Name: Mesure Caenorhabditis elegans à 96 plaques de microtitration bien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Apprenez à mesurer la durée de vie de Caenorhabditis elegans en plaques de microtitration 96 puits. Cette méthode permet le criblage à haut débit de molécules prolongeant la longévité chez ce modèle.

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Ce protocole a été développé initialement au Fred Hutchinson Cancer Research Center à Seattle par Xiaolan Ye et Michael Petrascheck dans le laboratoire de Linda Buck. La version détaillée ci-dessus a été préparée pour faire toute la procédure à la disposition du plus large communauté. Nous remercions Carol Taylor, Sarah LeBoeuf et Andy Tomacelli pour la lecture critique du protocole. C&#39;est manuscrit # 2866 de The Scripps Research Institute. Le laboratoire est financé par Petrascheck le programme Novartis DJA.

Aperçu: Le protocole est divisé en quatre parties. La Partie 1 décrit la façon de préparer les bactéries alimentaires. Partie 2 décrit comment préparer la culture ver. Partie 3 décrit comment marquer la durée de vie. Partie 4 montre quelques résultats représentatifs, et la partie 5 explique comment préparer les solutions nécessaires. Expériences Lifespan prendre plusieurs semaines à compléter. Pour chaque étape de la semaine du protocole, le jour et l'heure du jour est inclus pour faciliter la planification. Le stade L4 (jour 0) est utilisé comme point de référence pour l'ensemble du protocole. 1. Préparation de bactéries d'alimentation Cette section décrit la préparation de la bactérie se nourrir. L'spécifiques E. coli souche utilisée pour nourrir C.elegans est appelé OP50. Avant de ce protocole, afin de prévenir la contamination croisée de la culture vers d'autres bactéries, la souche OP50 a été faite carbénicilline / résistantes à l'ampicilline 21. Préparer les quatre à cinq jours à l'avance OP50. Tous les matériaux entrant en contact avec OP50 doit être stérile. Jour -7: Le jeudi (semaine 1): Inoculer 5 ml de TB contenant 100 ug / ml d'ampicilline et 0,1 pg / ml d'amphotéricine B avec une seule colonie, OP50 et incuber pendant la nuit à 37 ° C dans un agitateur bactérienne. Jour -6: Le vendredi (semaine 1). Matin 8h30. Inoculer tôt pour laisser suffisamment de temps pour la culture pour atteindre la saturation <ol><li> Diluer la culture de nuit de OP50 1:2000 dans 300 ml de tuberculose contenant 50 pg / ml d'ampicilline. Incuber la culture bactérienne dans un shaker pour 8-12 heures à 37 ° C jusqu'à saturation est atteint. Ne pas laisser la culture à croître de plus de 14 heures. </li><li> Transférer la OP50 dans une stérile, tube de centrifugation de pré-pondérées. Pellet l'OP50 par centrifugation pendant 10 min à 3500 rpm (2200 xg) dans une centrifugeuse de table. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot OP50 dans l'eau stérile et re-par centrifugation. Répéter ce lavage deux fois. </li><li> Après le second lavage, retirez soigneusement toute l'eau restante. Pas d'eau doit être laissé dans le tube. Peser le tube de centrifugation contenant le culot et soustraire le poids du tube de centrifugation vide afin de déterminer le poids de la pastille. </li><li> Bien re-suspendre le culot dans S-complet à une concentration de 100 mg / mL. Pas de touffes doivent être à gauche. </li><li> La concentration de 100 mg / mL OP50 doit correspondre à 2 x10 10 bactéries / ml. Utilisez un spectromètre photo pour déterminer le nombre de bactéries par ml, si la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries par ml est connue. Si nécessaire, ajuster la concentration de la solution d'alimentation OP50 à 2 x10 10 bactéries / ml. </li><li> Stocker le OP50solution à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour la culture ver. </li></ol> 2. Préparation d'une culture Worm Synchrone Cette section décrit la préparation de la culture ver. Son objectif est de générer une population en âge-synchrone de vers. Tous les matériaux entrant en contact avec C.elegans après le traitement de blanchiment dans l'étape 5 doivent être stériles. Les plaques sont maintenues à 20 ° C, sauf indication contraire. Jour -6: Le vendredi (semaine 1), 16h00: Transfert des animaux à une plaque fraîche <ol><li> Prenez une plaque 5-10 jours NGM ancienne sur laquelle la majorité de la population de vers se compose de larves L1 affamés. </li><li> Stériliser une spatule en métal par le chauffant peu plus d'un bec Bunsen. Laissez-le