laisser aucun tissu en arrière.Retirer une partie du milieu surnageant et rincer la base de la boîte de Pétri pour transférer tout tissu supplémentaire dans le tube de 15 ml. Placer la pointe de la pipette contre le fond du tube. Pippeter la suspension de haut en bas trois à quatre fois pour fragmenter le tissu et obtenir une suspension monocellulaire.Ensuite, laissez la suspension se décanter pendant une minute afin que les agrégats non dissociés précipitent ; transférez presque toute la suspension cellulaire dans un autre tube de 15 ml. Ajoutez alors un millilitre de milieu pour cellules souches neuronales aux agrégats restants et dissociez-les en cellules individuelles. Aspirez le contenu des tubes.Ensuite, centrifuger le culot à 700 tr/min ou 110 ×g pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans un millilitre de milieu complet pour cellules souches neuronales. Prélever 10 microlitres de la suspension cellulaire et mélanger soigneusement avec 90 microlitres de bleu de trypan.Ensuite, prélevez 10 microlitres de cette suspension et transférez-les dans un cytomètre hématologique. Effectuez un dénombrement cellulaire. Transférez un volume total de 20 ml de milieu complet pour cellules souches neuronales dans un tube conique de 50 ml afin de semer un flacon T 80.Ensuite, mélanger la suspension cellulaire et ajouter une quantité appropriée de cellules pour obtenir une densité totale de 200 000 cellules par millilitre ou 4 millions de cellules par flacon T 80. Ajouter l'EGF à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre. Mélanger les cellules se trouvant dans le milieu complet pour cellules souches neuronales avec le facteur de croissance et transférer la suspension cellulaire dans des flacons T 80.Étiquetez le flacon et observez les cellules au microscope afin de vous assurer d'obtenir une suspension monocellulaire sans agrégats tissulaires. Transférez le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % CO2 pendant cinq à sept jours. Au bout de cinq à sept jours, examinez le flacon au microscope.À ce stade, des neurosphères se sont formées et doivent avoir un diamètre compris entre 150 et 200 microns ; elles sont prêtes à être repiquées. Récupérez le contenu du flacon dans un tube stérile de culture tissulaire de taille appropriée, centrifugez le tube puis éliminez le surnageant. Resuspendez les sphères dans un millilitre de trypsine préchauffée et placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés pendant deux minutes.Ensuite, ajoutez un volume égal d'inhibiteur de la trypsine et mélangez bien mais délicatement pour arrêter l'activité de la trypsine. Centrifugez à nouveau et retirez le surnageant. Resuspendez ensuite les cellules dans un millilitre de milieu complet pour cellules souches neurales et effectuez un dénombrement cellulaire comme mentionné précédemment. Afin de semer un flacon T175, transférez un total de 40 ml de milieu complet pour cellules souches neurales dans un tube conique de 50 ml.Ensuite, mélanger les cellules et ajouter une quantité appropriée de cellules pour obtenir une densité totale de 50 000 cellules par M ou 2 millions de cellules par flacon T175. Puis ajouter l'EGF à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre. Mélanger les cellules présentes dans le milieu complet pour cellules souches neurales avec le facteur de croissance et transférer la suspension cellulaire dans un flacon T175.Étiquetez le flacon et transférez-le dans un incubateur pendant cinq à sept jours. Ceci est un exemple de culture primaire de cellules souches neurales E 14. Trois jours après la mise en culture, les flèches montrent des agrégats de cellules souches neurales en prolifération.Vous pouvez également observer des cellules attachées au substrat et différenciées. Ceci est un exemple de culture primaire de cellules souches neurales E 14 à sept jours après la mise en culture. Comme vous pouvez le constater, il existe des sphéroïdes de différentes tailles.Il existe également des cellules différenciées. La quantité de débris est nettement inférieure à celle des cultures primaires de neurosphères adultes. De plus, les sphères ne sont pas compactes et présentent des micro-excroissances en périphérie, indiquant qu'elles sont saines et viables.La sphère ne doit pas être laissée grossir trop, car elles pourraient devenir sombres en raison de la mort cellulaire au centre. Les grandes sphères pourraient également s'attacher au substrat et se différencier. Voici un exemple de neurosphères au premier passage à partir d'E14, cinq jours après la mise en culture.Ici encore, on peut observer les micro-excroissances situées à la périphérie des sphéroïdes. Nous venons de vous montrer comment cultiver des neurosphéroïdes à partir des éminences ganglionnaires de souris E14 en suivant les mêmes procédures décrites ici. Vous pouvez également cultiver des neurosphéroïdes à partir d'autres régions du cerveau, telles que le cortex et le mésencéphale.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos cultures de neurosphères.

