Technique d'analyse des hétérocaryon cellulaire spécifique de type localisation

L'objectif général de cette procédure est de suivre le déplacement des protéines en exprimant une protéine unique portant deux fluorochromes différents dans deux lignées cellulaires distinctes, puis en fusionnant ces deux lignées cellulaires. Cela est réalisé en transfectant d'abord des plasmides portant le gène d'intérêt fusionné à l'un ou l'autre de deux gènes de protéines fluorescentes dans deux types cellulaires distincts. La deuxième étape de la procédure consiste à mélanger les cellules ensemble et à permettre à chaque type cellulaire d'accumuler la protéine.

La troisième étape de la procédure consiste à inhiber la synthèse des protéines, puis à fusionner les cellules à l'aide de polyéthylène glycol. La dernière étape de la procédure est de visualiser la localisation des protéines par microscopie de fluorescence. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une modification de la localisation ou du comportement de trafic des protéines grâce à la microscopie de fluorescence.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, comme la manière dont les fonctions et les comportements des protéines changent de façon distincte lorsque les cellules subissent une transformation. Bien que cette méthode permette de comprendre les modifications spécifiques aux cellules transformées, elle peut également être appliquée à d'autres études, telles que la différenciation cellulaire, la biologie du développement et la signalisation cellulaire.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car une optimisation des conditions de transfection ainsi que des conditions de fusion sera nécessaire pour chaque type cellulaire différent. La première méthode présentée dans ce protocole pour l'introducton de l'ADN plasmidique dans les cellules est la méthode NU Nuclear Affection, qui utilise la solution effectrice nucléaire lonza pour commencer à laver les cellules récemment passagées et en phase de croissance logarithmique à l'aide de solution saline tamponnée au phosphate PBS, puis à les récolter par ization. Une fois que les cellules ont perdu leur adhérence, neutraliser la trypsine par l'ajout de milieu contenant du sérum et recueillir les cellules par centrifugation à 1500 G pendant cinq minutes, pendant que les cellules sont centrifugées.

Ajouter des lamelles stérilisées dans un plateau à six puits dans l'enceinte de culture tissulaire, puis pipeter 1,5 millilitre de milieu de culture complet dans chaque puits. Refermer et déplacer le plateau dans l'incubateur de culture cellulaire pour équilibrer.

Après la centrifugation, transférez les tubes dans la hotte, aspirez le surnageant et resuspendez les culots cellulaires dans un volume minimal de PBS. Ensuite, comptez les cellules et répartissez le volume de suspension cellulaire dans des tubes microcentrifugeurs stériles. Cela fournira environ cinq fois 10 à la puissance 5 cellules par échantillon ; centrifugez à nouveau à 1500 ×g pendant cinq minutes.

Une fois la centrifugation terminée, placez les tubes dans la hotte de culture cellulaire, aspirez le SNA et resuspendez soigneusement. Suspendez les cellules de chaque tube dans 100 microlitres de solution nucléaire effectrice à température ambiante. Ajoutez ensuite cinq microgrammes d'ADN plasmatique à chaque échantillon et transférez l'échantillon dans un tube Q de solution nucléaire effectrice, puis couvrez.

Veillez à éviter les bulles d'air. Insérez le qve d'échantillon dans le support Q vet. Sélectionnez le programme d'effet nucléaire approprié et lancez-le.

La sélection du programme le plus approprié peut nécessiter des tests préalables afin d'établir une efficacité de transfection optimale avec une mortalité minimale. Ensuite, ensemencez les cellules dans la plaque à six puits, soit en populations mixtes, soit séparément en tant que témoins. Replacez la plaque dans l'incubateur et laissez les cellules se rétablir pendant 12 heures.

La deuxième méthode présentée pour l'expression transitoire de plasmides est la transfection avec un réactif de transfection kagen. Pour commencer, ajoutez 0,8 microgramme de chaque échantillon d'ADN plasmidique à 200 microlitres de tampon EC dans un tube stérile pour centrifugeuse. Ajoutez ensuite 6,4 microlitres de réactif amplificateur à chaque échantillon.

Mélanger brièvement en tapotant le tube et incuber deux minutes à température ambiante. Après cette courte incubation, ajouter 20 microlitres de réactif modificateur à chaque échantillon. Mélanger chaque tube en tapotant et incuber 15 minutes à température ambiante.

Pendant l'incubation, préparez les deux lignées cellulaires qui seront utilisées dans l'expérience. Pour la transfection, les cellules doivent avoir été récemment repiquées et se trouver en phase de croissance logarithmique à une confluence d'environ 80 %. Lavez les cellules une fois avec du PBS et ajoutez 1,5 millilitre de DMEM frais contenant 10 % de FBS.

