Localisation des protéines en 3D de la culture de cellules souches neuronales: une méthodologie de visualisation hybride

Lorsqu'elles sont cultivées en suspension, les cellules progénitrices neuronales isolées à partir de niches neurogènes du cerveau prolifèrent pour former des neurosphères. Nous décrivons ici l'isolement et la section sérieuse de neurosphères postnatales dérivées de l'hippocampe, en suspension libre, afin de localiser l'expression protéique au sein de la neurosphère tridimensionnelle. Nous réaliserons une immunomarquage pour une protéine d'intérêt, dans ce cas précis, Connexin 29, suivi de l'assemblage et de la reconstruction en trois dimensions d'images microscopiques bidimensionnelles de la neurosphère.

La visualisation des protéines dans le contexte de leur structure tridimensionnelle native, comme une neurosphère en suspension libre ou un tissu, permet une meilleure compréhension de la fonction des protéines en fonction de leur emplacement au sein de ces structures, et autorise également l'inférence de règles possibles pour des protéines dont la localisation est connue mais dont la fonction est inconnue. Bonjour, je suis Sophia Ambo du Laboratoire de régénération neuronale à l'Université d'Ottawa. Et je suis Nicholas Valenzuela du Carlton Immersive Media Studio à l'Université Carleton à Ottawa.

Aujourd'hui, nous allons démontrer comment isoler, amplifier et sectionner en série des cellules progénitrices neuronales postnatales issues de l'hippocampe sous forme de sphères nerveuses. Afin de localiser l'expression protéique par immunomarquage, nous utiliserons ensuite des images bidimensionnelles des sections en série de sphères neuronales obtenues après immunomarquage pour illustrer une méthode permettant de reconstruire la localisation cellulaire et protéique dans la structure tridimensionnelle, et ainsi évaluer l'organisation spatiale de l'expression protéique au sein des sphères neuronales. Commençons donc.

Une fois les cerveaux collectés, préparez-les pour les placer sur le mandrin en créant une surface plane afin qu'ils reposent correctement. Cette étape s'appelle le blocage. Bloquez le cervelet à l'aide d'une lame de rasoir et de pinces.

Ensuite, déposez une goutte de colle cyanoacrylate sur le mandrin et fixez-y le premier cerveau, le côté antérieur vers le haut et le côté dorsal tourné vers vous. Procédez de la même manière pour les autres cerveaux ; pour le dernier cerveau, il est prudent de positionner le côté dorsal vers l'arrière, car la coupe est parfois incomplète dans cette direction. Si une coupe incomplète devait survenir, utilisez un scalpel pour sectionner et récupérer le fragment.

La rapidité est essentielle lors de l'étape de collage, car les cerveaux ne doivent pas être exposés à l'air trop longtemps. Une fois tous les cerveaux collés, le mandrin est placé dans le vibrotome et le support est rempli de LCR glacé.

Régler le vibrosectionneur sur une fréquence de 8,5 et une vitesse de 3,5 à 4,5. Amener la lame en contact avec le LCSA et régler la coupe automatique. Nous allons maintenant couper des tranches de 500 microns.

Gardez les tranches contenant l'hippocampe. Placez-les dans une boîte remplie de liquide céphalorachidien (A CSF) glacé et jetez le reste des tranches. Une fois toutes les tranches recueillies, passez à la dissection de l'hippocampe.

À l’aide d’un microscope stéréo, nous prélevons uniquement l’hippocampe dorsal, approximativement entre le bgma à −1,65 millimètre et −2,10 millimètres. Placer les hippocampes dans une boîte vide refroidie sur glace. Lorsque tous les hippocampes ont été collectés à partir des tranches, il est temps de les transférer dans la hotte à flux laminaire pour la dissociation mécanique.

À l’aide d’un scalpel, vaporisez la lame avec de l’éthanol à 70 % et stérilisez-la à la flamme. Coupez le tissu au scalpel jusqu’à ce qu’il apparaisse liquéfié. En utilisant désormais un milieu de dissociation contenant déjà de la DNase et de la protéase neurale, prélèvez le tissu par pipetage et placez-le dans un tube de 15 millilitres.

