Name: Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Découvrez un test organotypique optimisé pour l'imagerie time-lapse haute résolution de la migration neuronale dans le cerveau postnatal de souris. Cette méthode permet de visualiser les neuroblastes migrateurs par transplantation croisée de tissus.

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Nous tenons à remercier Dan McWhorter pour raconter le protocole dans la vidéo. Ce travail est soutenu par des subventions du NIH 5R01NS062182, une subvention de la Fédération américaine pour la recherche sur le vieillissement, et les fonds institutionnels attribué à HTG.

<ol><li>Ghashghaei, H. T., Lai, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+adult+brain%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the adult brain: are we there yet.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 141-151 (2007).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neocortex%3A+a+perspective+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 724-735 (2009).</li>
<li>Jaglin, X. H., Chelly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-related+cortical+dysgeneses%3A+microtubule+dysfunction+underlying+neuronal+migration+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Tubulin-related cortical dysgeneses: microtubule dysfunction underlying neuronal migration defects.</a> Trends Genet. 25, 555-566 (2009).</li>
<li>Carro, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+network+for+mesenchymal+transformation+of+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The transcriptional network for mesenchymal transformation of brain tumours.</a> Nature. 463, 318-325 (2010).</li>
<li>Wu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+guidance+of+neuronal+migration+in+the+olfactory+system+by+the+protein+Slit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit.</a> Nature. 400, 331-336 (1999).</li>
<li>Hu, H., Tomasiewicz, H., Magnuson, T., Rutishauser, U., U, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polysialic+acid+in+migration+of+olfactory+bulb+interneuron+precursors+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of polysialic acid in migration of olfactory bulb interneuron precursors in the subventricular zone.</a> Neuron. 16, 735-743 (1996).</li>
<li>Shapiro, E. M., Gonzalez-Perez, O., Garcia-Verdugo, M. anuel, Alvarez-Buylla, J., &amp, A., Koretsky, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+the+migration+of+neuronal+precursors+generated+in+the+adult+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of the migration of neuronal precursors generated in the adult rodent brain.</a> Neuroimage. , (2006).</li>
<li>Vreys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+visualization+of+endogenous+neural+progenitor+cell+migration+along+the+RMS+in+the+adult+mouse+brain%3A+validation+of+various+MPIO+labeling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">MRI visualization of endogenous neural progenitor cell migration along the RMS in the adult mouse brain: validation of various MPIO labeling strategies.</a> Neuroimage. 49, 2094-2103 (2010).</li>
<li>Davenne, M., Custody, C., Charneau, P., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+migrating+neurons+in+the+mammalian+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of migrating neurons in the mammalian forebrain.</a> Chem. Senses. 30, Suppl 1. 115-116 (2005).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cells+Confer+Unique+Pinwheel+Architecture+to+the+Ventricular+Surface+in+Neurogenic+Regions+of+the+Adult+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cells Confer Unique Pinwheel Architecture to the Ventricular Surface in Neurogenic Regions of the Adult Brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li>
<li>Polleux, F. &amp, Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. , L9-L9 (2002).</li>
<li>Murase, S. &amp, Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Suzuki, S. O. &amp, Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cell+populations+in+the+early+postnatal+subventricular+zone+take+distinct+migratory+pathways%3A+a+dynamic+study+of+glial+and+neuronal+progenitor+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration.</a> J. Neurosci. 23, 4240-4250 (2003).</li>
<li>Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuregulin-ErbB4+interactions+on+the+proliferation+and+organization+of+cells+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and organization of cells in the subventricular zone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 1930-1935 (2006).</li>
<li>Khodosevich, K., Seeburg, P. H., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+signaling+pathways+in+migrating+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Major signaling pathways in migrating neuroblasts.</a> Front Mol. Neurosci. 2, 7-7 (2009).</li>
<li>Jacquet, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+proliferation%2C+migration+and+differentiation+in+the+postnatal+brain+using+equine+infectious+anemia+virus-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal proliferation, migration and differentiation in the postnatal brain using equine infectious anemia virus-based lentiviral vectors.</a> Gene Ther. 16, 1021-1033 (2009).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par North Carolina State University et de son Collège de médecine vétérinaire. Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La migration neuronale dans le RMS est une composante essentielle de la neurogenèse postnatale dans les bulbes olfactifs 1. La migration à travers le RMS se produit dans un plan tangentiel à la surface du cerveau. Neuroblastes migrent tangentiellement sont distinctes de la migration des cellules radialement basés sur la localisation de leur source progénitrices, ainsi que le sort de leurs divergences produits finis neuronale 1, 2, 3. La population est relativement pure de cellules migrent tangentie...

