Cultures organotypiques d'hippocampe Slice

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des tranches organotypiques d'hippocampe. Cela est réalisé en premier lieu par la dissection de l'hippocampe. La deuxième étape de la procédure consiste à découper l'hippocampe en tranches.

La troisième étape de la procédure consiste à séparer et trier les tranches d'hippocampe. La dernière étape de la procédure est de mettre en culture les tranches d'hippocampe. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant des tranches d'hippocampe organiques saines grâce à une visualisation au microscope stéréoscopique ou à un microscope.

Bonjour, je m'appelle Jimena Opitz et je suis chercheuse dans le laboratoire du Dr Andres bar à l'Université de Washington à Seattle. Je vais démontrer la procédure de culture d'organotypies d'hippocampe, LICs. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison de la nécessité de disséquer et de trancher rapidement les hippocampes et de prévenir toute contamination, ainsi que de l'utilisation d'une solution de dissection stérile et de la culture de tranches.

Le milieu peut être préparé jusqu'à trois semaines à l'avance et conservé à quatre degrés Celsius, comme décrit dans le protocole écrit. Avant la préparation des tranches d'hippocampe, les cultures peuvent être mises en place. Il est nécessaire de stériliser correctement la hotte de culture tissulaire ainsi que le matériel qui sera utilisé pour la dissection.

Commencez par essuyer la surface intérieure de la hotte de culture tissulaire avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, placez le microscope stéréoscopique et tous les instruments de dissection à l’intérieur de la hotte. Préparez le coupe-tissus en plaçant un morceau propre de feuille de téflon sur la platine et en installant une lame neuve.

Placer le coupe-tissus à l'intérieur de la hotte de culture tissulaire et, à l'aide d'une lumière UV, stériliser toutes les surfaces et l'équipement pendant 15 minutes. Éteindre la lumière une fois le processus de stérilisation par UV terminé. Travailler dans la hotte de culture tissulaire.

Préparez tout d'abord les plaques de culture tissulaire à six puits destinées à l'ensemencement des tranches d'hippocampe. Ajoutez 750 microlitres de milieu SEM dans chaque puits de la plaque à six puits. Puis, à l’aide de pinces stériles, placez un insert de culture cellulaire dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire.

Veiller à ne pas emprisonner de bulles d'air sous l'insert. Il est important que la membrane de chaque insert de culture cellulaire soit humidifiée avec le milieu de culture de tranches. Si la membrane est sèche, vérifier qu'aucune bulle d'air n'est présente.

Si la membrane se trouve au-dessus du ménisque du milieu SCM, on peut ajouter davantage de milieu dans le puits. Placer les plaques de culture préparées dans un incubateur à culture tissulaire. Régler la température à 35 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, et conserver jusqu'à utilisation.

Enfin, remplir un seau à glace avec un mélange de glace et de sel et le placer à côté de la zone de découpage, en travaillant à l'intérieur de la hotte. Remplir un bécher de 100 millilitres avec la solution de dissection. Enfoncer le bécher dans le mélange de glace et de sel et faire barboter la solution avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % de dioxygène pendant 10 à 20 minutes, jusqu'à ce que la couleur passe du rose à l'orange.

Et la solution de dissection forme un mélange boueux de solution congelée et liquide. À présent, l'environnement de dissection et les plaques de culture tissulaire sont prêts pour la dissection. Envelopper P trois à P sept.

Les souriceaux sont utilisés pour cette procédure. Des cultures peuvent être préparées à partir de jusqu'à trois souriceaux à la fois. Cette procédure sera illustrée à l'aide d'un seul souriceau.

Prélève rapidement le cerveau du jeune enveloppé décapité et place-le dans le bécher de 100 millilitres contenant la solution de dissection Slurry Chill pendant une minute. Pendant ce temps, prépare un plat de dissection en ajoutant environ 10 millilitres de solution de dissection froide au fond d'une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres. À l’aide d’une cuillère arrondie ou d’une spatule micro, transfère le cerveau du bécher de 100 millilitres vers la boîte de 60 millimètres remplie de milieu de dissection froid. Assure-toi que le cerveau est entièrement recouvert par la solution de dissection.

