Interférences ARNi par injection dans les ARNdb Drosophile Embryons

L'objectif général de cette procédure est d'inhiber l'expression du gène endogène en injectant des embryons de drosophile avec de l'ARN double brin afin d'identifier les gènes nécessaires au développement des organes. Cela est réalisé en premier lieu en collectant et en alignant les embryons en ligne droite. Ensuite, des aiguilles sont préparées et utilisées pour injecter de l'ARN double brin dans les embryons.

Enfin, les embryons sont placés dans une chambre humide pour se développer. En définitive, des résultats peuvent être obtenus afin de révéler des défauts de fusion des branches trachéennes de drosophile par marquage immunohistochimique d'embryons en stade tardif, ou par observation de larves au microscope en champ clair. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le crible génétique direct pour identifier les gènes nécessaires au développement d'organes, est qu'il s'agit d'une approche génétique inverse relativement simple et rapide permettant d'analyser les fonctions des gènes avant qu'un mutant pour ce gène ne soit disponible.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, comme l'identification des gènes essentiels requis pour le développement du système trachéal de D. Ce modèle est excellent pour étudier la morphogenèse d'organes de mammifères tels que les voies respiratoires, le système circulatoire, les canaux rénaux et l'épithélium exploratoire. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il faut du temps pour maîtriser des techniques telles que l'alignement des embryons, la rupture des aiguilles et l'injection d'ARN monocaténaires dans les embryons.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la quantité d'ARN double brin injectée varie selon les embryons, et il peut être difficile de décrire par écrit l'aspect des embryons syncytiaux au stade blastoderme. Ces étapes sont difficiles à maîtriser, car l'injection de quantités appropriées d'ARN double brin dans des embryons syncytiaux au stade blastoderme constitue une étape cruciale pour inhiber efficacement l'expression des gènes endogènes.

Pour commencer, installer des cages à 25 degrés Celsius en utilisant des mouches W 1 1 1 8 âgées de deux à quatre jours, et changer les plaques de jus de raisin toutes les heures pendant la journée afin de synchroniser la collecte des œufs sur une période d'un à deux jours. Avant la collecte, récupérer des embryons syncity ou blaster derm pendant une heure à 25 degrés Celsius, puis découper légèrement une ligne au milieu d'un morceau rectangulaire d'agar au jus de raisin à l'aide d'une lame de rasoir.

Utilisez une sonde métallique pour transférer les embryons depuis la plaque de jus de raisin vers le morceau de jus de raisin.Agar. Alignez environ 50 embryons en ligne droite, leurs axes les plus longs formant un angle de 45 degrés par rapport à la ligne située au milieu de l'agar. Veillez à ce que tous les embryons soient orientés dans la même direction, leurs extrémités postérieures pointant vers l'extérieur de la ligne.

Coupez un morceau rectangulaire de ruban adhésif double face et fixez-le sur une lame de couverture de 18 sur 18 millimètres. Ramassez les embryons à l’aide du ruban adhésif placé sur la lame de couverture. Placez la lame de couverture sur une lame en verre.

Appuyez légèrement les embryons contre le ruban adhésif double face et laissez-les sécher à l'air pendant environ 10 minutes. Recouvrez les embryons d'une fine couche d'huile de carbone 700 halo. Attendez environ 10 minutes jusqu'à ce que les embryons apparaissent clairs au microscope.

Les aiguilles sont préparées pour la microinjection en tirant des tubes capillaires en verre. Nous utilisons un tireur d'aiguilles de World Precision Instruments avec les paramètres de programme suivants : chaleur un, délai quatre, arrière.

Chargez l'aiguille avec deux microlitres d'ARN double brin à l'aide d'une pipette Einor P 20 munie de pointes microchargeurs einor. Préparez une lame avec un coverslip propre posé dessus et fixez-les ensemble avec du ruban adhésif. Placez l'aiguille remplie contre le bord du coverslip afin de former une pointe bien définie.

De l'ARN double brin s'échappe de l'extrémité de l'aiguille. Lorsque la pédale du pied du pompeur pico est enfoncée, préparez une lame avec une goutte d'huile au centre. Insérez l'aiguille dans la goutte d'huile.

Régler le dispositif de la pompe pico pour expulser de 100 à 200 picolitres d'ARN double brin lorsque la pédale est enfoncée. L'ARN double brin peut être observé sous la forme d'une petite goutte positionnée.

La pointe de l'aiguille située à la partie postérieure du premier embryon appuie sur la pédale du pied du pico-pompe. L'ARN double brin apparaîtra comme un petit volume au site d'injection.

Terminer l'injection d'ARN double brin dans les embryons sur la lame. Éliminer tous les embryons non mutés pour le gène blaster derm. Placer la lame couvre-objet dans une chambre humide fermée, comme une boîte de Pétri en plastique, à 18 degrés Celsius jusqu'à ce que les embryons atteignent le stade embryonnaire ou larvaire souhaité.

Pour les embryons ayant atteint le stade embryonnaire souhaité, utilisez une sonde pour les détacher du ruban adhésif double face et les pousser vers le bord de la lame. Rincez les embryons avec de l'heptane dans un flacon de collecte muni d'une maille en nylon au fond. Lavez les embryons trois fois avec du PB en les trempant 5 minutes dans une solution de 50 % d'eau de Javel, puis rincez-les à nouveau trois fois avec du PBT.

Transférez les embryons du flacon de collecte vers un morceau de maille en nylon à l’aide d’une pipette, puis plongez le morceau de maille en nylon dans la solution de fixation. Fixez les embryons pendant 30 minutes. Éliminez la couche inférieure de la solution de fixation.

Ensuite, fixez les embryons avec du méthanol, transférez-les dans un tube Eppendorf et effectuez une immunomarquage avec deux anticorps, A 12 et diffusion, en utilisant des protocoles standards de marquage par anticorps pour les embryons ayant atteint le stade larvaire souhaité. Préparez une lame en déposant une goutte d'huile de halocarbone 700 au centre, et placez deux petites lamelles de chaque côté de la goutte d'huile. Transférez une larve sur la lame, puis appliquez une lamelle par-dessus la goutte d'huile.

Observer les larves au microscope en champ clair. Des résultats représentatifs de l'injection d'ARN double brin par diffusion et d'ARN double brin GFP sont présentés ici.

Les embryons injectés avec de l'ARN double brin GFP montrent une fusion trachéenne normale et la protéine de diffusion est présente dans les cellules de fusion. Les flèches indiquent les cellules de fusion positives pour la diffusion du tronc latéral et l'astérisque indique l'emplacement de la fusion normale.

Cependant, les embryons injectés avec un ARN double brin montrent une fusion déficiente des branches, et les protéines de diffusion ne sont pas présentes dans les cellules de fusion. Le triangle indique le site de fusion déficiente des branches lorsque les embryons injectés avec un ARN double brin atteignent le stade larvaire. Les larves G-F-P-R-N AI présentent une fusion normale des branches trachéennes, indiquée par un astérisque.

D'autre part, les larves RN AI de diffusion ont présenté un échec de la fusion des branches, indiqué par des triangles. Ces résultats montrent l'effet de l'extinction de l'expression du gène endogène de diffusion par injection d'ARN double brin dans des embryons de drosophile. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'éliminer tous les embryons enseal blaster après leur développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement pour explorer la fonction de gènes nouveaux dans le développement d'organes chez la drosophile. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'inactiver des gènes endogènes en injectant de l'ARN double brin dans des embryons de drosophile.