Purification des progéniteurs du muscle squelettique

L’objectif global de l’expérience suivante est d’isoler des cellules progénitrices myogéniques et adipogéniques viables à partir de muscles squelettiques miroirs. Ceci est réalisé en prélevant d’abord du tissu musculaire de souris euthanasiées. Dans un deuxième temps, l’échantillon est digéré par voie enzymatique, ce qui dissocie le tissu en cellules uniques.

Ensuite, le tri cellulaire activé par fluorescence ou les faits est utilisé afin d’isoler les cellules progénitrices. On obtient des résultats qui montrent la viabilité et la différenciation des cellules isolées lorsqu’elles sont transplantées chez des souris receveuses sur la base d’une coloration histochimique pour le marquage génétique, qui dans cet exemple est la phosphatase alcaline humaine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques préexistantes comme le prepl est que les cellules peuvent être isolées directement de l’animal à différents points temporels.

Par exemple, après avoir induit des lésions tissulaires, ce qui signifie qu’il n’y a pas de sélection sur la population cellulaire et que la population cellulaire peut être analysée au niveau moléculaire pour examiner les différentes étapes que les cellules traversent au cours du processus de régénération in vivo. Cette technique peut donc aider à répondre à une question cruciale dans le domaine de la régénération tissulaire, et en particulier, quel rôle joue chaque type de cellule lors de la régénération in vivo et comment ces types de cellules interagissent-ils les uns avec les autres pour reconstruire un tissu sain ? L’implication de cette technique s’étend au traitement de maladies telles que la dystrophie musculaire.

Comme l’étude de ces progéniteurs peut éventuellement permettre des stratégies régénératives pour ce type de maladies. De plus, les implications de cette technique s’étendent à un certain nombre d’autres tissus allant du cœur à la graisse adipeuse, car au moins les progéniteurs fibro-adipogènes ont été trouvés dans tous les tissus que nous avons testés jusqu’à présent. En général, les nouveaux venus dans cette technique auront du mal car les techniques de dissociation sévères réduiront la viabilité cellulaire et créeront trop de débris, ce qui interférera ensuite avec la séparation propre des cellules plus tard.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons décidé d’appliquer la cytométrie en flux, qui est généralement utilisée pour les cellules APOE, à l’étude des cellules souches dans les tissus solides. La démonstration visuelle de cette technique est importante car les étapes de dissociation des tissus sont difficiles à apprendre car il est très difficile de les décrire correctement. La démonstration de cette technique aujourd’hui sera assurée par linky, un assistant de recherche de mon laboratoire qui a été le premier à développer et à optimiser la technique. Pour cette procédure, au moins deux souris sont nécessaires.

Une souris est utilisée pour les cellules afin de fournir les contrôles nécessaires de couleur unique et d’isotype d’anticorps pour les faits, et l’autre fournira l’échantillon à trier. Pour commencer, procurez-vous des souris âgées de sept à 12 semaines qui ont déjà été euthanasiées dans une hotte de laboratoire stérile. Placez la souris euthanasiée sur une serviette en papier stérile, face vers le haut et vaporisez soigneusement la fourrure avec de l’éthanol à 70 % pour éviter la contamination avec des pinces dans une main et des ciseaux tranchants dans l’autre.

Soulevez la peau de la région abdominale et faites une petite incision longitudinale. Saisissez la peau de chaque côté de l’incision et retirez la peau pour exposer complètement les muscles des membres postérieurs. Ensuite, excisez le tissu musculaire en insérant les ciseaux fermés sous le muscle et au-dessus du tibia, puis en ouvrant les ciseaux.

Le bord arrière des lames forcera doucement la séparation du muscle du tibia. Répétez l’opération pour les deux côtés du tibia et placez le tissu dans une boîte de Pétri de 60 millimètres. Maintenant, excisez le tissu musculaire du fémur de la même manière et ajoutez le tissu dans la boîte de Pétri.

Répétez l’opération pour chaque souris à l’aide d’une boîte de Pétri par souris. Ensuite, dissociez le tissu en cellules uniques. Ajoutez deux millilitres ou 1000 unités de collagénase, deux et 20 microlitres de solution mère de chlorure de calcium de 250 millimolaires dans chaque boîte de Pétri de tissu musculaire.