À présent que les réactifs de transfection de l'ADN ont incubé pendant 15 minutes, ajoutez 1,2 millilitre de milieu DMEM contenant 10 % de FBS à chaque échantillon en mélangeant à l’aide d’une pipette, puis transférez immédiatement environ 700 microlitres des complexes, goutte à goutte, dans chacun des deux puits. Dans la plaque à six puits, mélangez en agitant doucement la plaque. Laissez les cellules transfecter pendant au moins trois heures dans l’incubateur situé dans la hotte de culture cellulaire ; si désiré, placez un lamelle stérilisé par puits dans une plaque à six puits.

Des lamelles recouvertes peuvent être utilisées pour améliorer l'adhérence cellulaire. Ensuite, lavez les cellules transfectées deux fois dans du PBS et récoltez les cellules par une trypsination minimale. Cette étape est réalisée en ajoutant 100 microlitres de solution de trypsine à chaque puits en agitant la plaque pour assurer une couverture complète.

Ensuite, aspirez immédiatement la trypsine résiduelle. Neutralisez la trypsine restante en resuspendant les cellules dans 1,5 millilitre de DMEM frais contenant 10 % de FBS, puis semez les cellules soit en populations mixtes, soit séparément en tant que témoins. Dans la plaque à six puits contenant des lamelles, laissez les cellules se rétablir pendant 12 heures dans l'incubateur de culture cellulaire.

Quelle que soit la méthode de transfection, la procédure de génération des infusions hétéroporteuses est identique. Après la transfection, retirez le milieu de culture des puits et lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, il est recommandé de traiter les cellules avec de la cycloheximide afin d'inhiber la synthèse protéique ultérieure.

Ajouter du cyclo heide à une concentration de 100 microgrammes par millilitre dans le milieu de culture pour recouvrir les cellules, puis incuber pendant deux heures dans l’incubateur de culture cellulaire. Après deux heures, retirer les cellules de l’incubateur et laver les cellules deux fois avec du PBS. Pour initier la fusion, recouvrir les cellules avec une solution contenant 50 % de polyéthylène glycol 1000 dans du DMEM sans sérum et incuber pendant 125 secondes.

À température ambiante, retirez la solution de PEG et lavez les cellules avec du PBS pour éliminer le PEG résiduel. Ajoutez ensuite deux millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Incubez les cellules pendant 18 à 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire.

Après une incubation de 18 à 24 heures, retirez la plaque de l'incubateur et lavez les cellules deux fois dans du PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS dans chaque puits et agitez doucement pendant 15 minutes.

Pendant l'incubation, préparez les lames de microscope à utiliser en ajoutant une goutte unique de milieu de montage contenant dpi. Lavez ensuite les cellules fixées deux fois avec du PBS et retirez soigneusement chaque lamelle à l’aide de petites pinces. Absorbez le PBS résiduel sur un morceau de papier absorbant avant de placer la lame, côté cellules vers le bas, sur une lame de microscope contenant le milieu de montage plus tappi.

Retirer l'excès de milieu de montage de la lame avec du papier absorbant et sceller les bords des lamelles. À l'aide de vernis à ongles, les cellules peuvent désormais être visualisées par microscopie confocale ou en épifluorescence. Dans ce diagramme, la méthode hétéro pour l'analyse de la localisation spécifique aux types cellulaires des protéines est présentée en trois étapes de base.

Transfection du plasmide exprimant une protéine marquée par un fluorophore, fusion cellulaire avec du polyéthylène glycol 1000 et imagerie par microscopie fluorescente, comme on peut le voir sur ces images de fluorescence épiscopique : les fibroblastes primaires de prépuce, utilisés comme témoins de fusion intracellulaire et exprimant la protéine VP3 du virus de l'anémie du poulet marquée par la GFP, présentent principalement une localisation cytoplasmique de la protéine dans la lignée de carcinome pulmonaire non à petites cellules H1299. Les témoins de fusion intracellulaire exprimant la même protéine VP3 marquée par DS.RED montrent une localisation principalement nucléaire. La fusion hétérocellulaire entre les fibroblastes primaires de prépuce et les cellules H1299 entraîne l'introduction de matériel cellulaire transformé dans les fibroblastes primaires et provoque un changement de localisation de la protéine VP3 dérivée de cellules primaires marquée par la GFP vers le noyau.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que le succès dépendra fortement des rendements de transfection dans les types cellulaires utilisés, ainsi que de l'optimisation des conditions de fusion pour ces cellules spécifiques. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le flip et le FRAP peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'analyse en temps réel des dynamiques de localisation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer les localisations protéiques spécifiques à un type cellulaire en introduisant des protéines marquées par un fluorophore et en générant des fusions cellulaires.