Cultures organotypiques d'hippocampe Slice

L’objectif global de cette procédure est de cultiver des tranches organotypiques d’hippocampe. Ceci est accompli en disséquant d’abord l’hippocampe. La deuxième étape de la procédure consiste à trancher l’hippocampe.

La troisième étape de la procédure consiste à séparer et à trier les tranches d’hippocampe. La dernière étape de la procédure consiste à cultiver les tranches d’hippocampe. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des coupes d’hippocampe d’hippocampe organiques saines grâce à la visualisation avec une lunette de dissection ou un microscope.

Bonjour, je m’appelle Jimena Opitz et je suis chercheuse scientifique dans le laboratoire du bar Dr. Andres à l’Université de Washington. À Seattle, je ferai une démonstration de la procédure pour la culture de l’hippocampe organotypique, LICs. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à disséquer et à trancher rapidement l’hypo campi et à prévenir la contamination, une solution de dissection stérile et une culture en tranches.

Les supports peuvent être préparés jusqu’à trois semaines à l’avance et stockés à une température de quatre degrés Celsius, comme décrit dans le protocole écrit. Avant la tranche d’hippocampe, des cultures peuvent être préparées. Il est nécessaire de stériliser correctement à la fois le capot de culture tissulaire et l’équipement qui sera utilisé pour la dissection.

Tout d’abord, essuyez la surface interne de la hotte de culture tissulaire avec de l’éthanol à 70 %. Placez ensuite le microscope de dissection et tous les instruments de dissection à l’intérieur de la hotte. Préparez la trancheuse à mouchoirs en plaçant un morceau propre de feuille de téflon sur la platine et en montant une nouvelle lame.

Placez le trancheur de tissus à l’intérieur du capot de culture tissulaire à l’aide d’une lumière UV, stérilisez toutes les surfaces et l’équipement pendant 15 minutes. Éteignez la lumière une fois le processus de stérilisation UV terminé. Travail dans la hotte de culture tissulaire.

Tout d’abord, préparez les six plaques de culture tissulaire à utiliser pour la culture des tranches d’hippocampe. Pipette 750 microlitres de MEB dans chaque puits de la plaque à six puits. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, placez un insert de culture cellulaire dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire.

En prenant soin de ne pas piéger des bulles d’air sous l’insert. Il est important que la membrane de chaque insert de culture cellulaire soit humide avec un milieu de culture en tranches. Si la membrane est sèche, vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air.

Si la membrane se trouve au-dessus du ménisque du SCM, plus de milieu peut être ajouté au puits. Placez les plaques de culture préparées dans un incubateur de culture tissulaire. Réglez à 35 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Enfin, remplissez un seau à glace avec un mélange de sel de glace et placez-le à côté de la zone de décapitation à l’intérieur de la hotte. Remplissez un bécher de 100 millilitres avec une solution de dissection. Poussez le bécher dans le mélange de sel glace et faites bouillonner la solution avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce que la couleur passe du rose à l’orange.

Et la solution de dissection forme un mélange de boue de solution congelée et liquide. L’environnement de dissection et les plaques de culture tissulaire sont maintenant prêts pour la dissection. P trois à P sept enveloppent.

Des chiots sont utilisés pour cette procédure. Tranche. Les cultures peuvent être préparées à partir d’un maximum de trois chiots enveloppés à la fois. Cette procédure sera illustrée à l’aide d’un seul chiot.

Récoltez rapidement le cerveau du chiot décapité et placez-le dans le bécher de 100 millilitres contenant la solution de dissection Slurry Chill pendant une minute. Pendant ce temps, préparez une boîte de dissection en ajoutant environ 10 millilitres de solution de dissection glacée au fond d’une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres À l’aide d’une cuillère arrondie, d’une spatule microspatule, transférez le cerveau du bécher de 100 millilitres dans la boîte de 60 millimètres remplie de milieu de dissection froid. Assurez-vous que le cerveau est entièrement recouvert par la solution de dissection.

