Mesures électrophysiologiques à partir d'un système de Moth olfactive

L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer la facilité d'enregistrement des réponses olfactives provenant du système nerveux des insectes. Cela est réalisé en immobilisant un papillon vivant et en connectant des électrodes à l'antenne ou à un neurone individuel afin d'enregistrer les réponses induites par les odeurs. Dans un premier temps, une électrode en verre remplie de solution saline est introduite dans l'œil pour servir de masse ; dans un deuxième temps, l'un des papillons immobilisés est inséré dans une électrode en verre remplie de solution saline, ce qui permet d'enregistrer les réponses électriques sous forme de gramme antennaire, ou d'enregistrer des réponses unitaires simples à partir d'un neurone récepteur olfactif.

L'électrode d'enregistrement est introduite à la base d'un ocelle. Ensuite, le signal antennaire est amplifié et transmis à un convertisseur analogique-numérique afin d'enregistrer et de sauvegarder les signaux. Les résultats obtenus montrent des réponses induites par l'odeur et dépendantes de la dose, basées sur le signal électrique enregistré sous forme de signal EAG ou d'impulsion.

Nous avons mis au point une nouvelle méthode d'enregistrement de l'entérogramme à partir du papillon vivant immobilisé de l'orange navelle. Le principal avantage de cette technique est que la préparation dure longtemps, et que le même papillon peut être utilisé plusieurs fois pour enregistrer plusieurs réponses, ainsi que pour enregistrer des réponses unitaires provenant d'un capteur individuel de l'antenne. Nous nous concentrons sur l'orange navelle car elle constitue une culture agricole importante en Californie.

Cependant, cette méthode peut être utilisée pour d'autres insectes épidoptères, non seulement pour répondre à des questions fondamentales sur la fonction olfactive, mais aussi pour le développement de nouveaux attractants. Cette étude du système olfactif des papillons utilise le ver de l'orange navale. Ullo Ella.

La colonie d'insectes est maintenue avec une alimentation à base de son de blé, dans des chambres environnementales à environ 28 degrés Celsius, à une humidité relative d'environ 75 %, et sous un régime photopériodique de 16 heures de lumière pour 8 heures d'obscurité. Préparez des récipients pour les mites récemment écloses en plaçant jusqu'à 10 couches de serviettes en papier imbibées d'eau dans une boîte en plastique. Récoltez quotidiennement les mites émergentes et déterminez leur sexe, puis transférez-les dans la boîte en plastique. Recouvrez la boîte d'un couvercle perforé afin de permettre la circulation de l'air, en prévision des enregistrements électrophysiologiques.

Tout d'abord, fabriquez un support pour le papillon en coupant la pointe d'un micropipette de 200 microlitres de manière à obtenir un diamètre d'extrémité d'environ deux millimètres. Pour l'EAG ou le SSR, sélectionnez un papillon âgé de deux à quatre jours après l'émergence. Insérez le papillon dans la micropipette par l'extrémité opposée à la pointe à l'aide d'un morceau de papier absorbant humidifié, puis poussez délicatement le papillon vers l'extrémité de la micropipette.

Continuez à pousser le papillon jusqu'à ce que les antennes et une partie de la tête émergent de l'extrémité ; immobilisez la tête exposée en recouvrant celle-ci avec de l'argile non sèche, en laissant une petite partie d’un œil et les deux antennes exposées. Placez la préparation du papillon sur la plateforme du micromanipulateur d'électrogramme entre les deux supports d'électrodes en utilisant des électrodes en verre dont le diamètre de l'extrémité est inférieur à un micron. Remplissez les électrodes par arrière avec du ringer limbique centum.

En observant au microscope, piquez la partie exposée de l’œil avec une électrode. Celle-ci sert d’électrode de référence. La prochaine étape consiste à placer des électrodes d’enregistrement sur les antennes.

L'antenne du papillon mâle de la teigne orangée des navets est multiségmentée, et chaque segment est orné d'un grand nombre de structures en forme de poils. L'illa, l'encart, est une micrographie électronique à balayage montrant les détails de l'illa afin de faciliter l'enregistrement à partir des antennes. Coupez un à deux segments terminaux distaux.

Ensuite, insérez les deux antennes dans l'électrode d'enregistrement. En alternative, pour les enregistrements unitaires, insérez l'électrode d'enregistrement à la base d'un sens. Les potentiels d'action provenant du sens sont amplifiés par un préamplificateur à haute impédance et transférés vers un convertisseur analogique-numérique intelligent USB afin d'être analysés hors ligne à l'aide du logiciel autos spike.

L'étape suivante consiste à préparer le stimulus chimique en utilisant ZZ 1113 HEXA deca Now, qui est un constituant majeur du mélange de phéromones femelles du ver du bigaradier, diluer le composé chimique avec de l'hexane afin d'obtenir des dilutions DIC. Déposer 10 microlitres d'une solution de stimulus sur un papier filtre Watman. Faire évaporer le solvant en agitant doucement pendant 10 secondes.

Sous une hotte, placer la bande dans une seringue en polypropylène de cinq millilitres, de l’hexane seul, et une seringue vide servant de témoins pour la préparation. L’EAG ou le SSR est maintenu dans un courant d’air humidifié délivré par le contrôleur de stimulus syntax à 20 millilitres par seconde. Attacher la seringue contenant le stimulus chimique au contrôleur de courant d’air.

Enregistrez deux secondes de signaux électriques de base. Ensuite, ajoutez une impulsion de stimulus de quatre millilitres par seconde au flux d'air pendant 500 millisecondes. Poursuivez l'enregistrement des signaux électriques pendant huit secondes supplémentaires.

Laisser au moins une minute entre chaque stimulation. Cette figure montre une réponse robuste dépendante de la dose provenant des antennes d’un mâle de papillon immobilisé. Stimulé avec le composant de phéromone femelle, CZ 1113 hexaco.

Réponse à l'hexane. Le témoin véhicule est indiqué par la ligne bleue successivement. Des doses plus élevées du phéromone produisent des enregistrements électrographiques successivement plus importants.

Cette figure montre les enregistrements extracellulaires d'une unité unique provenant d'un tric andum en réponse à une stimulation par un composant de la phéromone femelle. Ces enregistrements révèlent une réponse excitatrice dépendante de la dose. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures si elle est effectuée correctement.

Lors de l'utilisation de cette méthode, veillez à éviter toute contamination et à utiliser des produits chimiques aussi purs que possible.