Pour la digestion enzymatique, placer le tube dans une étuve rotative réglée à 37 degrés et laisser la digestion se dérouler pendant 45 minutes à une heure. Une fois la digestion terminée, ajouter 10 millilitres de PBS stérile pour culture tissulaire afin d'arrêter la réaction enzymatique, puis centrifuger les cellules à 300 ×g pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot.

Dans cinq millilitres de PBS, utilisez une pipette Pasteur et agitez l'échantillon pour dissocier davantage le tissu. Continuez à agiter jusqu'à ce que les morceaux de tissu cessent de diminuer en taille. À ce stade, reconstituez à nouveau le culot cellulaire.

Éliminez le PBS et resuspendez le culot dans trois millilitres de milieu de maintenance. Une fois que vous avez bien tritué l'échantillon, prélevez un aliquot de 15 microlitres et mélangez-le avec un volume égal de bleu de trypan.

Prélevez deux échantillons de 10 microlitres et chargez un cytomètre hématique pour le dénombrement cellulaire. Comptez les cellules sur trois champs dans chaque section, soit un total de six champs. Faites la moyenne des nombres pour calculer la densité cellulaire.

Tenir compte du fait que l'échantillon est dilué. Dans la plaque au bleu de trypan, placer les cellules dans des boîtes à faible adhérence à une densité de 2,5 × 10⁵ cellules par boîte, dans un volume final de cinq millilitres de milieu de maintenance. Si des boîtes à faible adhérence ne sont pas disponibles, vous pouvez utiliser des boîtes de Pétri.

Dans ce cas, vous devrez tapoter délicatement les neurosphères le matin et l'après-midi chaque jour pendant les six premiers jours afin d'empêcher les neurosphères d'adhérer au fond de la boîte. Ajoutez EG, F et FGF avant de placer les boîtes dans l'incubateur. Ces facteurs de croissance devront être renouvelés tous les deux jours pendant toute la durée de la culture. Au jour 14 in vitro, fixez les neurosphères à l'aide de formaldéhyde pour obtenir une concentration finale d'environ 4 % en l'ajoutant directement à la culture, puis incubez pendant 20 minutes à température ambiante.

Resuspendre les cellules en centrifugant à 300 ×g pendant cinq minutes. Laver les cellules deux fois avec du PBS et les resuspendre dans une solution de saccharose à 15 à 20 % préparée dans un tampon phosphate 10 millimolaire. Laisser la cryoprotection se faire à quatre degrés pendant au moins 24 heures avant la sectionnement sur cryostat.

Retirer les neurosphères cryoprotégées du réfrigérateur et les placer dans une boîte de 60 millimètres. Pour la coupe en série, où la collecte de chaque section individuelle est essentielle, j'ai trouvé préférable de sélectionner des neurosphères de bonne taille et de bonne forme à l’aide d’un microscope stéréo ; à l’aide d’une pipette, placer une neurosphère dans un moule cryo rempli de composé OCT. Marquer l’emplacement où se trouve la neurosphère sur le moule cryo.

Cette étape permettra de localiser la neurosphère lors de la coupe. Une fois cinq à dix sphères placées rapidement dans le moule, les congeler à l'aide de CO2. En utilisant les repères sur le moule cryogénique, indiquer directement sur le bloc OTC congelé l'emplacement des neurosphères.

Retirez le bloc OCT du moule et placez-le sur le porte-échantillon du cryostat. Fixez le moule au porte-échantillon à l'aide de CO2 et insérez-le dans le cryostat. Laissez les échantillons s'équilibrer pendant au moins 30 minutes.

