Name: Purification des progéniteurs du muscle squelettique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Apprenez à isoler des progéniteurs myogéniques et adipogéniques viables du muscle squelettique murin par digestion enzymatique et cytométrie en flux. Cette méthode permet d'étudier la régénération tissulaire in vivo.

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1. Collection de tissus: <ol><li> Utilisez la souris entre 7 et 12 semaines. Habituellement, au moins deux animaux sont utilisés: l'un est de mettre en place le FACS seule couleur contrôles requis pour l'indemnisation et pour la fluorescence-moins-un échantillons de contrôle isotypique. L'autre est l'échantillon réel pour le tri. </li><li> Euthanasier les souris par inhalation de CO 2 ou selon un protocole d'éthique des choix. Placez la souris sur une serviette en papier, face vers le haut, et de pulvérisation avec de l'éthanol à 70% à fond pour éviter toute contamination avec la fourrure de la souris. </li><li> Soulever la peau dans la région abdominale avec une pince, puis prendre une petite coupe longitudinale avec des ciseaux pointus. </li><li> Peler les deux volets de la peau dans des directions opposées (haut et bas) complètement exposer les muscles des membres postérieurs en dessous. </li><li> D'accise du tissu musculaire en insérant et en étendant les ciseaux le long des deux côtés du tibia. </li><li> Répétez le même processus pour le fémur pour en extraire le tissu musculaire. </li><li> Placez tous les tissus musculaires excisées dans 60mm Pétri-vaisselle, en utilisant un seul plat pour le tissu de chaque souris. </li><li> Répéter l'opération pour toutes les souris. </li></ol> 2. Dissocier tissu en cellules isolées par digestion enzymatique: Tout au long de cette section du protocole, l'utilisation des réactifs stériles et des outils et du travail dans des conditions stériles. <ol start="9"><li> Ajouter 2 ml de collagénase II (Sigma, cat # 6885, 500U / ml) et 20 ul de CaCl 2 250mm d'actions à chaque boîte de Petri. </li><li> Déchirer le tissu musculaire en petits morceaux (environ 1 mm 3) avec deux pinces (une dentelé, une avec 2 dents, des outils de Fine Science, cat # 11051-10, 11154-10), en prêtant attention à enlever et jeter autant contaminés non tissu musculaire que possible. </li><li> Couvrir le Petri-vaisselle et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. </li><li> Récupérer le Petri-plats et d'utiliser une seringue de 3 ml plongeur au fond écraser les morceaux de tissu. Utilisez un poussoir pour chaque échantillon afin d'éviter les contaminations. </li><li> Ajoutez un peu (~ 5 ml) stériles PBS froid à chaque boîte de Petri et le transfert des boues de tissu dans un tube de 50 ml Falcon (rincer la boîte de Petri, si nécessaires pour récupérer tous les tissus) </li><li> Agiter le tube Falcon vigoureusement, remplir le tube avec du PBS, centrifuger @ 800rpm x 5 minutes (Modèle de paillasse Eppendorf: 5810R), et aspirer le surnageant (répéter 3 fois) </li><li> Ajouter le mélange de 1 ml de collagénase D (Roche, Cat # 11088882001, 1,5 U / ml) / dispase II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / ml) et 10 ul de CaCl 2 (250mm) à chaque tube, incuber à 37 degrés Celsius avec rotation pendant une heure. </li><li> Ajouter 5-10 mL de froid, de PBS stérile, vortex et une pipette soigneusement afin d'homogénéiser le tissu. </li><li> Remplir les tubes avec du PBS et mélangez bien. </li><li> Transférer le liquide dans un tamis cellulaire 40μm placé sur le dessus d'un tube Falcon de 50 ml de filtrer les morceaux restants grande partie des tissus. Diviser chaque échantillon homogène dans des tubes Falcon 50 ml trois. Remplissez chacun des tubes avec du PBS, puis centrifuger @ 1600RPM pendant 5 minutes à 8 degrés Celsius. </li><li> Jeter le surnageant et de recueillir des cellules pour la coloration. </li></ol> 3. Coloration des anticorps et de tri: Tout au long de cette section du protocole, l'utilisation FACS stérile et tampons de collecte et de travailler dans des conditions stériles. Anticorps commerciaux sont généralement considérés comme stériles si elles sont correctement traitées. <ol start="20"><li> Pour seule couleur et d'échantillons de contrôle isotype, resuspendre l'échantillon dans un tampon de FACS 1ml et diviser les