Name: Livraison directe de morpholinos MIF Into the otocyste Zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Découvrez une méthode de livraison ciblée de morpholinos dans l'otocyste du zebrafish par microinjection et électroporation. Cette technique permet d'étudier précisément le développement de l'oreille interne chez Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de recherche sur la surdité à Yc S et la NSF (IOS 0930096) à la KFB. KFB: NIH / 2 NINDCD RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a> , NSF DBI 0832862, 0930096 NSF IOS

1. Fabrication d'électrodes pour l'électroporation <ol><li> Couper 75 fils de tungstène um de diamètre (PM Systems, Inc Carlsborg, WA) de longueur appropriée (environ 3-5 cm) </li><li> Passez le fil de tungstène grâce molex câble connecteur (broche en laiton estampé) </li><li> Envelopper et des fils de tungstène connecteur du câble molex avec gaine thermorétractable (CPS Technology, Chicago, IL) et appliquer de la chaleur avec brûleur Bunsen ou pistolet à air chaud pour sceller le tube rétrécit au fil </li><li> Pour affûter la pointe de fil de tungstène, tremper le fil dans l'hydroxyde de sodium 1,0 N (Conrad et al. 1993) et, à l'aide d'un trombone que l'autre électrode, électrolyse le fil avec un Electroporateur onde carrée. Les conditions que nous utilisons sont de 5 à 50 volts impulsions d'une durée de 100 ms avec 50 ms entre les impulsions. Les électrodes doivent être affûtées à un diamètre de 15 à 20 um </li><li> Gardez les fils dans un plateau dans les rainures enfoncé dans la pâte à modeler avant l'utilisation dans l'électroporation </li></ol> 2. Set Up station électroporation <ol><li> Ruban aiguisé 75μm électrodes de tungstène pour micromanipulateurs (instruments de précision du monde). </li><li> Micromanipulateurs place de chaque côté de la platine du microscope disséquant (Leica). </li><li> Brancher les électrodes à un Protéger CUY-21 Electroporateur Modifier Place des vagues (figure 1). </li><li> Allumez le électroporateur et mettre en place des paramètres pour l'électroporation, y compris la tension, durée d'impulsion, et le nombre d'impulsions. Les paramètres les plus efficaces pour cette expérience ont été trouvés être de trois 13 volts impulsions qui ont duré chacune des 5.0ms, avec 100ms entre chaque impulsion. Si l'électroporation crée des bulles d'air dans l'embryon, de réduire la durée d'impulsion. </li></ol> 3. Microinjection d'morpholinos Into vésicule otique Zebrafish <ol><li> Embryons de poissons zèbres récolte à partir d'un réservoir d'élevage. Incuber les embryons dans l'embryon de conscience moyenne, avec 0,3 PPM méthylène bleu (Westerfield, 2005) à 28,5 ° C pendant la nuit. </li><li> Tirez aiguilles de verre avec un extracteur Sutter P-97 électrodes </li><li> Warm up une base de gel d'agarose (1% d'agarose dans de l'eau du poisson dans un plat de Pétri de 10 mm) à 37 ° C dans un bain d'eau </li><li> Chauffer 1% d'agarose à faible point de fusion (EPMT) dans les poissons d'eau jusqu'à ce qu'il fonde et le garder au chaud dans le bain à 37 ° C. </li><li> Remplir une aiguille de verre avec une solution morpholino (GeneTools, Corvallis, OR) et couper l'extrémité d'un diamètre approprié. Montez l'aiguille d'injection sur un micromanipulateur (Kuhn). </li><li> Couper pointe de l'aiguille d'environ 10 um et les injecter dans l'huile minérale pour s'assurer que la pointe permet une livraison suffisante de solution morpholino. </li><li> Dechorinate embryons à 24 heures post-fécondation (HPF) et les anesthésier avec MS222 (tricaïne, Sigma) dans 0,3 ppm d'eau de méthylène poisson bleu. </li><li> Alignez 3 à 5 embryons anesthésiés sur la base de gel d'agarose avec le côté droit pour analyse uniforme commodes </li><li> Mettre 1 à 2 gouttes d'EPMT 1% sur chaque embryon et laissez solidifier à fixer l'embryon en place </li><li> Tournez la boîte de Pétri de telle sorte que la vésicule otique est sur le côté droit </li><li> Placez l'aiguille dans la lumière de la vésicule otique et injecter la solution avec un morpholino PicoPump PV820 pneumatique (instruments de précision du monde) avec un réservoir d'azote fixé (figure 2) </li></ol> 4. Procédure d'électroporation <ol><li> Déplacer les embryons montée à la station de électroporation immédiatement après l'injection </li><li> Placer l'électrode positive sur le tissu juste derrière la vésicule otique, mais ne pénètrent pas, insérer l'électrode négative dans le cerveau juste en avant la vésicule otique </li><li> Appliquer en cours en utilisant une pédale ou en appuyant sur un interrupteur. </li><li> Versez de l'eau du poisson sur agarose et retirez embryons à partir d'agarose tourbillonnant et une pipette en verre. Faites preuve de prudence pour ne pas endommager l'embryon. Pour les embryons qui sont difficiles à enlever, utiliser une aiguille doucement rompre toute EPMT entourant l'embryon. </li><li> Embryons Placer dans un plat avec de l'eau du poisson bleu de méthylène et d'élever les embryons à des stades souhaités pour l'analyse (morphologique, immunohistochimique, dans anlaysis hybridation, etc et microscopiques in situ). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Station de l'électroporation. Les électrodes ont été faites en utilisant des fils de tungstène affûté 75μm et reliés par un conduit Protéger CUY-21 Electroporateur Modifier onde carrée. Ces électrodes ont été enregistrées au micromanipulateurs. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Station d'injection. Tous les embryons ont été injectés dans l'oreille droite à des fins de normalisation. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Coloration phalloïdine des filaments d'actine avec 3 embryons DPF. (A) L'embryon injecte 3 dpfD avec contrôle MO a une forte coloration de la phalloïdine dans la macula postérieur (pm). (B) L'embryon qui a été injecté avec un contrôle MO puis électroporées avaient des niveaux similaires de coloration phalloïdine dans h dans les embryons d'injection seulement. (C) l'injection avec MOS mif dans la vésicule otique seul ne cause pas de réduction de la coloration phalloïdine, tandis que l'injection d'OM mif avec électroporation a provoqué une réduction spectaculaire de la coloration de la phalloïdine h (D). h, la macula antérieure. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Coloration phalloïdine des filaments d'actine avec 5 larves DPF. Il n'y avait aucune différence entre l'injection seulement (A) et l'injection de l'électroporation, lorsque la norme de contrôle a été utilisé morpholino (B). Cependant, les larves 5 dpf qui ont été injectés avec mif morpholinos et électroporé montré réduite coloration phalloïdine dans la macula postérieure (h) (D), bien que moins spectaculaire que trois DPF, en comparaison avec l'embryon qui a été injecté avec mif morpholinos seulement (C ). h, la macula antérieure. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Coloration tubuline acétylée d'embryons à 3 dpf. L'embryon en (A) n'a pas reçu d'injection ou l'électroporation. L'embryon en (B) a été électroporé mais n'a reçu aucune injection. Embryons recevoir l'injection et l'électroporation (C, D) avec mif morpholinos avaient visiblement coloration tubuline diminué par rapport aux contrôles. (H, macula postérieur). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Coloration tubuline acétylée d'embryons à 3 dpf avec contrôle morpholino. (A) Embryon sans aucun traitement a montré une forte coloration tubuline acétylée dans la macula postérieur (pm) et l'innervation étendue. (B) avec contrôle de l'embryon injecté morpholino. (C) Embryon traités avec électroporation seulement. (D) d'embryon commande avec morpholino injecté et électroporées a des niveaux similaires de la tubuline acétylée dans la macula et l'innervation postérieure par rapport au témoin un traitement non.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