Une fois cette étape terminée, effectuez rapidement la coupe aux repères indiqués sur le moule, puis commencez à récupérer chaque section à partir de ce moment. Vérifiez à l'aide d'un microscope optique l'endroit où commencent les tranches de neurosphères. Une fois la sectionnement terminé, rangez les lames dans un congélateur jusqu'à ce que vous soyez prêt à réaliser l'immunohistochimie. Pour cette étape, sortez les lames contenant l'une des neurosphères coupées en série et incluez les lames avec les cinq sections précédentes et les cinq sections suivantes.

Cela garantira que vous imageriez l'ensemble de la neurosphère. L'utilisation d'une coloration nucléaire de contre-coloration sera indispensable afin de repérer toutes les sections de votre neurosphère. Gardez cela à l'esprit lorsque vous planifiez votre coloration immunohistochimique tout en traitant les lames en appliquant du PBS et en laissant atteindre la température ambiante pendant au moins cinq minutes ; nous utilisons un tampon d'anticorps contenant 0,3 % de Triton X-100 pour la perméabilisation et 3 % d'albumine de sérum bovin pour le blocage.

Diluez votre anticorps primaire de manière appropriée dans ce tampon et incubez-le dans la chambre humaine toute la nuit à quatre degrés. Utilisez du PBS pour faire flotter le paraforme hors des neurosphères et retirez-le soigneusement à l’aide de pinces. Ceci constitue le premier des quatre lavages au PBS de cinq minutes chacun.

Appliquer l'anticorps secondaire sur les lames et les incuber à température ambiante pendant une heure. Comme précédemment, faire flotter le paraforme hors de la lame à l'aide de PBS et l'éliminer à l'aide de pinces. Là encore, il s'agit du premier des quatre lavages au PBS de cinq minutes.

Lors du troisième lavage, nous ajoutons le HOS 3 3 2, 5 8 comme coloration de contre-marquage nucléaire, dilué à 0,5 microgramme par millilitre. Un dernier lavage de cinq minutes dans le PBS suit le lavage au HOS. Une fois tous les lavages terminés, appliquez une quantité généreuse de milieu de montage sur la face inférieure de la lame et recouvrez d'une lamelle en verre.

Fixez les coins avec du vernis à ongles. Une fois que toutes les lames sont recouvertes de lamelles, fixez les bords restants des lamelles. Observez la lame immédiatement ou conservez-les à moins 20 jusqu'à ce que vous soyez prêt à le faire.

Lors de l'imagerie, la localisation des cellules sur la lame est la partie la plus difficile ; il sera facile de détecter les cellules appartenant à la sphère si vous les recherchez à l'aide de la contre-coloration nucléaire. Une fois que vous aurez trouvé le début de la neurosphère, qui peut ne comprendre que quelques cellules, imagez chaque section à partir de ce point. Prenez des clichés de la coloration nucléaire, de votre ou vos protéines d'intérêt, ainsi qu'une image en contraste de phase.

Cette image en contraste de phase sera très importante lors des étapes de modélisation. Des images avec des barres d'échelle intégrées de 10 micromètres et de 50 micromètres, établies dans le logiciel Open Lab 3.56, sont importées dans Photoshop CS4 en utilisant une taille de canevas standard de 3 300 par 2 550 pixels.

Toutes les images des coupes sérielles sont enregistrées en tant que fichiers TIFF en conservant la taille standard du canevas. Ouvrez les images de contraste des phases première et seconde des coupes sérielles des neurosphères. Augmentez la transparence de la seconde coupe dans l'onglet image, ouvrez la rotation de l'image et choisissez une orientation arbitraire.

Faites pivoter la deuxième section jusqu'à ce que vous puissiez identifier des points de continuité géométrique et structurelle entre les images. Répétez cette opération pour toutes les sections sérielles, en enregistrant chaque section comme un calque distinct. Assurez-vous que chaque calque d'image correspondant à la phase et à l'expression protéique soit lié, de sorte que tous les pivots pour chaque canal soient effectués simultanément.