cellules en suspension dans neuf 1.5ml tubes Eppendorf pré-étiquetées (100 ul de chaque tube). <ol><li> Mettre en place des taches de couleurs simples mélanges selon le tableau suivant: ATTENTION: La concentration finale d'anticorps isotype contrôle de la tache doit correspondre à celle de l'anticorps primaire, ils sont le contrôle des. Par exemple, si l'anti-Sca-1 est utilisé pour une μg/10 6 cellules, son isotype correspondant doit être utilisé à la même concentration. <table border="1"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> Nom du tube </td><td> Société </td><td> Cat # </td><td> clone </td><td> isotype </td><td> de dilution </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Non-taches </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> sigma </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> sigma </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31-FITC CD45-FITC </td><td> eBioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Maison faite </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> SCA1-PECY7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α-7 APC </td><td> Maison faite </td><td></td><td> R2F2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li> Mettre en place coloration contrôle isotypique mixages en utilisant le tableau suivant: <table border="1"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> Nom du tube </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31- FITC </td><td> CD45- FITC </td><td> Scal- PE-Cy7 </td><td> A-7- APC </td><td> Rat- IgG2b- APC </td><td> Rat- IgG2a- pecy7 </td><td> Rat- IgG2a- FITC </td><td> Rat- IgG2b- FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Iso- CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Iso- Scal- pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> Iso- α-7-APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li> Déposer le mélange de couleurs simples et isotopiques coloration de contrôle (nous avons l'habitude d'ajuster la concentration d'anticorps de sorte qu'entre 5 et 10 uL de coloration mélange sont ajoutés à chaque échantillon) dans le tube Eppendorf appropriée de l'étape 20. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant 1 heure. </li></ol></li><li> Colorer des cellules de souris échantillon avec 800μL du cocktail d'anticorps (ci-dessous) pour le tri de cellules FACS. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant 1 heure. Cocktail d'anticorps: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC ATTENTION: Le rapport optimal des anticorps aux cellules doit être déterminée par titration individuelle chaque anticorps, comme des différences significatives peuvent exister entre les lots. La quantité optimale d'anticorps à utiliser doit être exprimée en μgs d'anticorps par 10 6 cellules cibles et maintenue constante lors de l'utilisation du même lot d'anticorps. En clair, si le nombre de cellules cibles ne change pas significativement entre les expériences, ou si le volume est réduit avec coloration du nombre de cellules, une dilution fixe de chaque anticorps peut également être utilisé. </li><li> Lavage: Ajouter environ 1 ml de tampon FACS à chacun des 9 tubes de contrôle; ajouter environ 20 ml de tampon FACS au tube échantillon. </li><li> Centrifuger les tubes Eppendorf @ 3000rpm pendant 5 minutes (banc Eppendorf centrifugeuse, Modèle: 5417C). Centrifuger le tube de l'échantillon @ 1600RPM pendant 5 minutes (banc Eppendorf dessus centrifugeuse, Modèle: 5810R). </li><li> Aspirer et jeter le surnageant de tous les tubes. </li><li> Resuspendre les cellules dans le tampon FACS (1ml pour chacun des contrôles, 4ml pour le tri des échantillons), les cellules Pipeter dans des «tubes FACS" à travers le tamis cellulaire de la PAC (cat # 352235 BD Falcon, 40μm taille des pores) pour enlever les grumeaux restants qui peuvent affecter le cytomètre. </li><li> Mettre en place la trieuse FACS avec des contrôles seule couleur et de contrôle isotypique. </li><li> Recueillir les cellules triées selon le tableau suivant dans un tampon 3,5 ml de collecte (95% DMEM, 5% de FBS) séparément. Normalement, lorsque la récolte deux membres postérieurs, une souris de type sauvage unique pourrait produire environ 150.000 cellules progénitrices myogéniques ou 100.000 cellules progénitrices adipogéniques, avec