La production de l&#39;article a été parrainé par Gene Tools, LLC qui produisent les réactifs mentionnés dans la vidéo et du texte.

Nous avons introduit avec succès OM oligonucléotide antisens dans l&#39;oreille de l&#39;embryon de poisson zèbre 24 HPF. Les embryons qui ont été soulevées après l&#39;injection et l&#39;électroporation étaient viables. Si les embryons ont survécu à l&#39;électroporation, ils ont progressé à des taux normaux par rapport à des embryons qui n&#39;avaient reçu aucun traitement, ainsi que des embryons qui avaient seulement été injectés et les embryons qui avaient seulement été électroporé. Nous avons observé les effets de la MIF et MIF, comme OM après l&#39;injection d&#39;oreille et l&#39;électroporation grâce à l&#39;étiquetage et la tubuline avec la phalloïdine acétylés. Phalloïdine coloration des filaments d&#39;actine dans les cellules ciliées sensorielles de la macula postérieure indique que l&#39;électroporation de MIF et MIF tels que MO au stade 24-HPF a provoqué des changements dans la cellule des cheveux et / ou des numéros de stéréocils par rapport aux embryons qui ont été injectés avec la seule OM (Figure 3). Cette diminution du nombre de cellules ciliées est cohérent avec les conclusions de Shen et al. (Soumis) que OM à mif mif-like et de provoquer une réduction du nombre de cellules ciliées dans la macula sacculaire. La diminution du nombre de cellules de cheveux chez les embryons qui ont été injectés avec les OM et électroporées démontrer que l&#39;électroporation peut aider à déplacer l&#39;OM à travers la membrane cellulaire, ce qui augmente l&#39;étendue des effets morphologiques par rapport aux embryons dans lequel la vésicule otique était seulement injecté. Les changements dans la morphologie du ganglion statoacoustic ont été observées grâce à la tubuline acétylée coloration. L&#39;étendue de l&#39;innervation par le ganglion statoacoustic a été affectée, comme les embryons qui ont été injectés et électroporées montrent une diminution de branchement des neurites (figure 5). Il peut également être diminué de condensation des cellules ganglionnaires et / ou diminution du nombre de cellules ganglionnaires, parce que la coloration tubuline acétylée est significativement diminué chez les embryons qui ont été injectés à la fois et électroporé. Parce que MIF a été montré pour être critique pour le développement du système nerveux (Suzuki et al., 2004), les changements observés après l&#39;électroporation peut être le résultat de la transfection accrue de la MIF et MIF, comme solution de MO dans les cellules neuroblastes. L&#39;électroporation des antisens morpholinos oligo directement dans un tissu en développement est un outil utile pour contrôler l&#39;expression d&#39;un gène au cours du développement que le tissu, à la fois spatialement et temporellement, dans l&#39;embryon. L&#39;électroporation de MIF et MIF-like OM dans les tissus de l&#39;oreille interne conduit à une morphologie anormale des deux macula postérieur et le ganglion statoacoustic. Il y avait une réduction du nombre de cellules ciliées sensorielles dans la macula postérieure des embryons qui avaient été injectés et électroporées en comparaison avec les embryons qui n&#39;avaient reçu aucun traitement ou avec des embryons qui avaient été soit seulement injecté ou seulement électroporé. Il y avait aussi une diminution du degré d&#39;innervation du patch postérieure sensorielle par le ganglion statoacoustic et la taille de la SAG. L&#39;électroporation est une méthode précieuse pour la transfection des macromolécules dans des tissus spécifiques, avec l&#39;avantage d&#39;observer les effets primaires de l&#39;ADN notamment, de l&#39;ARN, ou MO dans le tissu désiré et discriminant de ces d&#39;effets secondaires sur d&#39;autres tissus, y compris le cerveau, de la crête neurale et des mésenchyme périotique sur le développement oreille interne (Barald et Kelley, 2004).

<ol><li> OM: 0,3 mm d&#39;une combinaison de des mif, mif-comme MO1 et MO2 mif-like a été utilisé. Mif MO est gratuit au codon d&#39;initiation de l&#39;ARNm de poisson zèbre MIF: 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat-3 &#39;. Deux OM ont été utilisés pour mif mif-comme-comme MO1 est gratuit sur ​​le site de début de traduction:. 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;, tandis que le MIF, comme MO2 dérivé de la séquence à l&#39;AS intron1/exon deux limites: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 &#39;. Contrôle MO a été la séquence nucléotidique du brouillés Outils Gene: 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &#39;. </li><li> bleu de méthylène (0,3 ppm) dans les poissons d&#39;eau </li><li> MS222 (tricaïne, Sigma; 0,64 mM dans l&#39;eau du poisson) </li><li> Bas point de fusion d&#39;agarose (EPMT; Roche) </li><li> rouge de phénol (Sigma) </li><li> Anti-acétylés tubuline (Sigma) </li><li> Alexa Fluor ® 488 de chèvre anti-souris second anticorps (Molecular Probes) </li><li> Texas Red-phalloïdine (Molecular Probes) </li></ol>