un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenèse dans le cerveau postnatal dépend du maintien de trois événements biologiques: la prolifération des cellules progénitrices, la migration des neuroblastes, ainsi que la différenciation et l&#39;intégration de nouveaux neurones dans les circuits neuronaux existants. Pour neurogenèse postnatale dans les bulbes olfactifs, ces événements sont séparés dans les trois domaines anatomiquement distincts: la prolifération se produit essentiellement dans la zone sous épendymaire (ZES) des ventricules latéraux, la migration des neuroblastes parcourir à travers le flux migratoire rostral (RMS), et de nouveaux neurones se différencier et intégrer dans les bulbes olfactifs (OB). Les trois domaines servent de plateformes idéales pour étudier les mécanismes cellulaires, moléculaires et physiologiques qui régulent chacun des événements biologiques distinctement. Ce document décrit un essai organotypique optimisé pour les tissus du cerveau après la naissance, dans lequel les conditions extracellulaires imitent l&#39;environnement in vivo pour la migration des neuroblastes. Nous montrons que notre test fournit pour le mouvement uniforme, orienté et rapide des neuroblastes dans le RMS. Ce test sera très approprié pour l&#39;étude de la régulation des cellules autonomes et non autonomes de la migration neuronale en utilisant des approches inter-greffe de la souris sur les différents fonds génétiques.

Ce protocole décrit une analyse organotypique optimisé pour le cerveau postnatal et à haute résolution imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le flux rostrale migrateurs.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

La neurogenèse dans le cerveau postnatal dépend du maintien de trois événements biologiques : la prolifération des cellules progénitrices, la migration des neuroblastes, ainsi que...

