Name: Isolement de lADN génomique de souris Tails (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Découvrez l'extraction d'ADN génomique à partir de biopsies de queue de souriceaux de 10 jours. Cette méthode fiable permet d'obtenir du matériel génétique tout en évitant la contamination entre échantillons.

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<ol style="margin-top: 0in"><li> Couper des morceaux de la queue (3mm) et les oreilles marque. </li><li> Ajouter 720 m l STE et 30 m de l protéinase K (10 mg / ml de stock). </li><li> Incuber à 55 ° C sur le bloc de chauffage et de vortex toutes les heures pendant 3 heures à la vitesse supérieure pendant 10 secondes. </li><li> Inactiver la protéinase K à 70 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Quench sur la glace pendant 5 minutes. </li><li> Centrifugeuse ADN de queue pendant 10 minutes à pleine vitesse. </li><li> Décanter dans un nouveau tube contenant 720 m l Isopropanol. &nbsp; </li><li> Précipiter l&#39;ADN en inversant le tube ou vortex. </li><li> Isoler l&#39;ADN pendant 5 minutes à pleine vitesse. Retirer le surnageant. </li><li> Laver le culot à l&#39;éthanol 70%. </li><li> Isoler l&#39;ADN génomique 5 minutes à pleine vitesse. Retirer le surnageant. </li><li> Laisser sécher l&#39;ADN pendant 1-2 minutes. </li><li> Remettre en suspension dans l&#39;ADN 100-200 L m selon la taille des granulés. </li><li> Placer le tube à 55 ° C pendant 1 heure pour faciliter la dissolution de l&#39;ADN. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris ; pH 8,5 / 5 mM EDTA / 0,2 % SDS / 200 mM NaCl / dans H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris ; pH 5,0 / 1 mM EDTA / 10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

isolement de l&#39;adn génomique de souris tails

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolement de l&#39;ADN génomique de souris Tails

Il s'agit donc d'un souriceau âgé de 10 jours dont je vais prélever un échantillon de queue, puis extraire l'ADN génomique à partir de cet échantillon. Je vais donc couper une petite partie de sa queue, d'environ trois millimètres, puis placer ce morceau de queue dans un tube Eppendorf, que je mettrai ensuite sur de la glace sèche. Afin d'éviter toute contamination d'une souris à une autre, je marque généralement la lame de rasoir à l'endroit où j'ai effectué la dernière coupe.Ainsi, pour la souris suivante, je m'assurerai d'utiliser un morceau propre de lame de rasoir pour prélever le prochain échantillon de queue. Afin de distinguer les différentes souris de votre portée, vous devrez disposer d'un moyen d'identifier les souris. L'une des méthodes consiste à percer un trou dans leurs oreilles à l'aide d'un poinçon auriculaire, tel que celui illustré ici.Saisissez délicatement la souris par la peau du cou, retournez-la, puis pincez sa queue entre vos doigts. Prenez la perforatrice à oreille de l'autre main et faites une petite incision rapide dans l'oreille de la souris. Voyez comme cela est indolore ?D'accord, vous pouvez maintenant voir que j'ai quelques morceaux de queue dans ces tubes Eppendorf, et maintenant je vais ajouter les solutions qui vont les aider à digérer. Tout d'abord, je vais ajouter 720 microlitres de solution STE, puis je vais ajouter 30 microlitres de protéine Ace K. Voici à quoi ressemble le morceau de queue que nous avons prélevé avant la digestion.Maintenant, je vais placer les morceaux de queue sur un bloc chauffant à 55 degrés. De nombreux protocoles prévoient un balancement continu à 55 degrés, mais pour mes besoins, cela ne sera pas nécessaire car je vais vortexer les morceaux de queue. Maintenant, je vais vortexer le morceau de queue pendant deux secondes.Un, deux. Après vortexage, voici à quoi ressemble ce qui reste à l’intérieur du tube einor ici, et vous pouvez voir que le morceau de queue a été complètement dissous. Activez la protéinase K à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Arrêtez la réaction sur glace pendant cinq minutes.Faire centrifuger les morceaux de queue dans une microcentrifugeuse pendant 10 minutes à vitesse maximale. Dans cette microcentrifugeuse, la vitesse maximale est de 13 000 tr/min. Pendant que les queues digestives centrifugent, étiqueter quelques tubes Eppendorf et remplir les tubes Eppendorf avec 750 microlitres d'isopropanol.Après avoir centrifugé les queues digérées, les poils et les matériels non digérés formeront un culot au fond du tube. La solution contenant le matériel digéré, le tampon STE et la protéinase K versée dans le tube Eppendorf contenant l'isopropanol fera apparaître l'ADN qui précipite, avec un aspect fantomatique et feathery ; juste là, flottant autour de cette bulle, se trouve l'ADN génomique isolé de la queue de la souris. Après avoir mélangé la solution d'isopropanol et de tampon STE, l'ADN génomique précipitera et apparaîtra sous forme d'une petite boule comme celle-ci ; centrifuger l'ADN génomique précipité pendant cinq minutes à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse.Voici, au fond du tube, notre ADN génomique en pellet. Je vais maintenant aspirer la solution à l'intérieur du tube, en laissant uniquement le pellet d'ADN génomique. À chaque fois que j'aspire un autre tube, je changerai la pipette.Embouts jetables sur la pointe de cet aspirateur. Après avoir aspiré le tampon STE et l'isopropanol, j'ajouterai un millilitre d'éthanol à 70 % pour laver le culot d'ADN génomique. Comme le culot d'ADN génomique adhère généralement à la paroi du tube microcentrifugé et qu'il est difficile de le détacher pour le laver complètement dans l'éthanol à 70 %, vous devrez le racler à l'aide de la grille de tubes microcentrifugés que j'ai ici.Vous pouvez faire cela comme suit. Voici à quoi ressemble l'ADN génomique après avoir été mis en pellet et lavé dans de l'éthanol à 70 %. Je vais à nouveau centrifuger cela à vitesse maximale pendant cinq minutes, puis aspirer l'éthanol à 70 % afin de récupérer les pellets d'ADN génomique après leur lavage.Leur ajouter 70 % d'éthanol pendant cinq minutes à vitesse maximale, puis aspirer le 70 % d'éthanol et laisser sécher l'ADN pendant cinq minutes. Observer le culot d'ADN génomique au fond du tube ; il doit être à peu près aussi sec que souhaité. J'ai donc séché les culots d'ADN génomique provenant des queues de souris, et maintenant je vais ajouter cent microlitres de 40 millimolaire de triss à pH huit.J'ai donc l'ADN génomique à 50 degrés Celsius, température à laquelle il passe plus rapidement en solution que s'il est ajouté à température ambiante. Après environ une heure à 50 degrés, je le congèlerai ou le mettrai à quatre degrés jusqu'à ce que je souhaite réaliser mes réactions de PCR afin de déterminer effectivement quels souris sont positives pour mon transgène.

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Isolement de l'ADN génomique de souris Tails

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