Name: Localisation des protéines en 3D de la culture de cellules souches neuronales: une méthodologie de visualisation hybride (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Découvrez la localisation 3D des protéines dans les neurosphères de cellules souches neuronales hippocampiques postnatales. Cette méthode combine immunomarquage, microscopie et reconstruction 3D pour visualiser l'expression protéique.

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Nous remercions Evan Dysart et Marc Léonard pour l&#39;assistance technique d&#39;experts dans la production et l&#39;édition vidéo, Matt Cooke pour l&#39;assistance dans la collecte de données, et Sarah Gelbard pour son assistance éditoriale expert. Le travail a été financé par des subventions de fonctionnement de l&#39;Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC, MOP 62626) pour SALB, une initiative stratégique de formation en recherche en santé du programme de subvention pour SALB et SF (Programme de formation des IRSC en lipidomique neurodégénératives, le TGF 9121), et des infrastructures le soutien de la Fondation canadienne de l&#39;innovation et de l&#39;Ontario Innovation Trust à SF. SI a reçu une bourse d&#39;études supérieures de l&#39;Ontario en science et technologie avec la contribution du Consortium de recherche de Parkinson. NV reçoit un Institut du vieillissement des IRSC et le Programme de formation en lipidomique neurodégénératives bourse post-professionnelle. Nous tenons à souligner l&#39;appui de logiciels éducatifs et techniques fournies par Autodesk de recherche.

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres%3A+insights+into+neural+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li>
<li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li>
</ol>

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université d&#39;Ottawa Comité de protection des animaux et le Conseil canadien de protection des animaux.

Ce protocole décrit une procédure pour la culture et de série cryosection post-natale PNJ hippocampe, localiser l&#39;expression des protéines par immunodétection, et enfin reconstruire et analyser la position topographique des cellules immunopositives au sein de l&#39;ensemble Neurosphère 3D. En combinant la biologie cellulaire et la culture des techniques de traitement, l&#39;imagerie microscopique (OpenLab, d&#39;improvisation et d&#39;autres logiciels d&#39;analyse d&#39;image), graphique capacités logiciel de montage (Adobe Photoshop), et l&#39;animation 3D et les capacités du logiciel de compositing (Autodesk Maya), nous présentons une méthodologie pour reconstruire la toute composition cellulaire des cultures 3D à partir d&#39;images 2D de série permettant la reconstitution fidèle de la position de cellulaire et l&#39;expression des protéines à travers une culture Neurosphère. Ce protocole peut être combiné avec une efficacité égale à l&#39;enregistrement et la reconstruction de sections minces épifluorescence serial ou confocale Z-piles dans des sections plus épaisses de série. Parce que l&#39;expansion clonale des PNJ unique récapitule la culture Neurosphère de nombreuses étapes observées au cours de la neurogenèse et la gliogénèse en post-natal du cerveau, l&#39;impact de sa structure 3D représente un déterminant important de PNJ sort dans la progéniture exposée au même milieu expérimental 1. Divergences dans la lignée et l&#39;expression des protéines dans le noyau et la périphérie des sections Neurosphère série suggère que plusieurs facteurs physiques, y compris la position des cellules, le stress mécanique et la force de cisaillement jouent un rôle important dans la régulation de la biologie PNJ 2. Par ailleurs, l&#39;expression des protéines connexine, analysé ici, a été démontré que le changement selon le moment où les PNJ sont cultivées comme neurosphères 3D en suspension ou en plaqué sur un substrat de laminine avec fonctionnelle connexine communication médiatisée altérée si les cellules sont cultivées sur plastique et substrat ou en 3D gratuitement flottant cultures 3. L&#39;impact de la position de cellulaires sur le sort de PNJ reste incertaine. Il est techniquement difficile d&#39;analyser l&#39;impact de la localisation spatiale au sein de la culture en 3D sur la biologie PNJ étant donné que l&#39;évaluation antigénique du lignage et de protéines de signalisation requiert la perturbation de l&#39;architecture 3D pour permettre perméabilisation cellulaire et l&#39;accès à toutes les cellules d&#39;anticorps. Ici, nous montrons que la visualisation d&#39;une méthodologie hybride offre un moyen de déterminer si certaines protéines exposition unique dans la culture localisations positionnel 3D, peut être utilisé pour inférer et de tester la fonction des protéines et la réglementation en matière de localisation régionale au sein de l&#39;Neurosphère, et, peut-être plus important , fournit les données de position nécessaires pour étudier l&#39;impact de la topographie 3D et de positionnement sur le destin cellulaire NPC dans la culture 3D.