livraison directe de morpholinos mif into the otocyste zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Ces dernières années, l&#39;électroporation est devenue une technique populaire pour la transfection in vivo de l&#39;ADN, l&#39;ARN et morpholinos dans les tissus divers, y compris l&#39;œil, du cerveau et des somites poisson zèbre. L&#39;avantage de l&#39;électroporation rapport aux autres méthodes de manipulation génétique, c&#39;est que certains tissus peuvent être ciblées, à la fois spatialement et temporellement, pour l&#39;introduction de macromolécules par l&#39;application de courant électrique. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de l&#39;électroporation pour la transfection et la mif mif-like morpholinos dans les tissus de l&#39;oreille interne de l&#39;élaboration du poisson zèbre. Dans les études antérieures, mif morpholino injectées dans des embryons à la une - au stade de 8 cellules a entraîné des modifications morphologiques très répandue dans le système nerveux et des yeux, ainsi que l&#39;oreille. En ciblant les tissus de l&#39;oreille interne à des stades ultérieurs de développement, nous pouvons déterminer les principaux effets de MIF dans l&#39;oreille de développement interne, par opposition aux effets secondaires qui peuvent résulter de l&#39;influence des autres tissus. En utilisant la tubuline acétylée phalloïdine et coloration pour étudier la morphologie des neurones, les processus neuronaux, et les cellules ciliées associées à la macula postérieure, nous avons été en mesure d&#39;évaluer l&#39;efficacité de l&#39;électroporation comme une méthode pour la transfection ciblée dans l&#39;oreille le poisson-zèbre intérieure. Les vésicules otiques d&#39;embryons ont été injectés avec 24hpf morpholinos et électroporé et ont ensuite été comparés aux embryons qui n&#39;avaient reçu aucun traitement ou avaient été injectés ou ne électroporé. Les embryons qui ont été injectés et électroporées ont montré une diminution du nombre de cellules de cheveux, une diminution de l&#39;innervation par le ganglion statoacoustic (SAG) et les neurones en moins par rapport SAG avec des groupes de contrôle. Nos résultats ont montré que la prestation directe de morpholinos en otocystes à des stades ultérieurs du système évite non spécifiques nerveux et les effets de la crête neurale morpholinos livré au stade 1-8 cellules. Il permet également l&#39;examen des effets qui sont dirigées vers l&#39;oreille interne et non pas des effets secondaires sur l&#39;oreille d&#39;effets primaires sur le cerveau, de la crête neurale ou mésenchyme périotique.

Une méthode pour livrer morpholinos directement dans le poisson-zèbre à l&#39;otocyste 24hpf a été développé. L&#39;utilisation de micro-injection d&#39;morpholinos dans la lumière de la vésicule otique et l&#39;électroporation à effet de pénétration, nous avons été en mesure de contourner l&#39;effet de morpholinos sur le cerveau et obtenir des effets spécifiques de l&#39;oreille interne.

Livraison directe de morpholinos MIF Into the otocyste Zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne

Ces dernières années, l'électroporation est devenue une technique populaire pour la transfection in vivo d'ADN, d'ARN et de morpholinos dans divers tissus, notamment le...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'administrer directement dans les oticules de poisson zèbre, à un stade d'un jour ou de 24 heures post-fécondation, des molécules antisens, des oligonucléotides, des morpholinos ou d'autres molécules perturbant le développement. Dans cet exemple, nous utilisons des morpholinos dirigés contre la première neurotrophine responsable du développement du ganglion acoustique statique, une cytokine du système immunitaire appelée facteur inhibiteur de la migration des macrophages, ou MIF, afin de déterminer si ces morpholinos affectent le développement de l'oreille interne ou la neurogenèse. Cette approche est réalisée en introduisant d'abord les morpholinos dans la lumière de la vésicule otique par microinjection, puis en effectuant une électroporation, qui facilite la pénétration des morpholinos depuis la lumière vers les cellules des oticules.Ensuite, les embryons sont élevés à 28,5 degrés Celsius afin d'observer les effets des morpholinos sur le développement de l'oreille interne et la neurogenèse. Au cours des jours suivants, des résultats sont obtenus montrant une diminution des cellules ciliées sensorielles de l'oreille interne, ainsi qu'une réduction de l'innervation par le ganglion stato-acoustique, basée sur l'immunohistochimie et les colorations foid et, qui marquent respectivement la tubuline acétylée dans les kinocils et l'actine dans les stéréocils à la surface des cellules ciliées. Nous avons initialement mis au point cette méthode d'injection et d'électroporation de morpholinos dans l'embryon de poulet avec un étudiant de licence très talentueux du laboratoire.Katie Holmes a réussi à l'adapter aux dimensions du poisson zèbre. L'équipe de recherche actuelle, comprenant Yuchi, une postdoctorante, et Matt Wyatt, un étudiant diplômé, ainsi que Deb Thompson, ancienne postdoctorante du laboratoire, a affiné cette technique pour le poisson zèbre. Cette méthode pourrait, espérons-le, répondre à des questions essentielles dans les domaines de la biologie du développement et de la recherche auditive, notamment savoir si des effets morphogénétiques spécifiques sur un système d'organes comme l'oreille peuvent être distingués d'effets développementaux généralisés affectant de nombreux systèmes d'organes et ayant des répercussions secondaires sur l'oreille, par exemple des effets sur le cerveau qui influencent indirectement l'oreille.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les micro-injections aux stades d'une à quatre cellules, est qu'elle permet d'introduire directement les morphos dans l'oreille à des stades ultérieurs. Ainsi, les effets directs des morphoses sur la lignée, ainsi que les effets secondaires sur l'oreille interne, peuvent être évités. Pour fabriquer les électrodes, commencez par couper un fil de tungstène de 75 micromètres de diamètre sur une longueur d'environ trois à cinq centimètres. Faites passer le fil de tungstène à travers un connecteur de câble Molex.Ensuite, enveloppez les fils de tungstène et le connecteur de câble Molex avec un tube thermorétractable et appliquez de la chaleur à l’aide d’un bec Bunsen ou d’un pistolet thermique pour fixer le tube rétractable sur le fil. Puis, pour aiguiser l’extrémité du fil de tungstène, plongez le fil dans une solution d’hydroxyde de sodium à une normalité et effectuez une électrolyse du fil en utilisant un trombone comme autre électrode, à l’aide d’un courant électrolytique en onde carrée. Les conditions que nous utilisons sont cinq impulsions de 50 volts, chacune durant 100 millisecondes, avec des intervalles de 50 millisecondes entre les impulsions.Effectuez trois répétitions avec la pointe de l'électrode immergée dans la soude à une normalité. Insérez légèrement plus profondément l'électrode dans la soude et effectuez une répétition supplémentaire. Enfoncez davantage l'électrode, en la faisant progresser d'environ la même distance à chaque fois, et effectuez une dernière répétition.Cet aiguisage progressif produit une pointe très fine sur l'électrode, permettant une insertion plus précise et moins dommageable des électrodes dans l'embryon de poisson zèbre en développement. Conserver les fils enfoncés dans de l'argile à modeler, placée dans un récipient, avant leur utilisation pour l'électroporation destinée à l'injection microscopique de morphos dans les vésicules otiques du poisson zèbre. Préparer d'abord des aquariums de reproduction équipés d'une cloison en plastique afin de séparer les mâles des femelles le soir. Placer quatre mâles et quatre femelles dans le réservoir et laisser le réservoir dans une salle d'incubation avec un cycle lumineux de 14 heures de lumière et 10 heures d'obscurité pendant la nuit. Le lendemain matin, après allumage des lumières, retirer le séparateur et laisser les poissons au repos pendant environ 20 à 30 minutes. Séparer les mâles des femelles et retirer les reproducteurs du réservoir de reproduction.Les placer dans des aquariums contenant de l'eau fraîche pour poissons. Récolter les embryons du bac de reproduction en versant l'eau contenant les œufs dans une passoire. Rincer plusieurs fois les œufs dans la passoire avec de l'eau fraîche pour œufs avant de les transférer dans une boîte de Pétri.Retirer tous les œufs non fécondés ou opaques et