la viabilité supérieure à 95%, tel que jugé par réanalyse cellules triées par FACS à la fin de la procédure (figure 1 ) Définition des progéniteurs myogéniques et adipogéniques basée sur coloration de surface <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps / teinture </td><td> Progénitrices myogéniques (MP) </td><td> Progénitrices adipogéniques (AP) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α-7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. Transplantation: <ol start="28"><li> Centrifuger les cellules triées @ 1500rpm pendant 5 minutes, retirer les cellules surnageant et transfert à l'autoclave des tubes Eppendorf (1,5 ml), laver les cellules avec 500 ul de PBS stérile (sérum gratuit!), Puis centrifuger @ 3000rpm pendant 5 minutes. Maintenir tous les réactifs dans des conditions stériles et de travailler dans une hotte de culture tissulaire, resuspendre progéniteurs myogéniques dans le PBS, ou progénitrices adipogéniques de Matrigel (cat # 354234 BD) à environ 10 6 cellules / ml. </li><li> Transplant progéniteurs myogéniques ou progénitrices adipogéniques aux souris receveuses. <ol><li> Anesthésier la souris avec isoflouran en fonction de votre politique de l'institution. </li><li> Raser les poils autour de la région d'injection, puis stériliser la peau par frottement avec de l'éthanol à 70% </li><li> Injecter 20 pi des progéniteurs myogéniques ou progéniteurs adipogéniques (= 20k cellules) à l'aide d'une seringue 3 / 10 CC insuline (BD # 309300 cat). </li></ol></li><li> Après un moment approprié (trois semaines qui fonctionne bien, mais myofibrilles exprimer provenant de donneurs marqueurs transgéniques sont habituellement évidents dans la semaine après la transplantation), d'anesthésier les souris receveuses de l'étape 29 par injection intrapéritonéale de 400 ul Avertin (Cat Sigma # T04840-2, 25 mg / ml), puis perfuser transcardiaque avec 50mL de PBS (contient 10 pM de l'EDTA) en premier, suivis de 15 ml de 4% en PFA. Recueillir tissu cible, le post-fixer avec 4% PFA nuit si nécessaire, puis transfert à 20% de sucrose pendant la nuit. Intégrer dans les PTOM, geler et cryosection. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Lorsque MP sont transplantés dans les muscles squelettiques de souris, ils facilement fusionner avec pré-existante myofibrilles. Par conséquent, toute étiquette génétique présente dans les cellules du donneur sera facilement détectable dans les fibres qui les a reçus. La figure 2 montre un exemple où les cellules transplantées ont exprimé humaine phostphatase alcalines, a révélé histochimiquement. Lorsque l'AP sont transplantés le résultat est très dépendante de l'environnement du site de transplantation: lorsqu'elles sont transplantées sous-cutanée de ces cellules donnent origines en adipocytes et les myofibroblastes (voir figure 2). Dans de nombreux autres sites, y compris les muscles, ils ne survivent pas à moins dégénérescence graisseuse a été induite 3. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Tri stratégie pour l'isolement des populations progénitrices du muscle squelettique stratégie de tri (A):. Cellules viables ont été identifiés sur la base de dispersion vers l'avant et diffusion latérale. Coloration Hoechst a été utilisé pour exclure les débris anucléées et de l'iodure de propidium (PI) coloration d'exclure les cellules mortes. Hématopoïétiques (CD45) et endothéliales (CD31) des cellules ont été exclus de la porte de tri. Le α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - Scal - sous-ensemble contient tous les progéniteurs myogéniques (MP). Le Scal + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - population contient des progéniteurs adipogéniques (AP). (B) Fluorescence-moins-un contrôle isotype (FMO) confirment la spécificité de la coloration. (C) Pureté contrôles de sous-ensembles MP et AP après le tri. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Les résultats représentatifs suivants MP et AP transplantation. AP ont été transplantés sous-cutanée (panneau supérieur) et le député par voie intramusculaire (panneau inférieur). Dans les deux cas, les cellules du donneur provenaient d'une souris transgéniques exprimant la phosphatase alcaline humaine, identifié par la coloration brune.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