Ensuite, il travaille rapidement et soigneusement. Utilisez deux pinces grises, l’une dentelée et l’autre à deux dents pour déchirer le tissu en morceaux d’un millimètre cube. Retirez et jetez autant de tissu non musculaire que possible.

Couvrez les boîtes de Pétri et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, récupérez les plats et retournez-les dans la hotte de laboratoire stérile. Retirez le piston d’une seringue de trois millilitres et utilisez-le pour écraser le tissu.

Utilisez un piston par plaque pour éviter la contamination croisée. Ajoutez environ cinq millilitres de PBS stérile froid dans chaque boîte de Pétri et transférez le contenu de la boîte dans un tube conique de 50 millilitres. Rincez avec cinq millilitres supplémentaires de PBS pour récupérer tous les tissus et ajoutez-les dans le tube conique.

Laver et centrifuger les échantillons trois fois selon le protocole. Ensuite, ajoutez un millilitre d’une solution composée de collagénase D dys espace deux et de chlorure de calcium dans chaque tube et incubez à 37 degrés Celsius avec rotation pendant une heure. Après l’incubation, ajoutez cinq millilitres de PBS stérile froid dans les tubes, agitez brièvement les tubes et tritratez plusieurs fois pour dissocier les grumeaux.

Remplissez bien les tubes avec le PBS et placez-les sur de la glace Pour enlever tous les gros morceaux de tissu restants, placez une passoire à cellules de 40 microns sur un tube conique de 50 millilitres sur de la glace et filtrez la suspension cellulaire. Répartissez uniformément le débit dans trois tubes coniques de 50 millilitres remplis de PBS froid et stérile et centrifugez à 1600 tr/min pendant cinq minutes à huit degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez soigneusement le S et placez les cellules sur de la glace pour la coloration et le tri des cellules progénitrices myogéniques et adipogènes.

Tout d’abord, mettez en place les six contrôles mixtes de coloration monochrome selon le protocole écrit qui les accompagne. Ces contrôles comprennent la coloration sans colorant, l’iodure de propidium, les anticorps marqués CD 31 et CD 45 FSE, l’anticorps marqué SC un P taille sept et l’anticorps alpha sept A marqué PC. Ensuite, configurez les trois mélanges de coloration de contrôle des isotypes d’anticorps selon le protocole écrit.

Une fois les mélanges de coloration préparés, étiquetez neuf tubes einor de 1,5 millilitre pour les échantillons de contrôle de couleur unique et d’isotype. Resus suspend et combine les cellules des trois tubes coniques dans un volume total d’un millilitre de tampon de télécopie. Ensuite, distribuez 100 microlitres de cellules dans chaque tube de contrôle einor étiqueté et pipetez entre cinq et 10 microlitres des mélanges de coloration en fonction de la concentration des anticorps dans les tubes de contrôle correspondants.

Suspendez à nouveau les cellules de la souris échantillon dans 200 microlitres de tampon de fax et combinez-les dans l’un des tubes coniques de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 800 microlitres du cocktail d’anticorps. Mélangez chacun des tubes de contrôle et des tubes d’échantillon.

Eh bien, incubez-les sur glace pendant une heure. Après l’incubation, lavez les cellules en ajoutant un millilitre de tampon de télécopie dans chacun des neuf tubes de contrôle et environ 20 millilitres de tampon de télécopie dans le tube d’échantillon. Centrifugez les tubes einor de contrôle à 3000 tr/min pendant cinq minutes.

Centrifugez le tube conique d’échantillon à 1600 tr/min pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez et jetez le snat après centrifugation. Remettez en suspension les cellules de contrôle dans chaque tube à orph avec un millilitre de tampon de télécopie et remettez en suspension les cellules d’échantillon dans quatre millilitres de tampon de télécopie.

Ajoutez de l’iodure de propidium aux cellules d’échantillonnage et aux contrôles d’isotype ainsi qu’au pi. Tube de contrôle monocolore. Pipetez les cellules dans des tubes de télécopie à travers le capuchon de la crépine cellulaire pour éliminer les amas restants qui pourraient affecter le cytomètre.