establishing-embryonic-mouse-neural-stem-cell-culture-using

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Ce protocole vidéo illustre la méthode de dosage Neurosphère de générer et de développer des cellules souches neurales de la région périventriculaire souris adulte, et donne un aperçu technique afin de garantir l'on peut obtenir des cultures Neurosphère reproductibles.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Ce protocole vidéo montre comment faire de la discrimination et d'énumérer bona fide des cellules souches neurales dans une population mixte de cellules précurseurs neurales utilisant le test sur des cellules neurales formant colonie.

Neural-Formant Colonie dosage cellulaire: Un test pour distinguer Bona Fide Cellules souches neuronales à partir de cellules progénitrices neurales

Ce protocole vidéo démontre une nouvelle méthode pour la génération et la purification ultérieure des cellules progénitrices neuronales à partir d'une source renouvelable de cellules souches neurales (CSN) en fonction de leur physique (taille et granularité interne) et les propriétés fluorescentes en utilisant la technologie de cytométrie en flux.

Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l&#39;enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux

La vidéo montre le processus d'isolement et de culture de cellules souches neurales de la zone sous-calleuse du cerveau de la souris. Il s’agit de disséquer des tissus, de les dissocier enzymatiquement et de les cultiver avec des facteurs de différenciation pour qu’ils se transforment en cellules neurales matures.

Isolement et culture de cellules souches neurales adultes de la zone sous-calleuse de souris

Cette vidéo présente un protocole détaillé pour isoler les parois du ventricule latéral du cerveau de souris adulte et effectuer une dissociation enzymatique du tissu pour obtenir des cellules uniques. Ces cellules sont ensuite soumises à des conditions de culture spécifiques qui favorisent sélectivement la prolifération des cellules souches neurales et favorisent leur différenciation en co-cultures d’oligodendrocytes et d’astrocytes.

Obtention d’une culture mixte d’oligodendrocytes et d’astrocytes à partir de cellules souches neurales de souris adultes

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la production simultanée de cultures de cellules de précurseur de neurones, soit comme des monocouches ou des neurosphères adhérentes, à partir de la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de souris individuels adultes.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

Les cellules souches neurales (NNC) se réfèrent à des cellules qui peuvent se renouveler et de se différencier en trois lignées neurales. Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer la fréquence NSC dans une population cellulaire donnée en utilisant Neurosphère formation et la différenciation dans des conditions clonales.

Énumération des cellules souches neurales utilisant clonales Assays

Ici, nous démontrons la performance d’un modèle de blessures médullaires minime dans une souris adulte qui épargne la niche de canal central logement cellules souches neuronales endogènes (CNS). Nous montrons comment le dosage Neurosphère peut être utilisé pour quantifier l’activation et la migration des CNS primitifs et définitifs après une blessure.

Un dosage Neurosphère pour évaluer l’Activation endogène cellules souches neurales dans un modèle murin de minime de la moelle épinière

Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Dans cet article, nous décrivons, en détail, un protocole pour la génération des cultures de neurosphère à partir de cellules souches neurales de souris postnatales dérivées des principales niches neogènes de souris. Les neurosphères sont utilisées pour identifier les cellules souches neuronales à partir de tissus cérébraux permettant l’estimation du nombre de cellules précurseurs. En outre, ces structures 3D peuvent être plaquées dans des conditions différenciatives, donnant lieu à des...

Isolement et expansion des neurosphères des niches neurogéniques de souris postnatales (P1-3)

Ici, nous décrivons un système de nucléofection conçu pour améliorer l’efficacité de l’administration de gènes dans les cellules souches neurales (NSC) élargies isolées de la zone sous-ventriculaire murine adulte. Les résultats démontrent que cette méthode améliore considérablement la perturbation des gènes dans les CSN, surpassant l’efficacité des protocoles de transfection traditionnels et augmentant le taux de survie cellulaire.

Isolement, expansion et nucléofection de cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire murine adulte

Apprenez à isoler et à cultiver des cellules souches neurales à partir du cerveau embryonnaire de souris E14 en utilisant le test de neurosphère. Cette méthode permet d'étudier le développement cérébral et la biologie des cellules souches.

Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère

Explorer plus de vidéos