Quantification des ADNdb utilisant le Hitachi F-7000 Spectrophotomètre de fluorescence et de PicoGreen Dye
5 novembre 2010
Démonstration de la quantification des ADN double brin à l'aide Molecular Probes PicoGreen colorant et spectrophotomètre Hitachi fluorescence F-7000 équipé d'un accessoire lecteur de microplaques.
L’objectif global de cette procédure est de démontrer la capacité du spectrophotomètre fluorescent F 7 000 avec lecteur de microplaques à effectuer une quantification de l’ADN double brin à l’aide d’un colorant vert Pico. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les échantillons et les réactifs. La deuxième étape de la procédure consiste à mettre en place l’instrument.
La troisième étape de la procédure consiste à charger des échantillons dans le lecteur de microplaques. La dernière étape de la procédure consiste à effectuer la mesure des étalons et des échantillons. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent une courbe d’étalonnage linéaire, qui pourrait être utilisée pour la quantification de l’ADN double brin d’échantillons inconnus.
Allumez le fluorimètre Hitachi F 7 000 Spectra pour permettre à la lampe au xénon de se réchauffer pendant une heure dans Excel. Créez un fichier avec les normes et les exemples de données, puis enregistrez-le au format CSV ou séparés par des virgules. Pour configurer le fluorimètre, cliquez d’abord sur le bouton de méthode qui ouvre la fenêtre de la méthode d’analyse.
Dans le champ de mesure, sélectionnez photométrie dans le menu déroulant. Cliquez maintenant sur l’onglet Quantification. Dans le champ du type de quantification, sélectionnez la longueur d’onde pour indiquer que la lecture de fluorescence sera effectuée à l’aide d’une longueur d’onde spécifiée.
Pour le type d’étalonnage, sélectionnez le premier ordre, et pour le nombre de longueurs d’onde, sélectionnez-en une. Entrez les nanogrammes par millilitre pour l’unité de concentration. Assurez-vous que les cases d’étalonnage manuel et de courbe de force jusqu’à zéro ne sont pas cochées pour le chiffre Après la virgule, sélectionnez deux, entrez zéro pour la limite de concentration inférieure et 10 000 pour le champ de limite de concentration supérieure.
Ensuite, cliquez sur l’onglet instrument et dans le champ du mode de données, sélectionnez fluorescence. Vérifiez que le champ de vitesse de hachage est inactif car il n’est utilisé que pour les mesures de phosphorescence. Dans le champ du mode de longueur d’onde, sélectionnez à la fois WL fixe dans le champ ex WL un, entrez 480 nanomètres dans le champ EM WL un.
Entrez 520 nanomètres. Laissez tous les autres champs sous EX et EM comme inactifs. Réglez à la fois la fente ex et la fente EM à 5,0 nanomètres.
À l’aide des menus déroulants, laissez la boîte devant le champ Tension PMT de un à 1000 volts non sélectionné. Pour la tension PMT, sélectionnez 700 volts dans le menu déroulant. Sélectionnez également deux pour les statistiques automatiques, le numéro un pour les réplications, 0,1 seconde pour le temps d’intégration et zéro pour le délai.
Ouvrez maintenant l’onglet du moniteur et définissez pourquoi le champ max de l’axe sur 10 000 et pourquoi le champ min de l’axe sur zéro. Cochez ensuite la case à gauche de l’open data processing après l’acquisition des données et, si nécessaire, la case à gauche de l’état d’impression après l’acquisition des données pour un rapport qui doit être imprimé automatiquement à la fin des lectures. Enfin, pour enregistrer tous les paramètres sélectionnés dans les différents onglets de la fenêtre de la méthode d’analyse, cliquez sur l’onglet général et enregistrez sous un nouveau nom de fichier à un emplacement spécifié.
Cliquez sur le bouton OK pour fermer cette fenêtre. La configuration des paramètres de test de l’instrument est terminée. Pour configurer le lecteur de microplaques, cliquez sur le bouton MPR pour afficher la fenêtre de configuration du MPR.
Sélectionnez d’abord les puits pour les normes. Par exemple, cliquez sur la position A et faites glisser la souris sur la position E. Cliquez ensuite sur le bouton de réglage standard.
Cela permettra de sélectionner les positions à utiliser pour les normes, comme indiqué en vert. Sélectionnez ensuite les positions des échantillons. De même, cliquez et faites glisser la souris sur les positions correspondantes sur la plaque, puis cliquez sur le bouton du jeu d’échantillons, qui mettra automatiquement en évidence les positions sélectionnées en jaune.
Continuez à répéter la même opération pour les positions des mesures d’échantillon souhaitées. Pour charger les normes et les exemples d’informations dans le fichier de variables séparées par des virgules préparé précédemment. Cliquez sur l’onglet Informations sur le puits de la fenêtre de configuration MPR.
