Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

Je suis Troy Gasai. Nous allons parler d'un test sur tranches organotypiques qui a été perfectionné dans mon laboratoire au cours des dernières années. Ben Jacket, de mon laboratoire, vous montrera comment ce test est réalisé.

Le test sur tranches organotypiques du cerveau postnatal est une méthode puissante permettant d'évaluer divers facteurs et leur rôle dans la migration neuronale au niveau du cerveau postnatal et du flux migratoire TRO. Bonjour, je suis Ben Jakay, chercheur postdoctoral dans le laboratoire du Dr. Troy GGE à la faculté de médecine vétérinaire de l'Université d'État de Caroline du Nord. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment nous réalisons des greffes croisées de tissus entre des tranches cérébrales organotypiques de souris afin de visualiser les neuroblastes en migration dans le cerveau postnatal.

Toutes les techniques décrites dans cette vidéo doivent être réalisées dans un environnement stérile, de préférence dans une hotte à flux laminaire en utilisant des outils stérilisés. Une goutte de 150 microlitres de milieu pour tranches est placée au centre de la partie inférieure en verre de la boîte à l’aide d’une seringue jetable équipée d’une aiguille de calibre 23. Plusieurs points de colle sont déposés à l’extérieur du fond circulaire en verre du coverslip, en laissant un côté non collé pour permettre l’échange de fluide. Une membrane de pore nucléaire est ensuite déposée délicatement sur le milieu à l’aide de micro-forceps, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit piégée sous la membrane.

Les pinces courbes sont ensuite utilisées pour aplatir les points de colle et fixer la membrane en place. Un millilitre de milieu pour tranches est ajouté au-dessus de la membrane, puis finalement, les boîtes sont placées dans un incubateur jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les tranches sont préparées à partir de souris jeunes postnatales, de P un à P dix. Tout d'abord, la tête est stabilisée en tenant le museau avec des pinces microchirurgicales.

La peau est excisée longitudinalement depuis la nuque jusqu'au museau. Le cuir chevelu est décollé pour exposer l'os, et le crâne est sectionné longitudinalement et antérieurement à partir de la grande sternoïde en effectuant une incision médiane et deux incisions latérales, une de chaque côté. Il convient de minimiser le contact avec le tissu cortical sous-jacent.

Alors que les lamelles crâniennes sont retirées du cerveau afin d'améliorer la stabilité du tissu. Pendant la sectionnement au vibrotrancheur, les régions latérales et caudales du cerveau sont éliminées à l'aide d'une lame de rasoir. Les deux hémisphères sont soigneusement prélevés du crâne et placés, avec la surface médiale vers le bas, dans un moule d'inclusion.

Ils sont immédiatement recouverts d'un gel d'AGA roses à 3 % de qualité ADN fondu, dissous dans un tampon de préparation tissulaire maintenu à 37 degrés Celsius. Après deux minutes de stabilisation sur une surface horizontale plane. Pour garantir un durcissement uniforme des AGA roses, les moules sont placés sur de la glace afin de terminer la prise.

Une fois que le gel contenant les hémisphères est solidifié, il est retiré du moule et taillé autour du tissu cérébral. Le tissu inclus dans le gel est ensuite monté sur le plateau d'échantillonnage du vibrotome avec la surface médiale vers le haut et fixé à l'aide d'un adhésif cyanoacrylate. Le plateau est ensuite installé dans le bac d'échantillonnage du vibrotome rempli de milieu de préparation tissulaire glacé, et le cerveau est sectionné à une épaisseur de 150 micromètres.

Une fois que les tranches contenant la SRM sont libérées de la lame, elles sont délicatement prélevées à l’aide d’une petite spatule plate et placées à plat au centre des boîtes de culture. Il est essentiel de manipuler les tranches le moins possible, car le tissu est très fragile. La quantité de milieu dans les boîtes de culture est ajustée de manière à être suffisante pour recouvrir les sections cérébrales tout en empêchant leur déplacement.

Les boîtes sont étiquetées et transférées dans une étuve. Les cerveaux de donneur sont préparés de manière similaire à celle des cerveaux de receveur, sauf que les sections sont coupées à une épaisseur de 250 µm et que les tranches sont recueillies sur de la glace.

Préparation du tissu froid. Les tranches de tissu sont immédiatement placées sous un microscope stéréo doté d'une capacité de fluorescence en épi-illumination. La SRM est visible comme une structure en forme de U de couleur grise s'étendant de la zone subépendymaire jusqu'au bulbe olfactif.