Je suis Troy Gasai. Nous allons parler d'un test sur tranches organotypiques qui a été perfectionné dans mon laboratoire au cours des dernières années. Ben Jacket, de mon laboratoire, vous montrera comment ce test est réalisé.Le test sur tranches organotypiques du cerveau postnatal est une méthode puissante permettant d'évaluer divers facteurs et leur rôle dans la migration neuronale au niveau du cerveau postnatal et du flux migratoire TRO. Bonjour, je suis Ben Jakay, chercheur postdoctoral dans le laboratoire du Dr. Troy GGE à la faculté de médecine vétérinaire de l'Université d'État de Caroline du Nord. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment nous réalisons des greffes croisées de tissus entre des tranches cérébrales organotypiques de souris afin de visualiser les neuroblastes en migration dans le cerveau postnatal.Toutes les techniques décrites dans cette vidéo doivent être réalisées dans un environnement stérile, de préférence dans une hotte à flux laminaire en utilisant des outils stérilisés. Une goutte de 150 microlitres de milieu pour tranches est placée au centre de la partie inférieure en verre de la boîte à l’aide d’une seringue jetable équipée d’une aiguille de calibre 23. Plusieurs points de colle sont déposés à l’extérieur du fond circulaire en verre du coverslip, en laissant un côté non collé pour permettre l’échange de fluide. Une membrane de pore nucléaire est ensuite déposée délicatement sur le milieu à l’aide de micro-forceps, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit piégée sous la membrane.Les pinces courbes sont ensuite utilisées pour aplatir les points de colle et fixer la membrane en place. Un millilitre de milieu pour tranches est ajouté au-dessus de la membrane, puis finalement, les boîtes sont placées dans un incubateur jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les tranches sont préparées à partir de souris jeunes postnatales, de P un à P dix. Tout d'abord, la tête est stabilisée en tenant le museau avec des pinces microchirurgicales.La peau est excisée longitudinalement depuis la nuque jusqu'au museau. Le cuir chevelu est décollé pour exposer l'os, et le crâne est sectionné longitudinalement et antérieurement à partir de la grande sternoïde en effectuant une incision médiane et deux incisions latérales, une de chaque côté. Il convient de minimiser le contact avec le tissu cortical sous-jacent.Alors que les lamelles crâniennes sont retirées du cerveau afin d'améliorer la stabilité du tissu. Pendant la sectionnement au vibrotrancheur, les régions latérales et caudales du cerveau sont éliminées à l'aide d'une lame de rasoir. Les deux hémisphères sont soigneusement prélevés du crâne et placés, avec la surface médiale vers le bas, dans un moule d'inclusion.Ils sont immédiatement recouverts d'un gel d'AGA roses à 3 % de qualité ADN fondu, dissous dans un tampon de préparation tissulaire maintenu à 37 degrés Celsius. Après deux minutes de stabilisation sur une surface horizontale plane. Pour garantir un durcissement uniforme des AGA roses, les moules sont placés sur de la glace afin de terminer la prise.Une fois que le gel contenant les hémisphères est solidifié, il est retiré du moule et taillé autour du tissu cérébral. Le tissu inclus dans le gel est ensuite monté sur le plateau d'échantillonnage du vibrotome avec la surface médiale vers le haut et fixé à l'aide d'un adhésif cyanoacrylate. Le plateau est ensuite installé dans le bac d'échantillonnage du vibrotome rempli de milieu de préparation tissulaire glacé, et le cerveau est sectionné à une épaisseur de 150 micromètres.Une fois que les tranches contenant la SRM sont libérées de la lame, elles sont délicatement prélevées à l’aide d’une petite spatule plate et placées à plat au centre des boîtes de culture. Il est essentiel de manipuler les tranches le moins possible, car le tissu est très fragile. La quantité de milieu dans les boîtes de culture est ajustée de manière à être suffisante pour recouvrir les sections cérébrales tout en empêchant leur déplacement.Les boîtes sont étiquetées et transférées dans une étuve. Les cerveaux de donneur sont préparés de manière similaire à celle des cerveaux de receveur, sauf que les sections sont coupées à une épaisseur de 250 µm et que les tranches sont recueillies sur de la glace.Préparation du tissu froid. Les tranches de tissu sont immédiatement placées sous un microscope stéréo doté d'une capacité de fluorescence en épi-illumination. La SRM est visible comme une structure en forme de U de couleur grise s'étendant de la zone subépendymaire jusqu'au bulbe olfactif.Le SMS est délicatement microdisséqué à l’aide de micro-forceps. Une pince sert à stabiliser la coupe tandis que l’autre permet d’effectuer de petites incisions autour du SMS jusqu’à ce qu’il soit libéré de la coupe. Le SMS excisé est ensuite découpé en petits explants d’environ 200 à 500 micromètres de diamètre.Dans cet exemple, des greffons sont préparés à partir de souris exprimant la protéine fluorescente rouge, TD-tomate. Les boîtes inférieures contenant les tranches d'hôte sont retirées de l'incubateur et placées sous le microscope stéréoscopique en utilisant la lumière visible. Une petite incision est pratiquée dans le segment initial de la SRM, puis, à l’aide d’une pipette équipée d’une pointe de 20 microlitres, un greffon unique de SRM donneur est transféré au site incisé dans la SRM de l’hôte.L'explants est doucement poussé dans l'incision afin d'établir un contact entre les deux tissus. Pour garantir que ce contact soit stable, l'explants est enfoncé légèrement entre la tranche et la membrane pauvre en noyaux. Les boîtes sont ensuite replacées dans l'incubateur pendant au moins une heure, afin de permettre aux sections de s'ancrer sur la membrane.Les neuroblastes devraient commencer à migrer à partir de l'explante vers la RMS hôte après environ une à deux heures. La migration cellulaire est mieux visualisée à l'aide d'objectifs de puissance 20 à distance de travail extra longue. Les tissus cultivés sont transférés de l'incubateur vers une chambre chauffée placée sur le microscope.Les neuroblastes fluorescents peuvent être imagés à des intervalles allant de zéro à 10 minutes, selon le type d'analyse souhaité. Notre protocole de culture organotypique de tranches a été rigoureusement testé et optimisé au cours des dernières années afin d'assurer une régularité dans le schéma et l'orientation de la migration dans la RMS. Dans cet exemple, l'analyse des cellules immigrantes à partir d'explantés, obtenus chez des souris dans lesquelles le TD-tomate est exprimé sous le promoteur nestin, révèle une migration fortement orientée et rapide vers la RMS hôte.Grossissement élevé. Une analyse en lapse de temps montre une excellente résolution sur toute la longueur d’un neuroblaste en migration au cours d’une session d’imagerie de 20 minutes. Une fois l’imagerie terminée, les tranches peuvent être fixées avec de la paraformaldéhyde à 4 %, fraîchement préparé et glacé, puis immunomarquées pour différents composants du flux de migration.Dans ce cas, les astrocytes positifs pour la GFAP en bleu et les vaisseaux sanguins positifs pour le CD31 en vert sont mis en évidence par immunohistochimie fluorescente ; une analyse en forte augmentation de tranches marquées pour les protéines du cytosquelette, l’actine en bleu et la tubuline en vert, révèle une expression non uniforme de ces composants par la cellule, en cours de migration. Notre protocole présente certains défis qui exigent de la patience, de la pratique et un investissement conséquent de temps tant dans la préparation que dans l’analyse des résultats.Voici donc quelques suggestions utiles qui vous aideront à obtenir les meilleurs résultats dans vos expériences. Selon notre expérience, les souris âgées de P1 à P10 donnent les meilleurs résultats. L’appariement par âge entre les cerveaux du donneur et du receveur améliore également la reproductibilité des expériences.Étant donné que la plupart des réactifs et des boîtes de culture doivent être préparés frais, notre essai sur tranches nécessite plusieurs heures de préparation ininterrompue et d'acquisition d'images en une seule journée. Une fois que les cerveaux ont été prélevés, les étapes suivantes doivent être réalisées aussi rapidement que possible. Entre la décapitation et la préparation des tranches, toutes les étapes doivent être effectuées à l’aide de glace et de réactifs froids, et la manipulation des tissus doit être réduite au minimum afin d’éviter toute perturbation anatomique.Les outils utilisés pour ces dissections doivent être stériles et réservés uniquement aux manipulations de tissus vivants. N'utilisez jamais d'outils ayant été en contact avec des fixateurs tels que le formaldéhyde. Les tranches sont généralement viables jusqu'à 36 heures, avec une diminution visible de la migration, de la vitesse et de l'orientation entre 24 et 36 heures.Tenez compte de cette limitation lors de la planification de vos expériences et de votre analyse.