refroidir. Utilisez la spatule refroidi pour découper des morceaux de la plaque de gélose contenant des vers affamés. Transfert de plusieurs de ces morceaux sur une nouvelle tête de série 10 cm avec plaque de NGM OP50. Incuber pendant env. 65 heures à 20 ° C jusqu'à ce que la majorité de la population de vers se compose d'adultes gravides. Le temps qu'il faut pour les animaux affamés L1 pour devenir des adultes gravides peuvent varier d'une souche à l'. </li></ol> -3 Jour: lundi (semaine 2) 10h00: Établir une population synchrones <ol start="3"><li> Recueillir les vers de la plaque de 10 cm en les lavant la plaque avec 5-10 mL d'eau stérile. Transférer la solution ver / eau dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Lavez les vers par centrifugation 2 min dans une centrifugeuse de paillasse à 1200 rpm (280 xg). Rejeter le surnageant et ajouter 10 ml d'eau. Répéter. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter 5 ml d'eau de Javel fraîchement préparés / solution de NaOH (2,5 ml de javel, 1 ml de NaOH 10N, 6,5 mL de H 2 O). Incuber pendant 5 minutes à température ambiante jusqu'à ce que le ver casser. Soyez sûr de vortex en douceur à chaque minute. Surveiller l'avancement de la réaction sous la loupe binoculaire. </li><li> Dès que tous les adultes se dissoudre, ajouter 5 ml de tampon M9 pour neutraliser la réaction. </li><li> Laver les œufs à trois reprises avec 10 ml de tampon M9 par centrifugation 2 min à 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Lavez les oeufs une fois avec 10 ml de S-complet par centrifugation 2 min à 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Retirer le surnageant, ajouter 10 ml de S-complet et transférer la solution dans un nouveau tube conique de 50 mL. Ajouter 30 ml de S-complet d'un volume final de 40 ml. Agitez doucement le tube à température ambiante durant la nuit sur un nutator ou un appareil similaire. </li></ol> Jour -2: mardi (semaine 2), 12h00: semences des animaux en plaques <ol start="10"><li> Sous le microscope à dissection, vérifiez si les vers éclos durant la nuit. Déterminer la concentration de vers dans la solution S-complet en comptant le nombre de vers dans 10 gouttes uL utilisant un microscope à dissection. Comptez au moins 10 gouttes pour chaque échantillon. </li><li> Re-suspendre les vers à une concentration de 80-100 vers / ml à S-complet. Ajouter carbénicilline (stock de 100 mg / mL) à une concentration finale de 50 pg / mL et l'amphotéricine B (stock 250 pg / mL) à une concentration finale de 0,1 pg / mL. Agiter sur un nutator. Si la préparation de grandes quantités de vers, utiliser un flacon de 600 ml avec bouchon Nunclon filtre. </li><li> A 14h30 ajouter le OP50 préparés dans la partie 1 à une concentration finale de 6 mg / ml (= 1,2 x 10 9 bactéries / ml). Retourner le OP50 à 4 ° C. </li><li> Transfert 120 ul de la solution worm/OP50 dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Utiliser des plaques 96 puits avec un fond transparent. Veillez à garder les vers en suspension pendant le pipetage. </li><li> Sceller la plaque en utilisant un scellant bande pour éviter la contamination et l'évaporation. Agiter la plaque sur un agitateur de plaques de microtitration pendant 2 min et laisser incuber pendant 2 jours à 20 ° C jusqu'à ce que les animaux atteignent le stade L4. </li></ol> Jour 0: jeudi (semaine 2) avant midi: Stériliser les animaux en ajoutant fluorodésoxyuridine (FUDR) <ol start="15"><li> Pour stériliser les animaux ajouter 30 ul d'une solution 0,6 mM FUDR stock à chaque puits. Cette étape amène le volume final dans chaque puits à 150 ul et réduit la concentration finale de OP50 partir 6mg / ml à 5 mg / ml (1x10 9 bactéries / ml). Sceller la plaque à l'aide de bandes scellants et secouez pendant 2-3 min sur un agitateur de plaques de microtitration. Si l'OP50 a été ajouté à 2:30 le jour -2, il est important que les FUDR est ajouté avant midi. Retour des plaques dans l'incubateur à 20 ° C </li></ol> Jour 1: Vendredi (semaine 2): Ajouter des drogues à la culture <ol start="16"><li> En 9h00 la plupart des animaux doivent être gravides et contiennent plusieurs ovules chacune. Ajouter les médicaments dont l'effet sur la durée de vie est d'être testé à la concentration voulue. Si la dissolution de la drogue dans le DMSO, les concentrations finale de DMSO ne devrait pas excéder 0,6%, car les concentrations de DMSO supérieur à 0,6% de raccourcir la durée de vie C.elegans. Après addition de la drogue, sceller