L&#39;objectif de ce protocole est de trouver un équilibre raisonnable entre les rendements élevés et une viabilité élevée des cellules purifiées. L&#39;étape la plus critique pour s&#39;assurer que les cellules saines sont récupérés est, sans surprise, la dissociation enzymatique du tissu de départ. La manipulation des tissus doivent être particulièrement doux, ce qui est difficile à démontrer ou à apprécier encore dans un format audiovisuel. Un autre facteur clé est la longueur de la procédure. Plus il faut aller chez le donneur à l&#39;animal receveur, le bas de la viabilité et donc l&#39;efficacité greffe. Faut-il y avoir aucune question sur la viabilité qui n&#39;est pas immédiatement répondu en regardant la fréquence des PI événement positif dans les échantillons de cellules purifiées après le tri, nous suggérons qu&#39;un test de dilution limite à mesurer clonogénicité est effectué 3. Sortes typiques du muscle intact régulièrement le rendement d&#39;environ 1 sur 15 à 20 cellules capables d&#39;initier des colonies myogénique ou fibro / adipogéniques in vitro. Alors que pratiquement 100% des colonies initiée par les députés contiennent les myotubes différenciés, seulement environ un tiers des colonies obtenues à partir des adipocytes FAP contiennent, en plus de douceur myofibroblastes actine musculaire positif.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Collagénase II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-6885, </td><td> 500 U / ml </td></tr><tr><td> Collagénase D </td><td> Roche </td><td> 11088882001 </td><td> 1,5 U / ml </td></tr><tr><td> Déplacer II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 2,4 U / ml </td></tr><tr><td> tamis cellulaire </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> Tube avec filtre cellulaire </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2261 </td><td> 2-5 ug / ml </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> Clone 390 </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td> Fait maison </td><td></td><td> Clone I3 / 2 </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> Clone D7 </td></tr><tr><td> α-7 intégrine APC </td><td> Fait maison </td><td> Renseignez-vous auprès du laboratoire Rossi </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

purification des progéniteurs du muscle squelettique

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Le muscle squelettique contient populations progénitrices multiples origines distinctes embryonnaire et potentiel de développement. Progéniteurs myogéniques, résidant habituellement dans une «position de cellule satellite» entre la membrane plasmatique fibres musculaires et de la membrane basale de laminine-riche qu&#39;il ensheaths, sont auto-renouvellement des cellules qui sont uniquement engagés à 1,2 lignage musculaire. Nous avons récemment décrit une deuxième classe de navire de progéniteurs associés qui peuvent générer des myofibroblastes et les adipocytes blancs, qui répond efficacement aux dommages causés par la prolifération d&#39;entrer et offre un soutien trophique à cellules myogéniques pendant 3,4 régénération des tissus. L&#39;un des tests les plus fiables pour déterminer le potentiel de développement et de régénération d&#39;une population cellulaire donnée repose sur leur isolement et de la transplantation 5-7. À cette fin, nous avons optimisé les protocoles pour leur purification par cytométrie en flux à partir de muscle enzymatiquement dissocié, ce qui nous donnera un aperçu dans cet article. Les populations obtenues en utilisant cette méthode, soit des cellules contiennent des colonies myogénique ou fibro / adipogéniques formant: pas d&#39;autres types cellulaires sont capables de développer in vitro ou in vivo dans la prestation de survivant. Toutefois, lorsque ces populations sont utilisées immédiatement après le genre d&#39;analyse moléculaire (par exemple qRT-PCR), il faut garder à l&#39;esprit que les sous-ensembles fraîchement triées peut contenir d&#39;autres cellules contaminant qui n&#39;ont pas la capacité de former des colonies ou greffant les bénéficiaires.

Méthode pour la dissociation enzymatique, l&#39;étiquetage de surface et de la purification par cytométrie en flux de fibro / adipogéniques et les progéniteurs myogéniques du muscle squelettique murin.

Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Le muscle squelettique contient plusieurs populations de progéniteurs d'origines embryonnaires et de potentiels de développement distincts. Les progéniteurs myogéniques, résidant généralement...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler des cellules progénitrices myogéniques et adipeuses viables à partir d'un muscle squelettique homologue. Cela est réalisé en prélevant d'abord un tissu musculaire sur des souris euthanasiées. Dans un deuxième temps, l'échantillon est digéré enzymatiquement, ce qui dissocie le tissu en cellules individuelles.Ensuite, le tri cellulaire par fluorescence activée, ou FACS, est utilisé afin d'isoler les cellules progénitrices. Des résultats sont obtenus, montrant la viabilité et la différenciation des cellules isolées après transplantation dans des souris receveuses, selon une coloration histochimique du marqueur génétique, qui, dans cet exemple, est la phosphatase alcaline humaine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques préexistantes comme le prepl est que les cellules peuvent être isolées directement à partir de l'animal à différents points temporels.Par exemple, après avoir induit un dommage tissulaire, ce qui signifie qu'il n'y a aucune pression de sélection sur la population cellulaire, la population cellulaire peut être analysée au niveau moléculaire afin d'examiner les différentes étapes que les cellules traversent au cours du processus de régénération in vivo. Cette technique peut donc aider à répondre à une question essentielle dans le domaine de la régénération tissulaire, et en particulier, quel est le rôle de chaque type cellulaire pendant la régénération in vivo et comment ces types cellulaires interagissent-ils entre eux pour reconstruire un tissu sain ? Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement de maladies telles que la dystrophie musculaire.Étant donné que l'étude de ces progéniteurs pourrait éventuellement permettre des stratégies régénératives pour ce type de maladies, les implications de cette technique s'étendent à plusieurs autres tissus, allant du cœur au tissu adipeux, car au moins les progéniteurs fibro-adipogéniques ont été retrouvés dans chacun des tissus que nous avons testés jusqu'à présent. En général, les débutants dans cette technique éprouveront des difficultés, car des méthodes de dissociation trop agressives réduiront la viabilité cellulaire et généreront trop de débris, ce qui entravera par la suite une séparation propre des cellules.L'idée de cette méthode nous est d'abord venue lorsque nous avons décidé d'appliquer la cytométrie en flux, habituellement utilisée pour les cellules APOE, à l'étude des cellules souches dans les tissus solides. La démonstration visuelle de cette technique est importante, car les étapes de dissociation tissulaire sont difficiles à apprendre, étant très complexes à décrire correctement. Cette technique sera démontrée aujourd'hui par linky, une assistante de recherche de mon laboratoire qui l'a initialement mise au point et optimisée. Pour cette procédure, au moins deux souris sont nécessaires.Une souris est utilisée pour fournir les cellules nécessaires aux contrôles unicolores et d'isotype d'anticorps pour les faits, et l'autre fournira l'échantillon à trier. Pour commencer, récupérez des souris âgées de sept à douze semaines ayant été préalablement euthanasiées dans une hotte stérile de laboratoire. Placez la souris euthanasiée sur une serviette en papier stérile, sur le dos, et vaporisez soigneusement le pelage avec de l'éthanol à 70 % afin d'éviter toute contamination, en tenant une pince dans une main et des ciseaux pointus dans l'autre.Soulevez la peau dans la région abdominale et pratiquez une petite incision longitudinale. Saisissez la peau de chaque côté de l'incision et retirez-la pour exposer complètement les muscles des membres postérieurs. Ensuite, excisez le tissu musculaire en insérant les ciseaux fermés sous le muscle et au-dessus du tibia, puis en ouvrant les ciseaux.Le bord arrière des lames séparera doucement le muscle du tibia. Répéter l'opération des deux côtés du tibia et placer le tissu dans une boîte de Pétri de 60 millimètres. Ensuite, exciser le tissu musculaire du fémur de la même manière et ajouter le tissu à la boîte de Pétri.Répétez pour chaque souris en utilisant une boîte de Pétri par souris. Ensuite, dissociez le tissu en cellules