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Source : Wiegreffe, C., et al.,  Imagerie confocale en accéléré de neurones migrateurs dans une culture en coupe organotypique de cerveau embryonnaire de souris à l’aide deIn Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) Cette vidéo montre la microscopie confocale time-lapse pour observer la migration radiale des neurones corticaux à partir de la zone sous-ventriculaire à la plaque corticale via des échafaudages gliaux radiaux dans des tranches de cerveau embryonnaire de souris transduites.

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la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l'étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l'aide de l'imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l'analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo.

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Ce protocole fournit des instructions pour l'observation directe des neurones corticaux migrant radialement. L' électroporation in utero , la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle sont combinés pour étudier directement et dynamiquement les effets de la surexpression ou la régulation négative des gènes d'intérêt dans les neurones migrateurs et d'analyser leur différenciation au cours du développement.

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Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

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Ce protocole démontre une méthode simple et robuste pour étudier la croissance in situ des axones et la dynamique des cônes de croissance. Il décrit comment préparer ex vivo des tranches de cerveau aiguës physiologiquement pertinentes et fournit un pipeline d’analyse convivial.

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Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

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Découvrez un test organotypique optimisé pour l'imagerie time-lapse haute résolution de la migration neuronale dans le cerveau postnatal de souris. Cette méthode permet de visualiser les neuroblastes migrateurs par transplantation croisée de tissus.

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