Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère

L'objectif de ce protocole vidéo est d'isoler et d'expander des cellules souches neuronales à partir du cerveau de souris embryonnaire en utilisant le test de formation de neurosphères. La procédure comprend la collecte d'embryons de souris E14, suivie d'une microdissection cérébrale pour prélever les éminences ganglionnaires, la dissociation du tissu collecté afin d'obtenir une suspension monocellulaire, et enfin la mise en culture des cellules sous forme de neurosphères. Bonjour, je suis Hassan Ali du laboratoire du Dr Brent Frennels à l'Institut du Cerveau Mite de l'Université de Floride.

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment établir une culture de neurosphères à partir du cerveau de souris embryonnaire en utilisant le test des neurosphères. Nous utilisons couramment ce test dans notre laboratoire pour isoler et amplifier les cellules souches neuronales. Bon, commençons.

Anesthésier une souris femelle gravide accouplée au moment voulu. Au jour 14 de gestation, pratiquer une dislocation cervicale et rincer l'abdomen avec de l'éthanol à 70 %. Saisir la peau au-dessus de l'abdomen à l'aide de grandes pinces, puis couper la peau et la fascia sous-jacente avec de grands ciseaux.

Pour exposer la cavité abdominale et les cornes utérines, retirez les cornes utérines contenant les embryons et transférez-les dans un tube conique de 50 ml contenant du him froid. Après avoir transféré les tissus utérins dans la hotte PC2, retirez le him du tube de 50 ml et rincez les tissus avec un volume suffisant de him froid frais pour éliminer les contaminants tels que le sang et les poils ; effectuez deux à trois rinçages de cette manière. Transférez les tissus utérins dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du him froid.

Ouvrir les cornes utérines à l’aide de petites pinces courbes et de ciseaux, puis transférer les embryons dans une nouvelle boîte contenant du hem froid. Répéter cette procédure jusqu’à ce que tous les embryons aient été récoltés. Ensuite, placer les embryons sous le microscope stéréoscopique.

Séparez les têtes des embryons au niveau de la moelle épinière cervicale et transférez-les dans une autre boîte de Pétri contenant du hém. Tenez la tête avec une pince courbe fine en utilisant des ciseaux microchirurgicaux. Effectuez d'abord une incision horizontale au-dessus du nez, puis poursuivez l'incision en ligne médiane depuis le front vers l'arrière de la tête.

Veillez à couper à travers la peau et le crâne sans endommager le cerveau sous-jacent. Retirez le cerveau du crâne en poussant les bords de la section découpée vers l'arrière à l'aide de la pince courbe. Poursuivez cette procédure jusqu'à ce que tous les cerveaux soient retirés des crânes.

Immobilisez le cerveau à l’aide de la pince courbe de manière à ce que la face dorsale soit orientée vers le haut, puis, à l’aide de ciseaux microchirurgicaux, incisez le cortex de chaque hémisphère depuis les bulbes olfactifs jusqu’à l’arrière de l’hémisphère. Pour exposer les éminences ganglionnaires, maintenez le cerveau en place, disséquez entièrement l’éminence ganglionnaire à l’aide d’une pince angulée à 45 degrés et transférez-la dans une autre boîte de Pétri. L’éminence ganglionnaire est clairement visible ici, avec ses parties médiale et latérale.

Vous pouvez également disséquer les éminences ganglionnaires en retirant les tissus environnants à l’aide de fines pinces. Vous pouvez aussi couper toute l’éminence en une moitié médiale et une moitié latérale, si vous souhaitez cultiver des cellules provenant de l’une de ces régions.

Répétez cette procédure jusqu'à ce que tous les cerveaux aient été microdisséqués. Utilisez un millilitre de milieu de cellules souches neuronales pour recueillir les fragments de tissu et transférez-les dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Laissez les agrégats de tissu se déposer dans le tube de 15 millilitres afin de ne laisser aucun tissu en arrière.

Retirer une partie du milieu surnageant et rincer la base de la boîte de Pétri pour transférer tout tissu supplémentaire dans le tube de 15 ml. Placer la pointe de la pipette contre le fond du tube. Pippeter la suspension de haut en bas trois à quatre fois pour fragmenter le tissu et obtenir une suspension monocellulaire.