incuber les embryons dans un milieu de culture contenant 0,3 PPm de bleu de méthylène à 28,5 degrés Celsius pendant la nuit, pendant que les embryons s'incubent. Tirer des microcapillaires en verre à l’aide d’un tireur d’électrodes Sutter P 97 juste avant l’injection. Réchauffer une base de gel AROS composée de 1 % d’agros dans de l’eau pour poisson dans une boîte de Pétri de 10 millimètres à 37 degrés Celsius dans un bain-marie, 1 % d’AGROS à bas point de fusion ou LMPA dans de l’eau pour poisson jusqu’à complète fusion, et maintenir au chaud dans le bain-marie à 37 degrés Celsius.Remplissez une pipette en verre avec une solution de morpholino et coupez l'extrémité afin d'obtenir un diamètre approprié, d'environ 10 à 15 microns. Montez l'aiguille d'injection sur un micromanipulateur fixé à une pompe pneumatique Pico Pump PV820 alimentée par un réservoir d'azote. Décortiquez les embryons 24 heures après la fécondation et anesthésiez-les avec de la trica à 0,3 ppm dans de l'eau pour poissons contenant du bleu de méthylène.Ensuite, alignez trois à cinq embryons anesthésiés sur la base de gel AROS avec le côté droit vers le haut pour une analyse uniforme et pratique, déposez une à deux gouttes de LMPA à 1 % au-dessus de chaque embryon et laissez durcir afin de fixer l'embryon en place. Faites pivoter la boîte de Pétri de manière à ce que la vésicule otique se trouve du côté droit. Puis insérez l'aiguille dans la lumière de la vésicule otique et injectez la solution morpho à l’aide de la pédale du pied.Immédiatement après la microinjection, déplacer les embryons montés vers la station d'électroporation afin de préparer la station d'électroporation. Fixer d'abord avec du ruban adhésif les électrodes en tungstène effilées de 75 micromètres aux micromanipulateurs. Ensuite, placer les micromanipulateurs de chaque côté du plateau du microscope stéréoscopique.Activez l'électroporateur et configurez les paramètres pour l'électroporation. Les paramètres les plus efficaces pour cette expérience se sont révélés être trois impulsions de 13 volts de deux millisecondes chacune, avec un intervalle de 100 millisecondes entre chaque impulsion.Insérez les électrodes de manière à ce que la vésicule otique soit régulièrement encadrée, avec une électrode située superficiellement par rapport à la vésicule otique et l'autre en position profonde. Ensuite, appliquez un courant à l’aide d’une pédale ou en actionnant un interrupteur lorsque l’électroporation est terminée. Versez de l’eau pour poisson sur les aros et retirez les embryons à l’aide d’une pipette en verre en faisant doucement tourbillonner la plaque.Prendre soin de ne pas endommager les embryons qui sont difficiles à extraire. Utiliser une aiguille pour délicatement détacher tout LMPA qui les entoure. Transférer les embryons dans une plaque contenant de l'eau de poisson au bleu de méthylène et élever les embryons jusqu'aux stades souhaités pour l'immunohistochimie morphologique.Dans les analyses d'hybridation double brin et microscopiques, des résultats représentatifs d'injection auriculaire et d'électroporation de morpholinos sont présentés ici. La macula postérieure ou auditive, désignée par PM, est l'un des organes de l'audition chez le poisson lorsqu'elle est marquée au Phalloïdine rouge. Sur cette photographie, les faisceaux d'actine dans les stéréocils des cellules ciliées sensorielles apparaissent comme des points rouges sur le fond clair.Une macula en forme de pagaie observée par marquage fluorescent avec Phin chez un embryon de trois jours post-fécondation injecté avec des morpholinos MIF ne montre qu'un accroissement des filaments d'actine au sein des stéréocils des cellules ciliées, comparé aux embryons du même âge qui ont été électroporés ainsi qu'injectés. Toutefois, l'injection et l'électroporation avec le morpholino contrôle standard n'ont pas entraîné de diminution de la coloration F ni de la coloration spécifique comparée à l'injection du morpholino seul. Les résultats sont similaires dans la macula postérieure, bien que moins marqués après cinq jours chez les larves injectées et électroporées, comparées à l'embryon injecté uniquement avec les morpholinos MIF.Il n'y avait aucune différence entre l'injection seule et l'injection avec électroporation lorsque le morpholino témoin standard était utilisé. Cet embryon, qui a été marqué avec un anticorps dirigé contre la tubuline acétylée, n'a reçu ni injection ni électroporation de MIF Morpholinos. Cet embryon a été électroporé mais n'a reçu aucune injection.Les deux embryons présentent une coloration normale de la tubuline acétylée. Ces embryons ont tous deux été injectés et électroporés. Ils présentaient une coloration de la tubuline nettement réduite par rapport aux témoins, ainsi qu'un nombre beaucoup plus faible de prolongements neuronaux associés à l'oreille et aux ganglions environnants.Lorsque le morpholino témoin a été utilisé pour l'injection et l'électroporation, nous n'avons observé aucune réduction de l'étendue de la coloration de la tubuline acétylée, ni de diminution de l'innervation par le ganglion acoustique, par comparaison avec l'injection du morpholino seul. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures si elle est effectuée correctement. La partie la plus difficile à maîtriser est l'électroporation ; il convient de faire particulièrement attention à ne pas endommager le cerveau, et l'utilisation d'électrodes aiguisées permet d'atténuer ce problème.