individuelles. Ajoutez deux millilitres ou 1000 unités de collagénase, ainsi que deux et 20 microlitres de solution mère de chlorure de calcium à 250 millimolaire, à chaque boîte de Pétri contenant du tissu musculaire.Ensuite, travaillez rapidement et avec précaution. Utilisez deux pincettes grises, l'une crantée et l'autre à deux dents, pour découper le tissu en morceaux d'un millimètre cube. Retirez et jetez autant que possible les tissus non musculaires.Couvrez les boîtes de Pétri et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l'incubation, récupérez les boîtes et remettez-les dans la hotte stérile. Retirez le piston d'une seringue de trois millilitres et utilisez-le pour écraser le tissu.Utiliser un piston par plaque afin d'éviter toute contamination croisée. Ajouter environ cinq millilitres de PBS froid stérile dans chaque boîte de Pétri et transférer le contenu de la boîte dans un tube conique de 50 millilitres. Rincer avec cinq millilitres supplémentaires de PBS afin de récupérer tous les tissus et les ajouter au tube conique.Lavez et centrifugez les échantillons trois fois selon le protocole. Ensuite, ajoutez un millilitre d'une solution composée de collagénase D dys espace deux et de chlorure de calcium dans chaque tube et incubez à 37 degrés Celsius avec agitation rotative pendant une heure. Après l'incubation, ajoutez cinq millilitres de PBS froid stérile dans les tubes, vortexez brièvement les tubes et triturez plusieurs fois pour dissocier les agrégats.Remplissez les tubes avec du PBS, mélangez bien et placez-les sur de la glace. Pour éliminer les éventuels restes de fragments tissulaires, placez un tamis cellulaire de 40 microns au-dessus d'un tube conique de 50 millilitres placé sur de la glace, puis filtrez la suspension cellulaire. Répartissez le filtrat uniformément dans trois tubes coniques de 50 millilitres contenant du PBS froid et stérile, puis centrifugez à 1600 tr/min pendant cinq minutes à huit degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant (S) et placez les cellules sur de la glace en vue de la coloration et du tri des cellules progénitrices myogéniques et adipogéniques.Tout d'abord, préparez les six contrôles mixtes de coloration monocromatique conformément au protocole écrit joint. Ces contrôles comprennent la coloration sans colorant (hulk stain), l'iodure de propidium, les anticorps marqués FSE dirigés contre CD31 et CD45, l'anticorps marqué SC un P taille sept et l'anticorps marqué alpha sept A PC. Ensuite, préparez les trois mélanges de contrôle de coloration par anticorps isotopiques conformément au protocole écrit.Une fois les mélanges de coloration préparés, étiquetez neuf tubes Eppendorf de 1,5 millilitre pour les échantillons de contrôle monocoloré et d'isotype. Resuspendez et combinez les cellules provenant des trois tubes coniques dans un volume total d'un millilitre de tampon FACS. Ensuite, distribuez 100 microlitres des cellules dans chacun des tubes Eppendorf de contrôle étiquetés et ajoutez à l'aide d'une pipette entre cinq et 10 microlitres des mélanges de coloration, selon la concentration des anticorps, dans les tubes de contrôle correspondants.Ré-suspendre les cellules provenant de l'échantillon de souris dans 200 microlitres de tampon fax et combiner dans l'un des tubes coniques de 50 millilitres. Ajouter ensuite 800 microlitres du cocktail d'anticorps. Mélanger chacun des tubes témoins et des tubes d'échantillon.Incubez-les bien sur de la glace pendant une heure. Après l'incubation, lavez les cellules en ajoutant un millilitre de tampon fax à chacun des neuf tubes témoins et environ 20 millilitres de tampon fax au tube d'échantillon. Centrifugez les tubes einor témoins à 3000 tr/min pendant cinq minutes.Centrifuger le tube conique contenant l'échantillon à 1600 tr/min pendant cinq minutes. Ensuite, aspirer et jeter le surnageant après la centrifugation. Résuspendre les cellules témoins dans chaque tube Eppendorf avec un millilitre de tampon FACS et résuspendre les cellules de l'échantillon dans quatre millilitres de tampon FACS.Ajouter de l'iodure de propidium aux cellules échantillons, aux contrôles isotopiques ainsi qu'au contrôle unicolore de l'iodure de propidium. Prélever les cellules à l'aide d'une pipette et les transférer dans des tubes FACS à travers le bouchon filtre pour éliminer les agrégats résiduels pouvant affecter le cytomètre.Configurez l'appareil de cytométrie en flux avec un