Isolement de l'ADN génomique de souris Tails

Il s’agit donc d’un chiot souris de 10 jours et je vais faire une biopsie de la queue, puis je vais extraire de l’ADN génomique de sa queue. Donc, ce que je vais faire, c’est couper un peu de sa queue, environ trois millimètres, puis je placerai le morceau de queue dans un tube einor et je placerai le tube einor sur de la glace sèche. Maintenant, pour éviter la contamination d’une souris à l’autre, je marque généralement la lame de rasoir à la partie où j’ai fait la dernière coupe.

De cette façon, pour la prochaine souris, je serai sûr d’utiliser un morceau de lame de rasoir propre pour faire la prochaine biopsie de la queue. Afin de distinguer les différentes souris de votre portée, vous allez avoir besoin d’un moyen d’identifier les souris. Une façon de le faire est de percer un trou dans leurs oreilles à l’aide d’un perforateur d’oreille illustré ici.

Prenez doucement la souris par la peau de son cou comme si vous la retourniez et pinciez sa queue entre vos doigts. Prenez la perforation du trou d’oreille dans l’autre main et faites une coupe rapide dans l’oreille de la souris à cet endroit. Vous voyez comme c’était indolore ?

D’accord, maintenant vous pouvez voir que j’ai quelques morceaux de queue dans ces tubes einor et maintenant je vais ajouter les solutions qui les aideront à digérer. Je vais d’abord ajouter 720 microlitres de solution STE, puis je vais ajouter 30 microlitres de protéines. Ace K.So voici un aperçu du morceau de queue que nous avons coupé avant la digestion.

Maintenant, je vais placer les pièces finales sur un bloc chauffant à 55 degrés. De nombreux protocoles exigent un mouvement continu à 55 degrés, mais pour mes besoins, ce ne sera pas nécessaire car je ferai vortex les queues. Maintenant, je vais vortex le morceau de queue pendant deux secondes.

Un, deux. Donc, après le vortex, voici un aperçu de ce qui reste à l’intérieur du tube einor ici, et vous pourriez voir que le morceau de queue a été complètement dissous et active la protéinase K à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Tremper sur de la glace pendant cinq minutes.

Faites tourner les queues dans une micro-centrifugeuse pendant 10 minutes à pleine vitesse. Dans cette micro-centrifugeuse, la vitesse maximale est de 13 000 tr/min. Pendant que les queues digestives tournent, étiquetez certains tubes einor remplissez les tubes einor avec 750 microlitres d’isopropanol.

Après avoir fait tourner les queues digérées, les cheveux et la matière non digérée formeront une pastille au fond du tube de décantation. La solution contenant la matière digérée, le STE et la protéinase K dans le tube einor contenant l’ADN isopropanol commencera à sortir de la solution, apparaîtra comme un fantôme et ressemblera à une plume, et juste là, nageant autour de cette bulle se trouve de l’ADN génomique qui a été isolé de la queue de la souris. Après avoir mélangé la solution d’isopropanol et de STE, l’ADN génomique sortira de la solution et il apparaît comme cette petite boule ici, faire tourner l’ADN génomique précipité pendant cinq minutes à pleine vitesse dans une micro-centrifugeuse.

Au fond du tube, on peut voir notre ADN génomique en granulés. Maintenant, je vais aspirer la solution à l’intérieur du tube, ne laissant que la pastille d’ADN génomique derrière moi. Chaque fois que j’aspire un autre tube, je change le tuyau.

Pointe pour animaux de compagnie sur la pointe de cet aspirateur. Après avoir aspiré le STE et l’isopropanol, j’ajouterai un millilitre d’éthanol à 70 % pour laver la pastille d’ADN génomique. Parce que la pastille d’ADN génomique adhère généralement sur le côté d’un tube de micro-fuge et qu’il est difficile de l’enlever pour bien la laver dans l’éthanol à 70 %, vous devrez la ratisser sur le support de tube de micro-fuge que j’ai ici.

Vous pouvez le faire comme ça. Voici donc un aperçu de l’ADN génomique après qu’il ait été granulé et lavé dans de l’éthanol à 70 %. Je vais le faire tourner à nouveau à pleine vitesse pendant cinq minutes, puis aspirer le spin à 70 % d’éthanol vers le bas les pastilles d’ADN génomique après qu’elles aient été lavées.

cinq minutes d’éthanol à 70 % à pleine vitesse, allant aspirer l’éthanol à 70 % et laisser sécher l’ADN pendant cinq minutes. Il y a un coup d’œil à la pastille d’ADN génomique au fond du tube, et c’est à peu près aussi sec que vous voulez l’obtenir. J’ai donc séché les pastilles d’ADN génomique des queues de souris, et maintenant je vais ajouter cent microlitres de triss de 40 millimolaires à pH huit.

J’ai donc l’ADN génomique à 50 degrés Celsius, où il entrera en solution plus rapidement qu’à température ambiante. Après environ une heure à 50 degrés, je vais soit le congeler, soit le mettre à quatre degrés jusqu’à ce que je veuille exécuter mes réactions PCR pour déterminer quelles souris sont positives pour mon transgène.