direct-delivery-mif-morpholinos-into-zebrafish-otocyst-injection

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d'ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

Cette vidéo montre comment morpholino ou ARNm peut être injecté dans des embryons de poisson zèbre au stade d'une cellule pour diminuer ou augmenter le niveau des produits de gènes spécifiques au cours du développement ultérieur.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

Une méthode pour l'expression conditionnelle knockdown une protéine cible dans la rétine de poisson zèbre adulte est décrite, qui consiste à injecter par voie intravitréenne morpholinos antisens et les électroporation dans la rétine. La protéine résultante est assommée pendant plusieurs jours, ce qui permet de tester le rôle de la protéine dans la régénération ou de la rétine intacte.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Nous décrivons une méthode pour conditionnellement knockdown l'expression d'une protéine cible lors de la régénération du poisson zèbre nageoire adulte. Cette technique consiste à micro-injection et électroporation morpholinos oligonucléotide antisens dans le tissu fin, ce qui permet de tester le rôle de la protéine à différents stades de la régénération des nageoires, y compris la cicatrisation des plaies, de la formation blastème, et l'excroissance de régénération.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

L'oreille interne de souris est un organe placode dérivé sensorielle dont le développement du programme est élaboré pendant la gestation. Nous définissons...

Transfert de gènes à l&#39;oreille de souris en développement intérieur par<em&gt; In Vivo</em&gt; Électroporation

Le protocole décrit l’inhibition ciblée de l’expression génique chez le poisson zèbre par injection de morpholino dans la queue.

Injection de morpholino : une méthode pour inhiber l’expression génique cible afin d’étudier la fonction chez le poisson zèbre

Dans cet article, nous démontrons une méthode pour la manipulation de l'expression des gènes dans les cellules ventriculaires du télencéphale de poisson zèbre adulte en utilisant des oligonucléotides antisens morpholino. Nous présentons aussi un protocole efficace et rapide qui peut être utilisé pour des études fonctionnelles dans le cerveau des vertébrés adultes cette méthode.

Micromanipulation de l&#39;expression génique dans le cerveau de poisson zèbre adulte en utilisant microinjection Cerebroventricular d&#39;oligonucléotides Morpholino

Un procédé de génétique inverse adapté pour un poisson zèbre pour déterminer la fonction des gènes au cours des stades ultérieurs de développement et de l'homéostasie physiologique tel que la régénération des tissus en utilisant des injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d'un gène.

Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve

En utilisant l’électroporation in ovo , nous avons conçu une méthode pour transfecter sélectivement l’oreille interne auditive et le noyau cochléaire dans des embryons de poulet afin d’obtenir une élimination spécifique du groupe cellulaire de la protéine de retard mental fragile X pendant des périodes discrètes d’assemblage du circuit.

Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation in ovo

En injection intraventriculaire Utero et l&#39;électroporation d&#39;embryons de rat E16

Découvrez une méthode de livraison ciblée de morpholinos dans l'otocyste du zebrafish par microinjection et électroporation. Cette technique permet d'étudier précisément le développement de l'oreille interne chez Danio rerio.

Livraison directe de morpholinos MIF Into the otocyste Zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne (Vidéo) | JoVE Journal

Livraison directe de morpholinos MIF Into the otocyste Zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne

Explorer plus de vidéos