* Tous les autres réactifs chimiques standard énumérées dans le protocole sont de Sigma-Aldrich. Tous les autres réactifs standard de culture de tissus sont d&#39;Invitrogen.

localisation des protéines en 3d de la culture de cellules souches neuronales: une méthodologie de visualisation hybride

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

L&#39;importance des trois dimensions (3D) de la topographie en influençant souches neurales et de cellules progénitrices (NPC) phénotype est largement reconnue mais difficile à étudier. Lorsque dissociée de cerveau embryonnaire ou post-natale, des PNJ unique prolifèrent en suspension pour former neurosphères. Les cellules filles au sein de ces cultures adoptent spontanément distinctes lignées de développement (neurones, oligodendrocytes, astrocytes et) au cours de l&#39;expansion en dépit d&#39;être exposés au même milieu extracellulaire. Cette progression de récapitule plusieurs des stades observés au cours de la neurogenèse et la gliogénèse en post-natal du cerveau et est souvent utilisé pour étudier la biologie NPC de base dans un environnement contrôlé. Évaluation de l&#39;impact complet de la topographie 3D et de positionnement au sein de ces cultures cellulaires sur le sort de NPC est cependant difficile. Pour localiser et d&#39;identifier les protéines cibles lignées NPC par immunocytochimie, flottant neurosphères doit être plaquée sur un substrat ou coupes sériées. Ce traitement est nécessaire pour assurer perméabilisation cellulaire équivalent et l&#39;accès des anticorps à travers la sphère. En conséquence, les images 2D épifluorescence du cryocoupes ou reconstructions 3D confocale de Z-piles ne peuvent fournir de l&#39;information spatiale sur la position de la cellule au sein discrète physique ou numérique 3D et les tranches ne visualisez pas la position cellulaire dans la sphère intacte. Ici, pour réitérer la topographie de la culture et permettre Neurosphère analyse spatiale de l&#39;expression protéique à travers toute la culture, nous présentons un protocole pour l&#39;isolement, l&#39;expansion et la coupe de série de post-natals neurosphères hippocampique adapté à immunodétection épifluorescence ou confocale de protéines cibles. Connexin29 (Cx29) est analysée comme un exemple. Ensuite, en utilisant un hybride de l&#39;édition graphique et la modélisation 3D des logiciels appliqués rigoureusement à maintenir détails biologiques, nous décrivons comment ré-assembler le positionnement 3D structurelle de ces images et cartographier numériquement cellules marquées au sein de l&#39;Neurosphère complète. Cette méthodologie permet la visualisation et l&#39;analyse de la position cellulaire des protéines cibles et les cellules à travers la topographie de la culture 3D entier et facilitera une analyse plus détaillée des relations spatiales entre les cellules au cours de la neurogenèse et la gliogénèse in vitro. Les deux Imbeault et Valenzuela contribué de façon égale et doivent être considérés conjointe premiers auteurs.

Ici, nous décrivons la façon de produire, développer et immunolabel postnatale hippocampique cellules progénitrices neurales (PNJ) en trois dimensions (3D) de la culture. Ensuite, en utilisant des technologies de visualisation hybride, nous montrons comment des images numériques de cryocoupes immunomarquées peut être utilisé pour reconstruire et cartographier la position spatiale des cellules à travers le immunopositives Neurosphère 3D complet.

Localisation des protéines en 3D de la culture de cellules souches neuronales: une méthodologie de visualisation hybride

L'importance de la topographie tridimensionnelle (3D) dans l'influence du phénotype des cellules souches neurales et des cellules progénitrices neurales (NPC) est largement reconnue, bien qu'elle soit difficile à...

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Nous décrivons ici l'utilisation d'un auto-assemblage en 3 dimensions d'échafaudage à la culture humaine cellules progénitrices neurales. Nous présentons un protocole visant à libérer les cellules de la échafaudages pour être analysés ultérieurement, par exemple par cytométrie en flux. Ce protocole pourrait être adapté à d'autres types cellulaires pour effectuer des études détaillées de façon mécaniste.