Créez un plan dans Maya ayant les mêmes proportions que le fichier Photoshop, en vous référant à la ligne d'état de l'interface utilisateur de Maya. Passez la barre de menus de son paramètre d'animation par défaut aux surfaces. Utilisez une sphère de subdivision primitive pour créer le corps de la cellule avec la sphère sélectionnée.

Commencez à manipuler ses sommets en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l'objet et en sélectionnant « vertex » dans le menu contextuel. Ensuite, précisez davantage la surface de la sphère en modifiant le niveau d'affichage à partir du menu contextuel, dans l'onglet des surfaces de subdivision du menu principal. Ouvrez la boîte d'options « collapse hierarchy » et réglez le nombre de niveaux sur deux.

Réduisez la sphère. Passez de la barre de menus des surfaces à celle des polygones avec la sphère sélectionnée. Ouvrez l'outil de géométrie de sculpture à partir de l'onglet maillage du menu principal.

Parfaire la surface de la cellule pour lui donner sa forme finale. Utiliser l'ensemble d'outils de sculpture de géométrie dans l'onglet des paramètres d'outils. Répéter ce processus pour chaque cellule de votre typologie afin de simuler la variété des cellules progénitrices présentes dans les neurosphères.

Dans cette démonstration, 10 cellules progénitrices différentes constitueront la base de la neurosphère. Sélectionnez la typologie cellulaire et figez les transformations avec les cellules de votre typologie. Deux shaders de surface seront conçus pour représenter à la fois les cellules exprimant la protéine connecte à 29 et les cellules où la protéine est absente.

Ouvrez la fenêtre hyper shade à partir de l'onglet éditeur de rendu des fenêtres du menu principal. Sélectionnez un nuanceur de dégradé dans l'onglet matériaux de surface. Ouvrez l'éditeur d'attributs et réglez les attributs de couleur du nuanceur, couleur ambiante incandescente, carte de relief et couleur spéculaire.

Attribuez une texture 3D brownienne au nœud de couleur ambiante et une texture fractale 2D au nœud de mappage de relief. Sélectionnez les connexions d'entrée et de sortie du shader résultant et exportez le réseau sélectionné. Sélectionnez la typologie cellulaire et ouvrez la boîte d'options d'exportation de la sélection.

Choisissez le type de fichier Maya A-S-C-I-I et décochez la case inclure ces entrées pour l'exportation de la sélection. Ouvrez le fichier des sections sérielles alignées dans Adobe Photoshop. Établissez une clé de traits de crayon afin de marquer l'emplacement de chaque cellule progénitrice dans les sections sérielles.

Dans cette démonstration, une clé composée de trois traits. Un carré plein. Un carré avec une ligne en pointillés et un carré avec une croix seront utilisés pour indiquer si une cellule se trouve dans une, deux ou trois sections.

Cette clé de traits est en outre définie par la couleur rouge représentant les cellules exprimant la connexion 29 et la couleur blanche représentant les cellules n'exprimant pas la connexion 29. Activez la couche de contraste de phase et commencez à marquer le centre de chaque cellule progénitrice à l’aide d’un trait de crayon blanc. Utilisez une couche distincte dans le dossier de section pour créer vos cartes.

Basculer entre les sections pour localiser la position de la cellule, en veillant à ce que les cellules présentes sur plusieurs sections soient correctement indiquées. Avec la couche CX 29 activée, sélectionner les cellules situées dans les régions où CX 29 est exprimé positivement.

Choisissez la commande de remplissage dans l'onglet Édition de la barre de menu principale de Photoshop et changez les traits blancs en rouge une fois les cartes terminées. Enregistrez chaque section sous forme d'une image JPEG distincte dans le dossier des images sources du projet Maya. Pour ce faire, un nouveau projet Maya devra d'abord être créé à partir de la ligne de statut de l'interface utilisateur de Maya.

Modifiez la barre de menu à partir de son paramètre d'animation par défaut pour importer les plans sous forme de polygones. Importez les fichiers ma et la barre d'échelle. Fichiers ma à partir du dossier des projets vus avec le plan sélectionné.