Configurez l’instrument de télécopie à l’aide d’une seule couleur et d’une seule commande d’isotype. Triez les cellules d’échantillonnage selon le protocole écrit qui les accompagne et collectez chaque population séparément. Et un tube de collecte de 3,5 millilitres Les progéniteurs myogéniques viables sont la population qui est hulked et alpha sept, un PC positif et PI CD 31 FE CD 45 FE et ska.

Un PE de taille sept, les progéniteurs adipogènes viables négatifs sont écrauchés et ska, un PE de taille sept positif et pi, CD 31, FE, CD 45, FE et alpha sept, un PC négatif. Une seule souris de type sauvage peut donner environ une fois 10 à la cinquième progéniture adipogénique, et 1,5 à deux fois 10 à la cinquième. Progéniteurs myogéniques avec une viabilité supérieure à 95 %.

Pour préparer les cellules à la transplantation dans des souris hôtes, les cellules sont lavées. La première centrifugeuse a déformé les cellules à 1500 tr/min pendant cinq minutes. Retirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS et transférez-les dans des tubes einor.

Centrifugez les tubes à 3000 tr/min pendant cinq minutes et retirez le surnageant. Ensuite, les progéniteurs myogéniques en suspension dans le PBS ou les progéniteurs adipogènes dans le matrigel matrigel à environ 10 à six cellules par millilitre. Après avoir préparé les souris hôtes anesthésiées pour chaque type de cellule donneuse, selon le protocole écrit, utilisez une seringue à insuline de trois dixièmes de centimètre cube pour injecter 20 microlitres environ 20 000 cellules de progéniteurs myogènes ou adipogènes.

Prévoyez suffisamment de temps pour que les cellules transplantées se différencient, généralement environ trois semaines. Ensuite, isolez le tissu cible et préparez-le pour la cryosection comme décrit dans le protocole de cette figure, la stratégie de tri est démontrée pour isoler les progéniteurs adipogènes et myogéniques Les cellules viables ont été identifiées sur la base de la diffusion vers l’avant et la coloration de l’épervier à diffusion latérale a été utilisée pour exclure un débris nucléaire et la coloration à l’iodure de propidium ou à l’IP a été utilisée pour exclure les cellules mortes, Les cellules hématopoïétiques et endothéliales, ou respectivement les cellules CD 45 et CD 31, ont ensuite été exclues des portes de tri. Enfin, le sous-ensemble qui est alpha sept positif.

SKA un négatif contient tous les progéniteurs myogéniques et la population qui est alpha sept négatif. SKA un positif contient tous les progéniteurs adipogènes La fluorescence moins un isotype des contrôles confirment la spécificité de la coloration. De plus, des contrôles de pureté des sous-ensembles adipogéniques et myogéniques ont été effectués.

Après tri dans cet exemple représentatif, les cellules donneuses progénitrices adipogéniques exprimant une phosphatase alcaline humaine transgénique injectée par voie sous-cutanée peuvent être identifiées dans le tissu hôte par histochimie, comme l’indique la coloration brune. Cellules donneuses progénitrices myogéniques exprimant transgénique. La phosphatase alcaline humaine injectée par voie intramusculaire a été identifiée dans cette coupe de tissu, comme le montre le brun.

Utilisation de l’histochimie Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle a fonctionné correctement. Si plus d’échantillons sont traités, le temps augmentera. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de travailler rapidement et doucement.

Par conséquent, évitez de traiter trop d’échantillons à la fois. L’allongement du temps de traitement réduira considérablement la variabilité cellulaire à la suite de cette procédure. D’autres méthodes telles que l’analyse de l’expression du colono SC OG par R-T-P-C-R peuvent également être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : comment ces cellules pro réagissent-elles aux dommages in vivo après leur développement ?

Cette technique a ouvert la voie à d’autres chercheurs dans le domaine de la régénération tissulaire pour explorer l’interaction entre les cellules pro dans les tissus endommagés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dissocier ces tissus sans dommage. Les cellules progénitrices identifient les cellules progénitrices en fonction de leurs marqueurs de service et analysent leur potentiel de développement in vivo.

Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans votre expérience.