Placez la parabole contenant le cerveau sous le microscope de dissection. Regardez à travers le microscope de dissection et localisez le cerveau. Utilisez une pince à dissection stérile pour déplacer le cerveau au centre du champ de vision.

Tenez le cerveau sur la ligne médiane avec la pince à dissection pressée au fond de la parabole. À l’aide de l’outil de dissection de l’hippocampe, décollez doucement les hémisphères corticaux du mésencéphale tout en laissant le mésencéphale en place, et idéalement sans détacher les hémisphères corticaux du reste du cerveau, l’hippocampe est maintenant exposé. Prenez l’outil de dissection de l’hippocampe et retirez l’hippocampe d’un hémisphère.

Ensuite, utilisez l’aiguille de dissection pour nettoyer autant de tissu non hippocampique que possible. Une fois que le premier hippocampe est isolé et nettoyé, répétez ce processus pour le deuxième hippocampe de l’autre hémisphère. Ensuite, utilisez des ciseaux stériles pour couper l’extrémité d’une pointe de pipette à filtre P 1000.

Placez l’embout de la pipette sur une pipette stérile P 1000. Aspirez doucement un hippocampe et pipetez-le sur la feuille de téflon de la trancheuse à tissus. Ensuite, de même, placez le deuxième hippocampe sur la trancheuse.

Positionnez les moitiés de l’hippocampe sur leurs côtés concaves et alignez-les perpendiculairement à la lame pour aspirer l’excès de liquide de la feuille de téflon. Réglez le ver ou le micromètre sur la position zéro. Coupez l’hippocampe en sections de 400 micromètres.

Préparez une autre douille filtrante P 1000 ciselée et montez-la sur une pipette P 1000 stérile. Versez environ 10 millilitres de SCM froid dans une boîte de culture de tissus stérile de 60 millimètres. À l’aide de la pipette, ajoutez un peu de support et transférez les tranches d’hippocampe de la trancheuse dans le plat.

Évitez de faire des bulles après avoir répété le processus de transfert pour toutes les tranches, placez le plat sous le microscope de dissection. Enfin, à l’aide d’une spatule à iris et d’une spatule droite. Séparez délicatement les tranches les unes des autres.

Séparez les tranches bien définies et non endommagées de toutes les tranches endommagées. Les tranches d’hippocampe bien définies sont maintenant prêtes à être cultivées. Retirez de l’incubateur les plaques de culture tissulaire à six puits préalablement préparées contenant des inserts de SCM et de culture cellulaire à l’aide d’un P 1000 avec une large pointe de sanglier coupée, transférez quatre à cinq tranches individuelles par membrane.

Si nécessaire, utilisez la spatule à iris pour séparer les tranches. Veillez à ne pas placer les tranches trop près de la paroi de l’insert ou à proximité les unes des autres. En prenant soin de ne pas toucher les tranches, aspirez tout excès de milieu de la surface supérieure de la culture cellulaire.

Insérer la membrane. Enfin, retournez la plaque, qui contient maintenant les cultures de tranches d’hippocampe, dans l’incubateur de culture tissulaire. Réglé à 35 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après 48 heures, retirez la plaque de l’incubateur en travaillant à l’intérieur du capot de culture tissulaire. Aspirer le support à l’aide d’une pipette postérieure. Ajouter 750 microlitres de SCM frais préchauffé par.

Encore une fois, assurez-vous qu’aucune bulle ne se forme sous la membrane de l’insert de culture cellulaire. Voici un exemple de tranche d’hippocampe saine prête à être cultivée. Les régions de l’hippocampe sont clairement visibles et intactes.

On voit ici une tranche d’hippocampe endommagée qui n’est pas utilisée pour la culture. Enfin, il s’agit d’un exemple de tranche d’hippocampe saine après quatre jours de culture. Notez que la tranche semble blanche au microscope de dissection et que la surface de la tranche est propre.

Les régions de l’hippocampe sont clairement visibles et intactes. Une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est très important de se rappeler d’utiliser des techniques de stéroïdes appropriées et d’être doux avec les tissus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la culture organotypique. Lyse de l’hippocampe.

Merci et bonne chance dans vos expériences.