Sélectionnez le bouton Charger les informations sur le puits et une fenêtre de l’Explorateur Windows s’ouvrira pour identifier le fichier csv d’informations sur le puits. Après avoir chargé les informations, la fenêtre doit s’afficher sous forme de tableau. Afin de préparer une solution fonctionnelle de réactif Pico green, ajoutez 50 microlitres de réactif 200 X pico green à 9,95 millilitres de tampon TE.
Pour la courbe standard, préparer des dilutions en série d’ADN double brin Lambda dans un tampon TE pour des concentrations finales, allant de un à 100 nanogrammes par millilitre, pipeter 150 microlitres de chaque étalon dans les puits désignés d’une plaque de plaque à 96 puits. Ensuite, pipetez 150 microlitres de chaque échantillon de test dans les puits désignés correspondants de la plaque. Maintenant, à l’aide d’une multi-pipette, ajoutez 150 microlitres de solution verte Pico dans chaque puits et mélangez la solution et les échantillons d’ADN.
Incuber doucement la plaque dans un endroit sombre pendant deux à cinq minutes pour que la réaction se développe. Cliquez sur le bouton de l’écran d’affichage MPR pour afficher la fenêtre de configuration MPR en haut de l’écran et cliquez sur le bouton d’échange de position. La plate-forme de support de microplaques se déplacera vers l’avant de l’instrument, ouvrira la porte du lecteur de microplaques et placera la plaque à 96 puits sur la plate-forme de maintien avec le puits A vers l’avant et fermera la porte du lecteur de microplaques.
Cliquez sur le bouton de position initiale pour placer la position A de la microplaque en position de mesure. Cliquez sur le bouton d’affichage du moniteur pour afficher la fenêtre de mesure au-dessus de l’écran. Cliquez sur le bouton de mesure pour commencer à mesurer les étalons et les échantillons inconnus.
Une bonne courbe d’étalonnage est évaluée à l’aide des différents paramètres fournis par le logiciel F 7 000. Par exemple, cette courbe d’étalonnage idéale obtenue pour la quantification de l’ADN double brin à l’aide du colorant vert Pico a calculé un coefficient de détermination de 0,99993. Le système à haut débit décrit est un assemblage en série de technologies comprenant Pico Green Dye, un spectrophotomètre fluorescent Hitachi F 7 000, équipé d’un lecteur de microplaques et d’un logiciel permettant d’automatiser la collecte, le stockage, l’analyse et la présentation des données.
La combinaison de technologies puissantes peut répondre au besoin croissant d’analyser avec précision de petites quantités de double brin. ADN.
Aperçu
Cet article démontre la quantification de l'ADN double brin (dsDNA) à l'aide du colorant PicoGreen et du fluorimètre Hitachi F-7000 équipé d'un lecteur de microplaques. La procédure décrit la préparation des échantillons, la configuration de l'appareil et les étapes de mesure afin d'obtenir une courbe de calibration linéaire pour la quantification de l'ADN double brin.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Spectroscopie de fluorescence
- Quantification de l'ADN
- Technologie de lecteur de microplaques
Contexte
- Le colorant PicoGreen est un colorant fluorescent sensible utilisé pour la quantification de l'ADN bicaténaire.
- Le spectrophotofluorimètre Hitachi F-7000 est un appareil polyvalent.
- Une quantification précise de l'ADN est essentielle pour diverses expériences biologiques.
- Les systèmes à haut débit facilitent l'analyse simultanée de multiples échantillons.
Objectif de l'étude
- Démontrer les capacités du spectrophotomètre F-7000 pour la quantification de l'ADN double brin.
- Établir une méthode fiable pour mesurer des échantillons d'ADN inconnus.
- Élaborer une courbe d'étalonnage linéaire pour une quantification précise.
Méthodes utilisées
- Préparation du réactif PicoGreen et des étalons d'ADN.
- Réglage des paramètres du spectrophotomètre Hitachi F-7000.
- Chargement des échantillons dans le lecteur de microplaques.
- Mesure de la fluorescence pour générer une courbe d'étalonnage.
Résultats principaux
- Une courbe d'étalonnage linéaire a été établie pour la quantification de l'ADN double brin.
- La méthode a démontré une sensibilité et une précision élevées.
- Les résultats ont montré un coefficient de détermination de 0,99993.
- Le système a efficacement analysé de faibles quantités d'ADN double brin.
Conclusions
- La combinaison du colorant PicoGreen et du spectrophotomètre F-7000 fournit une méthode robuste pour la quantification de l'ADN.
- Cette approche à haut débit répond aux exigences d'analyse précise en recherche biologique.