les plaques avec un scellant la bande et le secouer pendant 2-3 min sur un agitateur de plaques de microtitration. Retour des plaques dans l'incubateur à 20 ° C </li><li> Ajout de la drogue peut parfois tuer quelques animaux par assiette, surtout si vous utilisez un autre solvant que l'eau. Utiliser un microscope inversé pour vérifier les animaux morts. Généralement, il devrait y avoir moins de 10 animaux morts par plaque de 96 puits. Retour des plaques dans l'incubateur à 20 ° C. </li></ol> Jour 4: lundi (semaine 3): Changement scellants <ol start="18"><li> Pour permettre à l'oxygène frais pour entrer dans la culture enlever le scellant, attendre 1 minute et sceller la plaque. Agiter la plaque pendant 2-3 minutes sur un agitateur de plaques de microtitration. Répéter une fois par semaine. </li></ol> Jour 5: Mardi (semaine 3): Ajouter de nouvelles OP50 pour éviter la famine <ol start="19"><li> Ajouter 5 uL de la 100 mg / ml solution OP50 qui a été préparé dans la partie 1 à chacun des 96 puits pour éviter la famine. </li></ol> 3. Notation de durée de vie. Cette section décrit comment la survie de la population de vers synchronisée de la partie 2 est surveillé jusqu'à ce que les animaux morts. Pour observer les animaux dans les plaques de 96 puits, l'utilisation d'un microscope inversé avec un objectif 2x ou 2.5x. Les données de survie record trois fois par semaine; lundi, mercredi et vendredi. Utilisez le mouvement afin de déterminer si les animaux sont vivants ou morts. Une forte lumière, la lumière bleue en particulier, induit les animaux à se déplacer. Ne pas retirer les animaux morts à partir du dosage. Parfois, les animaux qui ne bougeait pas et étaient déterminés morts au comptage précédent pourrait passer par la suite. <ol><li> Au jour 0, au début de l'expérience de compter le nombre total de vers dans chaque puits. Censeur des puits qui contiennent plus de 18 animaux de l'analyse comme des animaux dans ces puits ne sera pas assez OP50 et montrer les effets de la restriction alimentaire. </li><li> Afin d'augmenter les chances que les animaux se déplacent secouer la plaque à 96 puits sur un agitateur de plaques de microtitration pendant 2 min. avant le comptage. </li><li> Dans chaque session, d'enregistrer la date et le comptage du nombre d'animaux quidéplacer comme les animaux vivants. Mouvement dans le liquide est beaucoup plus facile que sur un support solide et peut être induite par les lumières fortes. L'utilisation d'un plus fort grossissement peut aider à repérer des mouvements très subtils comme ceux de la pointe du pharynx. Ces mouvements subtils sont souvent le seul mouvement observé chez les animaux très anciens. </li><li> Retour des plaques dans l'incubateur à 20 ° C </li><li> Répétez l'étape 2-4 tous les deux à trois jours jusqu'à ce que tous les animaux sont morts. </li></ol> 4. Des résultats représentatifs. Cette section montre un exemple de la façon de tenir des registres de la durée de vie des données générées par cet essai et quelques résultats représentatifs. La figure 1A montre un exemple de la façon d'enregistrer des données pendant la durée de vie dans ce test. Une feuille Excel est utilisé pour garder la trace de la survie des populations dans chaque puits. Pour chaque bien c'est de coordonner dans la plaque, la souche, la drogue, la concentration de la drogue et le nombre total d'animaux vivants au jour 0 (X0) est enregistré au début de l'expérience. Noter la date, ainsi que le nombre d'animaux morts vivants et trois fois par semaine afin de suivre la survie des populations différentes dans chaque puits. Pour représenter graphiquement les résultats, calculer la fraction des animaux vivants pour chaque jour et il intrigue comme une fonction du temps en jours. P-valeurs doivent être calculées en utilisant les logiciels statistiques, comme STATA ou logiciels similaires. La durée de vie moyenne C.elegans dépend de la température. Figure 1B montre que les changements de température dépend de la durée de vie sont fidèlement reproduites par le dosage de la durée de vie basée microtitration 22. De même, le dosage de plaque de microtitrage reproduit des changements dans la durée de vie des mutants auraient une espérance de vie qui diffèrent de type N2 animaux sauvages 23-24 25 (figure 1C). Le test peut également être utilisé pour faire des déclarations plus quantitative. Dans signifie Fig1D durée de vie est tracée en fonction de la concentration mirtazépine 7. Chaque point de données représente la durée de vie moyenne de 7-12 population, chaque séjour dans un autre bien. Même si le nombre d'animaux par puits est relativement faible (5-15 animaux), la variation du bien-au-puits est relativement faible comme on peut le voir les barres d'erreur. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. La microplaque basée durée d'essai reproduit fidèlement les changements dans la durée de vie rapportés dans la littérature. (A) Exemple de données recueillies dans une feuille de calcul Excel. Lors de chaque date de la séance de comptage, de coordonner du puits et le nombre d'animaux vivants et des morts a été enregistré. Au début de l'expérience, le nombre total d'animaux dans chaque puits a été déterminée. (B) la courbe de survie de type sauvage (N2) animaux élevés à 20 ° C et 25 ° C. Les courbes de survie (C) des souches porteuses de mutations qui affectent la durée de vie. Tous les quatre souches ont été dosés en parallèle à 20 ° C. (D) de la courbe dose-réponse mirtazépine animaux traités N2. Durée de vie moyenne est tracée en fonction de la concentration mirtazépine. Les barres d'erreur indiquent la SEM de 8 puits par condition. 5. Matériaux. M9 tampon, 1000 ml <ul><li> 6 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g de KH 2 PO 4 </li><li> 5 g de NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Ajouter de l'eau déminéralisée à 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Tampon pH 6,0 Potassiumphosphate, 1000 ml <ul><li> 136 g de KH 2 PO 4 </li><li> Ajouter de l'eau déminéralisée à 900 ml </li><li> Ajuster le pH à 6,0 avec KOH 5M </li><li> Ajouter de l'eau déminéralisée à 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Solution métallique Trace <ul><li> 1,86 g de Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g de ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g de CuSO 4 </li><li> 1000 ml d'eau déminéralisée </li><li> Autoclave et conserver dans l'obscurité. </li></ul> S-basale moyenne, 1000 ml <ul><li> 5,9 g de NaCl </li><li> 50 ml de phosphate de potassium 1M, pH 6,0 </li><li> 1000 ml d'eau déminéralisée </li><li> Autoclave </li><li> Laisser la solution refroidir et ajouter 1 ml de cholestérol 5mg / ml (dissous dans Et-OH). </li></ul> Le citrate de potassium 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g de citrate tripotassique </li><li> 26,3 acide citrique monohydraté </li><li> Ajouter 900 ml d'eau déminéralisée </li><li> Ajuster le pH à 6,0 avec KOH 5M </li><li> Ajouter de l'eau déminéralisée à 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> S-milieu complet, 1000 ml <ul><li> 977 ml de S-basale </li><li> 10 ml de citrate de potassium 1M pH 6 (stérile) </li><li> 10 ml Trace métaux solution (stérile) </li><li> 3 ml de CaCl 2 1M (stérile) </li><li> 3 ml 1M MgSO 4 (stérile) </li></ul> Agar NGM <ul><li> 3.0g de NaCl </li><li> 2.5g Pepton(À partir de caséine, du pancréas digèrent) </li><li> Agar 17g </li><li> Ajouter de l'eau déminéralisée à 975 mL et une barre d'agitation </li><li> Autoclave </li><li> Après autoclavage refroidir à 55 ° C et ajouter les éléments suivants: <ul><li> 0,5 ml de CaCl 2 1M (stérile) </li><li> 1 ml de cholestérol 5mg / ml dans l'éthanol </li><li> 1 ml de 1M MgSO 4 (stérile) </li><li> 25 ml de tampon Potassiumphosphate, pH 6,0 (stérile) </li></ul></li></ul> La tuberculose, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Tryptone </li><li> 24 g Extrait de levure </li><li> 4 ml de glycérol </li><li> Ajouter 900 ml d'eau déminéralisée </li><li> Autoclave </li><li> Après autoclavage refroidir à 55 ° C et ajouter les composants suivants: <ul><li> Ajouter 100 ml de 0,17 M de KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM fluorodésoxyuridine (FUDR, sigma # cat F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Dissoudre dans 670 ml stériles S-complet, faire 10 ml ou 45 ml aliquotes. </li><li> Conserver à -20 ° C. </li></ul> 100 mg / ml de carbénicilline, 10 ml <ul><li> 1 g carbénicilline </li><li> 10 ml d'eau stérile déionisée </li><li> Filtrat stérile et aliquot </li><li> Conserver à -20 ° C. </li><li> Utiliser à une concentration finale de 50 pg / mL </li></ul> 250ug / ml d'amphotéricine B, 4 ml <ul><li> 1mg amphotéricine B </li><li> 4 ml et-OH </li><li> Conserver à -20 ° C </li><li> Utiliser à une concentration finale de 0,1 pg / ml </li></ul>

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</ol>