Ensuite, laissez la suspension se décanter pendant une minute afin que les agrégats non dissociés précipitent ; transférez presque toute la suspension cellulaire dans un autre tube de 15 ml. Ajoutez alors un millilitre de milieu pour cellules souches neuronales aux agrégats restants et dissociez-les en cellules individuelles. Aspirez le contenu des tubes.

Ensuite, centrifuger le culot à 700 tr/min ou 110 ×g pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans un millilitre de milieu complet pour cellules souches neuronales. Prélever 10 microlitres de la suspension cellulaire et mélanger soigneusement avec 90 microlitres de bleu de trypan.

Ensuite, prélevez 10 microlitres de cette suspension et transférez-les dans un cytomètre hématologique. Effectuez un dénombrement cellulaire. Transférez un volume total de 20 ml de milieu complet pour cellules souches neuronales dans un tube conique de 50 ml afin de semer un flacon T 80.

Ensuite, mélanger la suspension cellulaire et ajouter une quantité appropriée de cellules pour obtenir une densité totale de 200 000 cellules par millilitre ou 4 millions de cellules par flacon T 80. Ajouter l'EGF à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre. Mélanger les cellules se trouvant dans le milieu complet pour cellules souches neuronales avec le facteur de croissance et transférer la suspension cellulaire dans des flacons T 80.

Étiquetez le flacon et observez les cellules au microscope afin de vous assurer d'obtenir une suspension monocellulaire sans agrégats tissulaires. Transférez le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % CO2 pendant cinq à sept jours. Au bout de cinq à sept jours, examinez le flacon au microscope.

À ce stade, des neurosphères se sont formées et doivent avoir un diamètre compris entre 150 et 200 microns ; elles sont prêtes à être repiquées. Récupérez le contenu du flacon dans un tube stérile de culture tissulaire de taille appropriée, centrifugez le tube puis éliminez le surnageant. Resuspendez les sphères dans un millilitre de trypsine préchauffée et placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés pendant deux minutes.

Ensuite, ajoutez un volume égal d'inhibiteur de la trypsine et mélangez bien mais délicatement pour arrêter l'activité de la trypsine. Centrifugez à nouveau et retirez le surnageant. Resuspendez ensuite les cellules dans un millilitre de milieu complet pour cellules souches neurales et effectuez un dénombrement cellulaire comme mentionné précédemment. Afin de semer un flacon T175, transférez un total de 40 ml de milieu complet pour cellules souches neurales dans un tube conique de 50 ml.

Ensuite, mélanger les cellules et ajouter une quantité appropriée de cellules pour obtenir une densité totale de 50 000 cellules par M ou 2 millions de cellules par flacon T175. Puis ajouter l'EGF à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre. Mélanger les cellules présentes dans le milieu complet pour cellules souches neurales avec le facteur de croissance et transférer la suspension cellulaire dans un flacon T175.

Étiquetez le flacon et transférez-le dans un incubateur pendant cinq à sept jours. Ceci est un exemple de culture primaire de cellules souches neurales E 14. Trois jours après la mise en culture, les flèches montrent des agrégats de cellules souches neurales en prolifération.

Vous pouvez également observer des cellules attachées au substrat et différenciées. Ceci est un exemple de culture primaire de cellules souches neurales E 14 à sept jours après la mise en culture. Comme vous pouvez le constater, il existe des sphéroïdes de différentes tailles.

Il existe également des cellules différenciées. La quantité de débris est nettement inférieure à celle des cultures primaires de neurosphères adultes. De plus, les sphères ne sont pas compactes et présentent des micro-excroissances en périphérie, indiquant qu'elles sont saines et viables.

La sphère ne doit pas être laissée grossir trop, car elles pourraient devenir sombres en raison de la mort cellulaire au centre. Les grandes sphères pourraient également s'attacher au substrat et se différencier. Voici un exemple de neurosphères au premier passage à partir d'E14, cinq jours après la mise en culture.

Ici encore, on peut observer les micro-excroissances situées à la périphérie des sphéroïdes. Nous venons de vous montrer comment cultiver des neurosphéroïdes à partir des éminences ganglionnaires de souris E14 en suivant les mêmes procédures décrites ici. Vous pouvez également cultiver des neurosphéroïdes à partir d'autres régions du cerveau, telles que le cortex et le mésencéphale.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos cultures de neurosphères.