- La méthode peut être appliquée à diverses études nécessitant des mesures précises d'ADN.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
La quantification précise de l'ADN double brin constitue une exigence fondamentale pour la validation de cibles, le développement de tests et la génération de modèles précliniques en recherche et développement biopharmaceutique. Le spectrophotomètre de fluorescence Hitachi F-7000 associé à la coloration PicoGreen permet une mesure sensible et haut débit de l'ADN double brin, facilitant ainsi la génération fiable de courbes standards pour les applications en aval. Cette méthode assure une confiance prédictive dans la quantification des acides nucléiques, réduit la variabilité dans les flux de travail de découverte précoce et permet une production de données reproductibles et évolutives dans les études de criblage de composés et de biomarqueurs.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet une mesure précise des concentrations d'ADN double brin pour des essais de clonage, de transfection et de validation ciblée par PCR.
- Valeur opérationnelle : Facilite la préparation et la quantification reproductibles des échantillons, réduisant ainsi la variabilité technique dans les expériences fondées sur des hypothèses.
- Valeur prédictive : Génère des courbes d'étalonnage linéaires avec des coefficients de détermination élevés (R² > 0,999), assurant une quantification précise d'échantillons inconnus dans les études d'engagement ciblé.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des lectures quantitatives de fluorescence compatibles avec les formats en plaques de 96 puits pour la standardisation des dosages et le titrage des réactifs.
- Valeur opérationnelle : Permet une mesure rapide de 96 puits en moins de 60 secondes en utilisant le mode cinétique, facilitant la préparation à un criblage à haut débit.
- Extensibilité : Le logiciel permet d'enregistrer et de rappeler des configurations de microplaques, favorisant une mise en place de dosage cohérente entre équipes et projets.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fournit une quantification fiable de l'ADN double brin pour l'analyse de biomarqueurs, la validation par PCR et la production de vecteurs dans les modèles précliniques.
- Maîtrise des risques : Une sensibilité élevée (équivalent à 50 picomoles de fluorescéine) et une large gamme dynamique (5 ordres de grandeur) permettent une quantification précise sur des séries de dilutions, réduisant ainsi les faux négatifs pour les cibles peu abondantes.
- Intégration au flux de travail : Exporte les données vers Excel ou des formats de rapport, permettant un transfert fluide vers les pipelines bioinformatiques et analytiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles à l'identification de composés actifs, jusqu'au développement préclinique, où une quantification précise des acides nucléiques est essentielle pour la reproductibilité expérimentale et l'intégrité des données.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses en assurant une mesure précise de l'ADN double brin pour l'efficacité du clonage, l'analyse de l'expression génique et les études de mutagenèse.
- Triage : Fournit des signaux fluorescents quantitatifs reproductibles qui renforcent la robustesse des tests et la normalisation des bibliothèques de composés.
- Analytique : Génère des courbes de calibration linéaires et des coefficients de détermination (R²) permettant la comparaison entre expériences et le contrôle qualité.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique grâce à une quantification fiable de l'ADN dans les formulations médicamenteuses, les vecteurs viraux et les dosages de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Un logiciel configurable et des protocoles standardisés permettent une réutilisation interdépartementale, réduisant ainsi le développement répété des méthodes et augmentant l'efficacité opérationnelle.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Une sensibilité et une spécificité élevées pour l'ADN double brin réduisent les signaux faux et améliorent la fiabilité des données dans les tests moléculaires.
- Valeur opérationnelle : La collecte, le stockage et la présentation automatisés des données via un logiciel minimisent la manipulation manuelle et les erreurs de transcription.
- Valeur stratégique : Une quantification fiable soutient les décisions de poursuite ou d'abandon lors de l'optimisation des candidats, en assurant un dosage et une normalisation précis dans les tests fonctionnels.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en fournissant des données fiables sur les acides nucléiques pour la sélection des candidats et les études de formulation.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une bonne connaissance de la spectroscopie de fluorescence et du fonctionnement d'un lecteur de microplaques.
- Suppose l'accès à un spectrophotomètre Hitachi F-7000 équipé d'un accessoire de lecture de microplaques et d'un logiciel compatible.
- Exige une préparation normalisée des réactifs (dilution de PicoGreen dans un tampon TE) et une manipulation soigneuse des échantillons afin d'éviter l'extinction de la fluorescence.
- Implique l'optimisation du temps d'incubation (2 à 5 minutes à l'abri de la lumière) et des réglages de longueur d'onde (Excitation à 480 nm, Émission à 520 nm) pour assurer la reproductibilité du signal.
- Comprend certaines limites pratiques, telles que la nécessité d'une incubation à l'abri de la lumière et la possibilité d'interférences dues à des contaminants ou à des solvants organiques.