Le protocole présenté permet la mesure de la durée de vie dans C.elegans 96 plaques de microtitration bien. Comme le montre le représentant de la section des résultats il réplique de manière fiable les résultats précédents et fournit des informations quantitatives. L&#39;utilisation de ce test, nous avons examiné plus de 89000 avec succès des molécules pour leur effet sur ​​la durée de vie C.elegans. Aux fins de dépistage de drogue, la mesure de la durée de vie dans un format 96 plaques de microtitration ainsi a plusieurs avantages sur le dosage classique des milieux solides. Elle réduit le travail nécessaire pour les médias de préparation, la quantité d&#39;espace d&#39;incubation, et la quantité de médicament nécessaire. Le format de 96 puits et l&#39;installation de microscopie permettant l&#39;automatisation du test de l&#39;ensemble des projections à haut débit. Pendant le développement de l&#39;analyse de plusieurs valeurs pour chaque variable et leurs combinaisons ont été testées pour leurs effets sur la durée de vie C.elegans. Ces tests incluaient différentes concentrations OP50 allant de 3 à 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), le nombre de vers par puits allant de 7 à 45 (7, 10, 15, 22, 45 ver / puits), les volumes de culture différente allant de 40 à 150 ul par puits (40, 60, 80, 100, 120, 150 pi), et des changements dans la composition du tampon. S&#39;ils sont nourris avec un OP50 résistantes à la carbénicilline, ni carbénicilline, ni l&#39;amphotéricine B dans les concentrations indiquées ont été trouvés à affecter C.elegans durée de vie. Continue agitation douce des plaques, comme c&#39;est souvent recommandé dans C.elegans culture liquide, a été retrouvé dispensable pour les petits volumes utilisés dans ce dosage. Agitation douce est cependant nécessaire si les plaques de microtitration avec plus de puits doivent être utilisés. Les valeurs indiquées dans ce protocole ont été soigneusement choisis en fonction de la comparaison statistique des différentes conditions testées. La caractéristique la plus surprenante de ce dosage est probablement le fait que C. elegans peut être conservé dans des plaques 96 puits qui sont scellées avec du ruban adhésif. Side-by-side comparaisons n&#39;a révélé aucune différence dans la durée de vie des animaux d&#39;élevage dans les plaques non scellées, dans des assiettes scellé avec un scellant en plastique, ou en plaques scellées avec les chasseurs qui permettent l&#39;échange d&#39;air. Dans les trois conditions, les animaux ont développé très homogène de L1 à des adultes gravides dans les 65 heures et a montré une durée de vie très comparable. Animaux cultivées en parallèle sur NGM développée un peu plus vite, mais cette différence était indépendante de l&#39;absence ou la présence d&#39;un scellant. Le protocole présenté est basé sur des bactéries vivantes, mais peut être adapté pour les bactéries mortes. Toutefois, dans un dosage de liquide, une seule bactérie survivant peut se multiplier rapidement et de repeupler la culture. Dans nos mains, le seul moyen fiable pour tuer les bactéries dans la mesure où ils peuvent être utilisés pour la culture liquide est par un traitement prolongé de la bactérie à l&#39;irradiation gamma. Un point important à considérer dans la planification d&#39;une expérience de vie est la puissance de détection. Dépendant de la taille de l&#39;effet, l&#39;effet de la drogue d&#39;intérêt doivent être testés dans plusieurs puits. Dans un essai typique 4 traités par le médicament et 4 puits de contrôle, correspondant approximativement à 40-50 animaux chacun, devrait suffire pour détecter une augmentation de 30% la durée de vie dans plus de 95% des expériences. Augmente de 14% ne sont détectés dans 60% des cas et nécessitent donc plus de puits répliquer. La richesse des données générées par la durée de vie ce test peut être utilisé pour développer des expériences ou des modèles de Gompertz souche spécifique paramétrique 1. Ces modèles de Gompertz sont utiles pour déterminer la puissance de détection et d&#39;estimer le nombre de faux positifs et négatifs pour les grands écrans. Nous avons vérifié les prédictions de ces modèles dans des expériences aveugles et les ont utilisés pour estimer le nombre de faux négatifs dans les écrans de grande taille (résultats non publiés). En résumé, nous prévoyons que le test sera présenté d&#39;une grande utilité pour identifier des petites molécules qui prolongent la durée de vie de C.elegans et d&#39;étudier les mécanismes sous-jacents.