Le SMS est délicatement microdisséqué à l’aide de micro-forceps. Une pince sert à stabiliser la coupe tandis que l’autre permet d’effectuer de petites incisions autour du SMS jusqu’à ce qu’il soit libéré de la coupe. Le SMS excisé est ensuite découpé en petits explants d’environ 200 à 500 micromètres de diamètre.

Dans cet exemple, des greffons sont préparés à partir de souris exprimant la protéine fluorescente rouge, TD-tomate. Les boîtes inférieures contenant les tranches d'hôte sont retirées de l'incubateur et placées sous le microscope stéréoscopique en utilisant la lumière visible. Une petite incision est pratiquée dans le segment initial de la SRM, puis, à l’aide d’une pipette équipée d’une pointe de 20 microlitres, un greffon unique de SRM donneur est transféré au site incisé dans la SRM de l’hôte.

L'explants est doucement poussé dans l'incision afin d'établir un contact entre les deux tissus. Pour garantir que ce contact soit stable, l'explants est enfoncé légèrement entre la tranche et la membrane pauvre en noyaux. Les boîtes sont ensuite replacées dans l'incubateur pendant au moins une heure, afin de permettre aux sections de s'ancrer sur la membrane.

Les neuroblastes devraient commencer à migrer à partir de l'explante vers la RMS hôte après environ une à deux heures. La migration cellulaire est mieux visualisée à l'aide d'objectifs de puissance 20 à distance de travail extra longue. Les tissus cultivés sont transférés de l'incubateur vers une chambre chauffée placée sur le microscope.

Les neuroblastes fluorescents peuvent être imagés à des intervalles allant de zéro à 10 minutes, selon le type d'analyse souhaité. Notre protocole de culture organotypique de tranches a été rigoureusement testé et optimisé au cours des dernières années afin d'assurer une régularité dans le schéma et l'orientation de la migration dans la RMS. Dans cet exemple, l'analyse des cellules immigrantes à partir d'explantés, obtenus chez des souris dans lesquelles le TD-tomate est exprimé sous le promoteur nestin, révèle une migration fortement orientée et rapide vers la RMS hôte.

Grossissement élevé. Une analyse en lapse de temps montre une excellente résolution sur toute la longueur d’un neuroblaste en migration au cours d’une session d’imagerie de 20 minutes. Une fois l’imagerie terminée, les tranches peuvent être fixées avec de la paraformaldéhyde à 4 %, fraîchement préparé et glacé, puis immunomarquées pour différents composants du flux de migration.

Dans ce cas, les astrocytes positifs pour la GFAP en bleu et les vaisseaux sanguins positifs pour le CD31 en vert sont mis en évidence par immunohistochimie fluorescente ; une analyse en forte augmentation de tranches marquées pour les protéines du cytosquelette, l’actine en bleu et la tubuline en vert, révèle une expression non uniforme de ces composants par la cellule, en cours de migration. Notre protocole présente certains défis qui exigent de la patience, de la pratique et un investissement conséquent de temps tant dans la préparation que dans l’analyse des résultats.

Voici donc quelques suggestions utiles qui vous aideront à obtenir les meilleurs résultats dans vos expériences. Selon notre expérience, les souris âgées de P1 à P10 donnent les meilleurs résultats. L’appariement par âge entre les cerveaux du donneur et du receveur améliore également la reproductibilité des expériences.

Étant donné que la plupart des réactifs et des boîtes de culture doivent être préparés frais, notre essai sur tranches nécessite plusieurs heures de préparation ininterrompue et d'acquisition d'images en une seule journée. Une fois que les cerveaux ont été prélevés, les étapes suivantes doivent être réalisées aussi rapidement que possible. Entre la décapitation et la préparation des tranches, toutes les étapes doivent être effectuées à l’aide de glace et de réactifs froids, et la manipulation des tissus doit être réduite au minimum afin d’éviter toute perturbation anatomique.

Les outils utilisés pour ces dissections doivent être stériles et réservés uniquement aux manipulations de tissus vivants. N'utilisez jamais d'outils ayant été en contact avec des fixateurs tels que le formaldéhyde. Les tranches sont généralement viables jusqu'à 36 heures, avec une diminution visible de la migration, de la vitesse et de l'orientation entre 24 et 36 heures.

Tenez compte de cette limitation lors de la planification de vos expériences et de votre analyse.