La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

Cette vidéo présente le développement et la différenciation des cellules souches neurales humaines au sein d’un échafaudage tridimensionnel. Un revêtement de laminine sur l’échafaudage favorise l’attachement cellulaire, tandis qu’un milieu neural sans facteur de croissance induit la différenciation cellulaire en cellules progénitrices neurales, qui étendent leurs processus au sein d’une architecture poreuse dans plusieurs directions, formant une culture...

Différenciation de cellules souches neuronales humaines en culture 3D à l’aide d’un échafaudage poreux

Source : Gómez-Villafuertes, R., et. al., imagerie en direct suivie d’un suivi de cellule unique pour surveiller la biologie cellulaire et la progression de la lignée de plusieurs populations neuronales. J. Vis. Exp. (2017) &lt;p style='line-height :1.79999999999999998 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'&gt;La vidéo démontre le processus de préparation, d’imagerie et de suivi des cellules souches neurales adultes en temps réel pour étudier les cellules souches cellulaires...

 Imagerie en direct et suivi de cellules uniques pour surveiller la lignée neurale dans les cellules souches neurales adultes

Les cellules souches neurales récoltés dans le cerveau adulte sont de plus en plus utilisés dans des applications allant de la recherche fondamentale du développement du système nerveux à l'exploration des applications cliniques potentielles en médecine régénérative. Cela rend le contrôle rigoureux des conditions d'isolement et de culture utilisés pour cultiver ces cellules essentielles au son des résultats expérimentaux.

Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Dans le but de caractériser les changements dans les miARN sur les cellules souches neurales humaines différenciées (hNSCs), nous décrivons la différenciation des hNSC sur un système tridimensionnel, l’évaluation des changements dans l’expression des microARN par puce PCR miRNA, et l’analyse computationnelle pour la prédiction de la cible miARN et sa validation par double test de luciférase.

Différenciation d&#39;un Neural Stem Cell humaine ligne sur Trois Cultures dimensionnelles, les gènes Analyse des microARN et Putative cibles

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

L’imagerie Live est un outil puissant pour étudier les comportements cellulaires en temps réel. Nous décrivons ici un protocole pour le Time-lapse vidéo-microscopie des cellules du cortex cérébral primaire qui permet un examen détaillé des phases adoptées au cours de la progression de la lignée du primaire des cellules souches neurales au différenciée des neurones et cellules gliales.

Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

Le pipeline décrit est conçu pour la segmentation des ensembles de données de microscopie électronique plus grands que les gigaoctets, afin d'extraire des morphologies de cellules entières. Une fois que les cellules sont reconstruites en 3D, un logiciel personnalisé conçu autour de besoins individuels peut être utilisé pour effectuer une analyse qualitative et quantitative directement en 3D, en utilisant également la réalité virtuelle pour surmonter l'occlusion de vue.

Une méthode pour la reconstruction 3D et l'analyse de la réalité virtuelle des cellules gliales et neuronales

La méthode présentée ici utilise le micromodèle avec l'imagerie quantitative pour révéler l'organisation spatiale au sein des cultures mammifères. La technique est facile à établir dans un laboratoire standard de biologie cellulaire et offre un système tractable pour étudier le modelage in vitro.

Cartographier l'organisation spatiale émergente des cellules mammifères à l'aide de micromodèles et d'imagerie quantitative

Ici, nous présentons un test de co-culture facile à utiliser pour analyser la migration du glioblastome (GBM) sur des neurones à motifs. Nous avons développé une macro dans le logiciel FiJi pour une quantification facile de la migration des cellules GBM sur les neurones, et avons observé que les neurones modifient la capacité invasive des cellules GBM.

Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires

Nous présentons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de modèles de développement néocortical basés sur des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) 2D et 3D, ainsi que des méthodologies complémentaires permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du cilium primaire (PC).

Modèles 2D et 3D à base de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical

Découvrez la localisation 3D des protéines dans les neurosphères de cellules souches neuronales hippocampiques postnatales. Cette méthode combine immunomarquage, microscopie et reconstruction 3D pour visualiser l'expression protéique.

Localisation des protéines en 3D de la culture de cellules souches neuronales: une méthodologie de visualisation hybride

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