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Aussi appelée Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>Le FUDR est inactivé par la chaleur, décongeler dans de l'eau froide</td></tr><tr><td>Miansérine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Utiliser comme témoin positif à une concentration finale de 50&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Cyprohéptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Témoin positif alternatif à une concentration finale de 10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Bandes scellantes</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Polyester, non stérile</td></tr><tr><td>Plaque 96 puits</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Non traitée, transparente, emballée individuellement, en polystyrène, stérile</td></tr><tr><td>Flacon Nunclon</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>Utilisé pour les grands volumes</td></tr></tbody></table>

mesure caenorhabditis elegans</emdurée de vie> à 96 plaques de microtitration bien

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Durée de vie est un processus biologique réglementé par plusieurs voies génétiques. Une stratégie pour étudier la biologie du vieillissement est d&#39;étudier les animaux que les mutations portuaires dans les composants de l&#39;âge réglementaire voies. Si ces mutations perturbent la fonction de la voie de l&#39;âge réglementaire et donc modifier la durée de vie de l&#39;organisme entier, ils fournissent des indications importantes mécanistes 1-3. Une autre stratégie pour étudier la régulation de la durée de vie est d&#39;utiliser de petites molécules pour perturber l&#39;âge réglementaire voies. À ce jour, un certain nombre de molécules sont connues pour prolonger la durée de vie dans des organismes modèles différents et sont utilisés comme outils pour étudier la biologie du vieillissement 4-16. Le nombre de molécules identifiées à ce jour est petite par rapport à la génétique &quot;outils&quot; qui est disponible pour étudier la biologie du vieillissement. Caenorhabditis elegans est un des modèles principe utilisé pour étudier le vieillissement en raison de son excellente et la génétique courte durée de vie de trois semaines. Plus récemment, C. elegans est apparu comme un organisme modèle pour les écrans de phénotype médicament à base 5,7,16-20 raison de sa petite taille et sa capacité à croître dans les plaques de microtitration. Nous présentons ici une analyse pour mesurer la durée de vie C.elegans en plaques de 96 puits de microtitration. Le test a été développé et utilisé avec succès à l&#39;écran les grandes bibliothèques de molécules qui prolongent la durée de vie C.elegans 7. La fiabilité du test a été évalué dans les tests multiples: d&#39;abord, en mesurant la durée de vie des animaux de type sauvage cultivé à différentes températures, en deuxième lieu, en mesurant la durée de vie des mutants avec la durée de vie altérée, le troisième, en mesurant les changements dans la durée de vie en réponse à différentes concentrations de l&#39;mirtazépine antidépresseur. Mirtazépine a déjà été démontré à prolonger la durée de vie de C.elegans 7. Les résultats de ces tests montrent que le dosage est capable de répliquer les résultats précédents des dosages d&#39;autres et est quantitative. Le format de microtitration rend également ce dosage durée de vie compatible avec les systèmes automatisés de manipulation des liquides et permet l&#39;intégration dans les plates-formes automatisées.

Dans ce protocole, nous présentons une méthode pour mesurer<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Durée de vie de 96 plaques de microtitration bien.

Mesure Caenorhabditis elegans</emDurée de vie> à 96 plaques de microtitration bien

La durée de vie est un processus biologique régulé par plusieurs voies génétiques. L'une des stratégies pour étudier la biologie du vieillissement consiste à analyser des animaux porteurs de...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la durée de vie de vers nématodes marins traités avec des composés d'intérêt. Cela est réalisé en préparant d'abord l'OP 50, une souche bactérienne utilisée pour nourrir les vers. Une population de vers synchronisée par âge est ensuite générée et ensemencée dans des plaques de 96 puits, en présence de la bactérie nourricière OP 50.Au cours des deux jours suivants, les vers atteignent le stade larvaire L4 et le médicament FUDR est ajouté pour empêcher la reproduction. Le jour suivant, les vers atteignent l'âge adulte et les médicaments d'intérêt sont ajoutés dans les puits individuels. À partir de ce moment, le nombre de vers vivants et morts est déterminé tous les deux à trois jours jusqu'à ce que tous les vers soient morts.L'observation est effectuée à l'aide d'un microscope inversé et le nombre de vers morts et vivants est enregistré à chaque session. Bonjour, je suis Greg Solis. Je travaille au laboratoire Petro au sein du département de Physiologie Chimique de l'Institut de Recherche Scripps.Aujourd'hui, je vais vous montrer comment synchroniser des vers et les répartir dans des plaques microtitration à 96 puits. Le principal avantage de cette technique par rapport à vos méthodes existantes est qu'elle permet l'identification rapide de molécules allongeant la durée de vie et C. elegans. Commençons donc.Pour préparer les bactéries servant de nourriture pour C. elegans, commencez au jour moins sept en inoculant cinq millilitres de TB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline et 0,1 microgramme par millilitre de tétracycline avec une colonie unique d'OP50. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un agitateur bactérien. Tôt le lendemain matin, diluez la culture de la nuit d'OP50 au 1/200 dans 300 millilitres de TB contenant 50 microgrammes par millilitre d'ampicilline. Incubez la culture dans un agitateur bactérien pendant huit à douze heures à 37 degrés Celsius, jusqu'à atteinte de la saturation. N'autorisez pas la culture à croître plus de 14 heures.Transférez l'OP 50 dans un tube de centrifugation stérile préalablement pesé. Faites tomber en sédiment l'OP 50 par centrifugation pendant 10 minutes à 3 500 tr/min ou 2 200 × g dans une centrifugeuse de table. Jetez le surnageant S, resuspendez le culot d'OP 50 dans de l'eau distillée et refaites tomber en sédiment par centrifugation. Répétez ce lavage deux fois après le deuxième. Lavez soigneusement et éliminez complètement toute l'eau résiduelle. Pesez le tube de centrifugation contenant le culot et soustrayez le poids du tube de centrifugation vide afin de déterminer la masse du culot. Ensuite, resuspendez complètement le culot dans du S Complete à une concentration de 100 milligrammes par millilitre.Aucun grumeau ne doit subsister. La concentration de 100 milligrammes par millilitre d'OP 50 doit correspondre à deux fois 10 à la puissance 10 bactéries par millilitre. Utilisez le spectrophotomètre pour déterminer le nombre de bactéries par millilitre si la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries par millilitre est connue.Si nécessaire, ajuster la concentration de la solution nutritive OP50 à deux fois 10 à la puissance 10 bactéries par millilitre. Enfin, conserver la solution OP50 à quatre degrés Celsius jusqu'à son utilisation pour la culture de vers afin de générer une population de vers âgée de manière synchronisée. Commencer en fin d'après-midi au jour moins six avec une plaque NGM âgée de cinq à dix jours sur laquelle la population de vers se compose principalement de larves L1 en état de privation alimentaire.Stérilisez une spatule métallique en la chauffant brièvement au-dessus d'un bec Bunsen. Laissez-la refroidir. Utilisez ensuite la spatule refroidie pour découper des morceaux d'agar à partir de la boîte contenant les vers affamés.Transférez plusieurs de ces morceaux sur une nouvelle plaque NGM de 10 centimètres ensemencée avec OP50. Incubez les vers pendant environ 65 heures à 20 degrés Celsius, jusqu'à ce qu'une grande partie de la population de vers soit constituée d'adultes matures. Le temps nécessaire pour que les animaux L1 privés de nourriture grandissent jusqu'au stade d'adultes matures peut varier selon les souches.Après l'incubation, récupérez les vers à partir de la plaque de 10 centimètres en les rinçant de la plaque avec cinq à 10 millilitres d'eau stérile. Transférez la solution contenant les vers dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez les vers en les centrifugeant pendant deux minutes dans une centrifugeuse de table à 1 200 tr/min ou 280 × g. Jetez le surnageant et ajoutez 10 millilitres d'eau.Répétez l'étape de lavage, éliminez le surnageant SUP et ajoutez cinq millilitres d'une solution de javel fraîchement préparée. Incubez avec la solution d'hydroxyde de sodium pendant cinq minutes à température ambiante jusqu'à ce que les vers se rompent. Veillez à effectuer un vortex doux chaque minute.Surveiller l'avancement de la réaction au microscope stéréoscopique dès que tous les adultes se sont dissous. Ajouter cinq millilitres de tampon M neuf pour neutraliser la réaction. Laver les œufs trois fois avec 10 millilitres de tampon M neuf par centrifugation pendant deux minutes à 2 500 tr/min ou 1 100 × g. Puis laver les œufs une fois avec 10 millilitres de milieu S complet par centrifugation pendant deux minutes à 2 500 tr/min ou 1 100 × g. Éliminer le surnageant.Ajouter 10 millilitres de milieu S complet et transférer la solution dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ajouter 30 millilitres de milieu S complet pour obtenir un volume final de 40 millilitres. Agiter doucement le tube toute la nuit à température ambiante sur un agitateur ou un dispositif similaire afin d'ensemencer les boîtes pour animaux le lendemain vers midi.Sous un microscope stéréo, vérifiez si les vers ont éclos pendant la nuit. Déterminez la concentration de vers dans la solution S complète en comptant le nombre de vers dans des gouttes de 10 microlitres. À l’aide d’un microscope stéréo, comptez au moins 10 gouttes pour chaque échantillon.Resus.Suspendre les vers à une concentration de 80 à 100 vers par millilitre. Dans le milieu S complet, ajouter de la carbenicilline à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre et de l'amphotéricine B à une concentration finale de 0,1 microgramme par millilitre. Agiter sur un agitateur. Si vous préparez de plus grandes quantités de vers, utilisez un flacon non clon de 600 millilitres avec un bouchon filtrant. À 14 h 30, ajoutez l'OP 50 préparé dans la première partie à une concentration