Attribuez un shader Lambert en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l'objet et en ouvrant l'onglet attribuer un nouveau matériau dans l'éditeur d'attributs. Cliquez sur la case quadrillée située à droite de l'attribut de couleur du matériau dans le menu contextuel. Choisissez fichier dans la section de texture 2D sous la section d'attribut de fichier dans l'éditeur d'attributs.

Cliquez sur l'icône de fichier située à droite de l'attribut du nom de l'image. Sélectionnez la première section dans le dossier des images sources. Passez de la vue en perspective à la vue supérieure orthographique par défaut dans la fenêtre de l'espace de travail en ouvrant l'onglet de ce panneau.

Sélectionnez l'outil de création de polygone dans l'onglet maillage du menu principal et tracez le contour de la section. Choisissez la première carte dans le dossier des images sources et attribuez-la au plan polygonal nouvellement créé. Après avoir suivi les étapes établies pour créer le plan polygonal avec l'objet sélectionné, choisissez UV dans le menu contextuel en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le plan.

Sélectionnez tous les points UV des plans et ouvrez l’éditeur de textures UV à partir de l’onglet fenêtres du menu principal, puis redimensionnez proportionnellement les UV pour qu’ils s’ajustent au plan de coupe. Répétez ce processus pour chaque section de la neurosphère, en veillant à ce que les espaces entre chaque section correspondent à la hauteur de la barre d’échelle provenant de la ligne d’état de l’interface utilisateur de Maya. Passez la barre de menus de son paramètre d’animation par défaut à dynamique, en laissant uniquement la première section de la neurosphère visible.

Masquer toutes les autres sections en modifiant les paramètres d'affichage à partir de l'onglet affichage du menu principal avec la boîte d'options des outils de courbe CV ouverte, sélectionnez une option linéaire dans les paramètres de courbe CV. En visualisant la scène depuis la caméra vue de dessus, commencez à attribuer des points aux cartes cellulaires en créant une courbe pour les cellules CX 29 négatives et une courbe pour les cellules CX 29 positives. Les courbes obtenues sont plates lorsqu'elles sont vues depuis la caméra vue de côté.

Estimez l'épaisseur des sections en déplaçant les points de la courbe sur l'axe Y, en utilisant la barre d'échelle comme référence. Répétez ce processus pour chaque section de la neurosphère.

Importez le fichier de typologie cellulaire .ma à partir du dossier scenes du projet et dupliquez la typologie cellulaire pour les progéniteurs CX 29 négatifs et les progéniteurs CX 29 positifs. Ouvrez la fenêtre hyper shade à partir de l'onglet éditeurs de rendu du menu principal.

Importez les shaders précédemment créés en les attribuant aux cellules de la typologie depuis la fenêtre d'organisation. Supprimez le nom du fichier au début des objets importés. Cela deviendra important lors des étapes ultérieures du processus de modélisation.

Sélectionnez l'onglet particules dans le menu principal et créez un émetteur de particules pour la première courbe CV. Ouvrez l'onglet de forme de particule un et, dans les attributs d'émission, modifiez le nombre maximal, passant de moins un au nombre de points de votre première courbe. Dans l'onglet attributs de rendu, changez le type de rendu des particules en surface « blobby ».

Cliquez sur la zone du type de rendu actuel ci-dessous et modifiez le rayon des particules à 0,01. Attachez les particules aux sommets de la courbe en sélectionnant d'abord les particules, puis en maintenant la touche Maj enfoncée tout en sélectionnant la courbe.

Ouvrez les options de l'objectif dans l'onglet des particules du menu principal et réglez le poids de l'objectif à un. Cliquez sur créer. Sélectionnez les cellules de un à 10 dans l'ordre, dans la fenêtre d'aperçu, puis ouvrez la boîte des options de remplacement instantané depuis l'onglet des particules du menu principal.