Placer la boîte contenant le cerveau sous le microscope stéréoscopique. Observer à travers le microscope stéréoscopique et localiser le cerveau. Utiliser des pinces de dissection stériles pour déplacer le cerveau au centre du champ de vision.

Tenez le cerveau en position médiane avec la pince de dissection appuyée contre le fond de la boîte. À l’aide de l’outil de dissection de l’hippocampe, détachez délicatement les hémisphères corticaux du mésencéphale tout en laissant ce dernier en place ; idéalement, sans décoller les hémisphères corticaux du reste du cerveau. L’hippocampe est désormais exposé. Prenez l’outil de dissection de l’hippocampe et retirez l’hippocampe d’un hémisphère.

Ensuite, utilisez l'aiguille de dissection pour éliminer autant que possible les tissus non hippocampiques. Une fois le premier hippocampe isolé et nettoyé, répétez ce processus pour le second hippocampe provenant de l'autre hémisphère. Ensuite, utilisez des ciseaux stériles pour couper l'extrémité d'une pipette P 1000 munie d'un embout filtrant.

Placer la pointe de pipette sur une pipette stérile P 1000. Aspirer doucement un hippocampe et le déposer sur la feuille de téflon du coupe-tissus. Ensuite, placer de la même manière le deuxième hippocampe sur le coupe-tissus.

Positionnez les moitiés d'hippocampe sur leurs côtés concaves et alignez-les perpendiculairement à la lame ; aspirez le liquide excédentaire sur la feuille de téflon. Réglez le micromètre ou le pied à coulisse sur la position zéro. Coupez les hippocampes en sections de 400 micromètres.

Préparez une autre pointe filtrante P 1000 coupée et fixez-la sur une pipette stérile P 1000. Versez environ 10 millilitres de SCM froid dans une boîte de culture tissulaire stérile de 60 millimètres. À l’aide de la pipette, ajoutez du milieu et transférez les tranches d’hippocampe du coupeur vers la boîte.

Évitez de faire des bulles ; après avoir répété le processus de transfert pour toutes les tranches, placez la boîte sous le microscope stéréoscopique. Enfin, à l’aide d’une spatule à iris et d’une spatule droite, séparez délicatement les tranches les unes des autres.

Séparez les tranches bien définies et intactes des tranches endommagées. Les tranches d'hippocampe bien définies sont désormais prêtes à être cultivées. Retirez du incubateur les plaques de culture tissulaire à six puits préparées auparavant, contenant le SCM et les inserts pour culture cellulaire, puis transférez quatre à cinq tranches individuelles par membrane à l’aide d’une pipette P 1000 équipée d’une pointe large coupée.

Si nécessaire, utilisez la spatule à iris pour séparer les tranches. Veillez à ne pas placer les tranches trop près de la paroi de l'insert ou trop proches les unes des autres. En prenant soin de ne pas toucher les tranches, aspirez tout excès de milieu à la surface supérieure de la culture cellulaire.

Insérez la membrane. Enfin, remettez la plaque, qui contient maintenant les cultures de tranches d'hippocampe, dans l'incubateur de culture tissulaire. Réglez à 35 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après 48 heures, retirez la plaque de l’incubateur en travaillant à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire. Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette postérieure. Ajoutez 750 microlitres de SCM frais préchauffé par plaque.

Encore une fois, veillez à ce qu'aucune bulle ne se forme sous la membrane de l'insert pour culture cellulaire. Voici un exemple de tranché hippocampique sain, prêt à être mis en culture. Les régions CA1, CA3 et le gyrus dentelé de l'hippocampe sont clairement visibles et indemnes.

Voici une coupe hippocampique endommagée non utilisée pour la culture. Enfin, ceci est un exemple de coupe hippocampique saine après quatre jours en culture. Remarquez que la coupe apparaît blanche au microscope stéréoscopique et que sa surface est propre.

Les régions de l'hippocampe que sont le CA1, le CA3 et le gyrus dentelé sont clairement visibles et intactes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est très important de se rappeler d'utiliser des techniques appropriées de manipulation des stéroïdes et d'être délicat avec le tissu. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser la culture organotypique. Lyse hippocampique.

Merci et bonne chance avec vos expériences.