finale de six milligrammes par millilitre. Remettez l'OP 50 à quatre degrés Celsius. Transférez 120 microlitres de la solution de vers en OP 50 dans chaque puits d'une plaque de 96 puits avec fond transparent.Veillez à conserver les vers et la suspension tout en pipetant ; scellez la plaque à l’aide d’un scellant adhésif afin d’éviter toute contamination et évaporation. Agitez la plaque sur un agitateur pour plaque microtitration pendant deux minutes, puis incubez-la pendant deux jours à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que les animaux atteignent le stade L4. Ensuite, pour stériliser les animaux, ajoutez 30 microlitres d’une solution mère de FUDR à 0,6 millimolaire dans chaque puits.Cette étape permet d'ajuster le volume final de chaque puits à 150 microlitres et de réduire la concentration finale d'OP 50 de six milligrammes par millilitre à cinq milligrammes par millilitre. Scellez la plaque à l'aide de films adhésifs et agitez-la pendant deux à trois minutes sur un agitateur pour microplaque. Si l'OP 50 a été ajouté à 2 h 30 le jour moins deux, il est important d'ajouter le FUDR avant midi et de replacer les plaques dans l'incubateur à 20 degrés Celsius au plus tard à 9 h 00 le lendemain.La majorité des animaux doivent être adultes et contenir plusieurs œufs. Ajouter à chacun les médicaments dont l'effet sur la durée de vie doit être testé, à la concentration souhaitée. Si les médicaments sont dissous dans du DMSO, la concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 0,6 %, car des concentrations de DMSO supérieures à 0,6 % raccourcissent la durée de vie d'*elgan* après l'ajout du médicament.Sceller les plaques avec un film adhésif et les agiter pendant deux à trois minutes sur un agitateur pour plaque microtitration. Remettre les plaques dans l'incubateur à 20 degrés Celsius. L'ajout des médicaments peut occasionnellement entraîner la mort de quelques animaux par plaque, particulièrement lorsqu'on utilise un solvant autre que l'eau.Utilisez un microscope inversé pour vérifier la présence d'animaux morts. Généralement, il devrait y avoir moins de 10 animaux morts par plaque de 96 puits. Replacez les plaques dans l'incubateur à 20 degrés Celsius pendant deux jours afin de permettre à l'oxygène frais de pénétrer dans la culture. Retirez le scellant.Attendre une minute et refermer la plaque. Agiter la plaque pendant deux à trois minutes sur un agitateur de plaque microtiter, répéter une fois par semaine le cinquième jour de la période adulte. Ajouter cinq microlitres de la solution OP50 à 100 milligrammes par millilitre préparée précédemment dans chacun des 96 puits afin d'éviter la privation alimentaire. Les vers sont évalués pour leur durée de vie en fonction de leur mouvement trois fois par semaine, dès le début de l'expérience jusqu'à leur mort.Utilisez un microscope inversé muni d'un objectif 2 x ou 2,5 x pour observer les vers dans des plaques à 96 puits au jour zéro, au début de l'expérience. Comptez le nombre total de vers dans chaque puits.Les puits capteurs contenant plus de 18 animaux à partir de l'analyse présenteront un nombre insuffisant de OP 50 et montreront des effets de restriction alimentaire lors de chaque session de comptage. Enregistrez la date et le nombre d'animaux qui se déplacent comme animaux vivants. Le déplacement et le liquide sont bien plus faciles que sur milieu solide et peuvent être induits par une lumière intense.L'utilisation d'un grossissement plus élevé peut aider à observer des mouvements très subtils, comme ceux situés à l'extrémité du pharynx. De tels mouvements subtils sont souvent les seuls observés chez les animaux très âgés. Remettez les boîtes dans l'incubateur à 20 degrés Celsius.Répétez les séances de comptage tous les deux à trois jours jusqu'à ce que tous les animaux soient morts. Voici un exemple d'organisation d'une feuille Excel pour enregistrer les données de durée de vie pour chaque puits. Les coordonnées sur la plaque, la souche, la concentration du médicament, ainsi que le nombre total d'animaux vivants au jour zéro sont enregistrés au début de l'expérience.Enregistrer la date ainsi que le nombre d'animaux vivants et morts trois fois par semaine afin de suivre la survie des différentes populations dans chaque puits. Cette figure présente les résultats de l'élégance marine, des courbes de durée de vie enregistrées à 20 degrés Celsius et à 25 degrés Celsius. Le test de durée de vie basé sur des microplaques reproduit fidèlement les variations de la durée de vie dépendantes de la température.De même, comme illustré ici, le test en plaque microtitration reproduit les variations de durée de vie observées chez des mutants dont la durée de vie diffère de celle des animaux de type sauvage N2. Cette figure montre comment des doses croissantes de mirtazapine affectent la durée de vie moyenne de *C. elegans*. Les données obtenues à l’aide du test en plaque microtitration sont suffisamment quantitatives pour permettre de déterminer des relations dose-réponse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour cribler de grandes bibliothèques chimiques afin d’identifier des molécules allongeant la durée de vie chez *C. elegans*.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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