Dans la boîte des objets d'instance, les 10 cellules doivent être répertoriées dans l'ordre. Choisissez le nom correct de la forme de particule dans la liste déroulante de l'onglet « Particule à instancier ». Cliquez sur Créer. Par défaut, seule la première cellule sélectionnée remplace les particules le long de la courbe ; pour que les 10 cellules apparaissent et alternent aléatoirement parmi les particules, une expression est nécessaire.

Une deuxième expression garantira que les cellules émettent de manière aléatoire de la même façon à chaque fois. Le curseur de plage est repositionné avec l'émetteur sélectionné. Ouvrez l'éditeur d'attributs dans l'onglet de forme de particule, sous Ajouter un attribut dynamique.

Cliquez sur la case générale sous le nom long. Saisissez un index_au_hasard dans le type d'attribut, puis passez de tableau scalaire à tableau par particule, et cliquez sur ajouter dans l'onglet attributs du tableau par particule. Une case index_au_hasard a été ajoutée.

Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l'espace vide et sélectionnez créer une expression dans la zone déroulante. Saisissez le texte suivant dans la zone d'expression pour compléter celle-ci. Ouvrez l'onglet de remplacement géométrique de recherche instantanée dans l'éditeur d'attributs et dans l'index d'objet des options générales.

Sélectionnez un index aléatoire souligné dans la liste déroulante. Placez le curseur temporel sur la première image et cliquez sur lecture. Les types cellulaires sont désormais répartis aléatoirement parmi les particules.

Répétez ce processus pour chaque section de la neurosphère. Veillez à ce que chaque nouvelle instance d'émetteur et chaque index aléatoire soient différenciés par leur nom et correctement organisés dans la fenêtre d'organisation du rendu. À l'aide de la section des paramètres de rendu, modifiez le moteur de rendu de Maya Software à Mental Ray.

Ouvrez l'onglet qualité et, dans le suivi de rayons, réglez la réflexion sur zéro. Ouvrez l'onglet tampon de trame et modifiez le clip de couleur de brut à alpha, puis décochez Pré-multiplier.

Ouvrez l'éditeur de calques de la boîte de canal et modifiez les paramètres de l'éditeur de calques de l'affichage au rendu. Sélectionnez les cellules importées de la typologie, puis cliquez sur l'icône créer un nouveau calque et assigner les objets sélectionnés. Renommez le calque « occlusion ambiante ».

En cliquant avec le bouton droit de la souris sur le calque nouvellement créé, sélectionnez les attributs dans le menu situé à droite de la zone de calque de rendu. Cliquez sur le bouton préréglages et sélectionnez l'occulsion dans la liste déroulante. Sélectionnez l'onglet MIB underscore AMB underscore occlusion un et modifiez les échantillons de 16 à 2 56.

Réouvrez l'éditeur de calques de la boîte de canal et, sous l'onglet options, ouvrez la boîte des options de rendu de tous les calques, sélectionnez « composite » et conservez les calques avec le calque d'occulsion ambiante activé. Modifiez le mode de ce calque de « normal » à « multiplication » dans la liste déroulante située juste au-dessus de la liste des calques. Rendez deux passes de la neurosphère, une fois avec le calque d'occulsion ambiante activé et une fois avec le calque maître activé. Enregistrez les images au format IFF dans le dossier d'images du projet.

Ouvrez les deux images dans Adobe Photoshop. Placez le calque d'occlusion ambiante au-dessus du calque maître et réglez-le en mode multiplication. Créez un arrière-plan et aplatissez l'image.

Nous venons de vous montrer comment cultiver des cellules neurogènes issues de l'hippocampe sous forme de neurosphères, comment réaliser des coupes sérielles de cultures de neurosphères à l'aide d'un cryostat et comment effectuer une immunomarquage pour une protéine d'intérêt. Nous vous avons également montré comment modéliser la localisation spatiale de l'expression de cette protéine en trois dimensions en combinant culture cellulaire, alignement d'images et logiciel de modélisation tridimensionnelle.

Nous espérons que cela vous sera utile et vous souhaitons bonne chance dans vos expériences.