contrôle de couleur unique et des contrôles isotype. Triez les cellules de l'échantillon conformément au protocole écrit joint et recueillez chaque population séparément. Utilisez un tube de collecte de 3,5 millilitre. Les progéniteurs myogéniques viables constituent la population qui est CD45 négatif, CD31 négatif, PI négatif, alpha 7 intégrine positif et Sca-1 positif.Un précurseur adipeux viable de taille PE sept négatif est isolé et trié comme étant positif pour PE taille sept et négatif pour pi CD31, FE CD45 et alpha sept a PC. Un seul souris de type sauvage peut fournir environ 1 × 10⁵ précurseurs adipeux, et de 1,5 à 2 × 10⁵ précurseurs myogéniques avec une viabilité supérieure à 95 %.Pour préparer les cellules en vue de leur transplantation chez des souris hôtes, les cellules sont lavées. Commencez par centrifuger les cellules déformées à 1500 tr/min pendant cinq minutes. Éliminez le surnageant, resuspendez les cellules dans 500 microlitres de PBS et transférez-les dans des tubes einor.Centrifuger les tubes à 3000 tr/min pendant cinq minutes et éliminer le surnageant. Ensuite, resuspendre les progéniteurs myogéniques dans du PBS ou les progéniteurs adipeux dans du matrigel à environ 10⁶ cellules par millilitre. Après avoir préparé les souris hôtes anesthésiées pour chaque type de cellule donneur, conformément au protocole écrit, utiliser une seringue à insuline de 0,3 cm³ pour injecter 20 microlitres (environ 20 000 cellules) de progéniteurs myogéniques ou adipeux.Prévoir le temps approprié nécessaire à la différenciation des cellules transplantées, généralement environ trois semaines. Ensuite, isoler le tissu cible et le préparer pour la cryoséction, comme décrit dans le protocole. Dans cette figure, la stratégie de tri est démontrée afin d'isoler les progéniteurs adipo- et myogéniques. Les cellules viables ont été identifiées en fonction de la diffusion avant et de la diffusion latérale. La coloration au hawk a été utilisée pour exclure les débris nucléaires, et la coloration à l'iodure de propidium ou PI a été utilisée pour exclure les cellules mortes. Les cellules hématopoïétiques et endothéliales, ou respectivement les cellules CD 45 et CD 31, ont ensuite été exclues des fenêtres de tri. Enfin, la sous-population positive pour l'alpha sept. SKA un négatif contient tous les progéniteurs myogéniques et la population qui est alpha sept négative. SKA un positif contient tous les progéniteurs adipogéniques. Les contrôles de fluorescence moins un des isotopes confirment la spécificité de la coloration. En outre, des contrôles de pureté des sous-populations adipogéniques et myogéniques ont été réalisés.Après tri dans cet exemple représentatif, les cellules donneuses progénitrices adipeuses exprimant la phosphatase alcaline transgénique humaine injectées par voie sous-cutanée peuvent être identifiées dans le tissu hôte par histochimie, comme indiqué par la coloration brune. Les cellules donneuses progénitrices myogéniques exprimant la phosphatase alcaline humaine transgénique injectées par voie intramusculaire ont été identifiées dans cette coupe tissulaire, comme le montre la coloration brune.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est correctement exécutée. Si davantage d'échantillons sont en cours de traitement, le temps augmentera. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de travailler rapidement et délicatement.Par conséquent, évitez de traiter trop d'échantillons simultanément. Prolonger le temps de traitement réduira considérablement la variabilité cellulaire après cette procédure. D'autres méthodes, telles que l'analyse de l'expression de colono SC OG par RT-PCR quantitative, peuvent également être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme : comment ces cellules progénitrices réagissent-elles aux lésions in vivo après leur développement ?Cette technique a ouvert la voie à d'autres chercheurs dans le domaine de la régénération tissulaire pour explorer la communication croisée entre les cellules progénitrices dans les tissus endommagés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment dissocier ces tissus sans les endommager. Les cellules progénitrices identifient les cellules progénitrices en fonction de leurs marqueurs de surface et analysent leur potentiel de développement in vivo.Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec votre expérience.

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