Mesure Caenorhabditis elegans à 96 plaques de microtitration bien

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la durée de vie de vers nématodes marins traités avec des composés d'intérêt. Cela est réalisé en préparant d'abord l'OP 50, une souche bactérienne utilisée pour nourrir les vers. Une population de vers synchronisée par âge est ensuite générée et ensemencée dans des plaques de 96 puits, en présence de la bactérie nourricière OP 50.

Au cours des deux jours suivants, les vers atteignent le stade larvaire L4 et le médicament FUDR est ajouté pour empêcher la reproduction. Le jour suivant, les vers atteignent l'âge adulte et les médicaments d'intérêt sont ajoutés dans les puits individuels. À partir de ce moment, le nombre de vers vivants et morts est déterminé tous les deux à trois jours jusqu'à ce que tous les vers soient morts.

L'observation est effectuée à l'aide d'un microscope inversé et le nombre de vers morts et vivants est enregistré à chaque session. Bonjour, je suis Greg Solis. Je travaille au laboratoire Petro au sein du département de Physiologie Chimique de l'Institut de Recherche Scripps.

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment synchroniser des vers et les répartir dans des plaques microtitration à 96 puits. Le principal avantage de cette technique par rapport à vos méthodes existantes est qu'elle permet l'identification rapide de molécules allongeant la durée de vie et C. elegans. Commençons donc.

Pour préparer les bactéries servant de nourriture pour C. elegans, commencez au jour moins sept en inoculant cinq millilitres de TB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline et 0,1 microgramme par millilitre de tétracycline avec une colonie unique d'OP50. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un agitateur bactérien. Tôt le lendemain matin, diluez la culture de la nuit d'OP50 au 1/200 dans 300 millilitres de TB contenant 50 microgrammes par millilitre d'ampicilline. Incubez la culture dans un agitateur bactérien pendant huit à douze heures à 37 degrés Celsius, jusqu'à atteinte de la saturation. N'autorisez pas la culture à croître plus de 14 heures.

Transférez l'OP 50 dans un tube de centrifugation stérile préalablement pesé. Faites tomber en sédiment l'OP 50 par centrifugation pendant 10 minutes à 3 500 tr/min ou 2 200 × g dans une centrifugeuse de table. Jetez le surnageant S, resuspendez le culot d'OP 50 dans de l'eau distillée et refaites tomber en sédiment par centrifugation. Répétez ce lavage deux fois après le deuxième.

Lavez soigneusement et éliminez complètement toute l'eau résiduelle. Pesez le tube de centrifugation contenant le culot et soustrayez le poids du tube de centrifugation vide afin de déterminer la masse du culot. Ensuite, resuspendez complètement le culot dans du S Complete à une concentration de 100 milligrammes par millilitre.

Aucun grumeau ne doit subsister. La concentration de 100 milligrammes par millilitre d'OP 50 doit correspondre à deux fois 10 à la puissance 10 bactéries par millilitre. Utilisez le spectrophotomètre pour déterminer le nombre de bactéries par millilitre si la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries par millilitre est connue.

Si nécessaire, ajuster la concentration de la solution nutritive OP50 à deux fois 10 à la puissance 10 bactéries par millilitre. Enfin, conserver la solution OP50 à quatre degrés Celsius jusqu'à son utilisation pour la culture de vers afin de générer une population de vers âgée de manière synchronisée. Commencer en fin d'après-midi au jour moins six avec une plaque NGM âgée de cinq à dix jours sur laquelle la population de vers se compose principalement de larves L1 en état de privation alimentaire.

Stérilisez une spatule métallique en la chauffant brièvement au-dessus d'un bec Bunsen. Laissez-la refroidir. Utilisez ensuite la spatule refroidie pour découper des morceaux d'agar à partir de la boîte contenant les vers affamés.

Transférez plusieurs de ces morceaux sur une nouvelle plaque NGM de 10 centimètres ensemencée avec OP50. Incubez les vers pendant environ 65 heures à 20 degrés Celsius, jusqu'à ce qu'une grande partie de la population de vers soit constituée d'adultes matures. Le temps nécessaire pour que les animaux L1 privés de nourriture grandissent jusqu'au stade d'adultes matures peut varier selon les souches.

Après l'incubation, récupérez les vers à partir de la plaque de 10 centimètres en les rinçant de la plaque avec cinq à 10 millilitres d'eau stérile. Transférez la solution contenant les vers dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez les vers en les centrifugeant pendant deux minutes dans une centrifugeuse de table à 1 200 tr/min ou 280 × g. Jetez le surnageant et ajoutez 10 millilitres d'eau.

Répétez l'étape de lavage, éliminez le surnageant SUP et ajoutez cinq millilitres d'une solution de javel fraîchement préparée. Incubez avec la solution d'hydroxyde de sodium pendant cinq minutes à température ambiante jusqu'à ce que les vers se rompent. Veillez à effectuer un vortex doux chaque minute.

Surveiller l'avancement de la réaction au microscope stéréoscopique dès que tous les adultes se sont dissous. Ajouter cinq millilitres de tampon M neuf pour neutraliser la réaction. Laver les œufs trois fois avec 10 millilitres de tampon M neuf par centrifugation pendant deux minutes à 2 500 tr/min ou 1 100 × g. Puis laver les œufs une fois avec 10 millilitres de milieu S complet par centrifugation pendant deux minutes à 2 500 tr/min ou 1 100 × g. Éliminer le surnageant.

Ajouter 10 millilitres de milieu S complet et transférer la solution dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ajouter 30 millilitres de milieu S complet pour obtenir un volume final de 40 millilitres. Agiter doucement le tube toute la nuit à température ambiante sur un agitateur ou un dispositif similaire afin d'ensemencer les boîtes pour animaux le lendemain vers midi.

Sous un microscope stéréo, vérifiez si les vers ont éclos pendant la nuit. Déterminez la concentration de vers dans la solution S complète en comptant le nombre de vers dans des gouttes de 10 microlitres. À l’aide d’un microscope stéréo, comptez au moins 10 gouttes pour chaque échantillon.Resus.

Suspendre les vers à une concentration de 80 à 100 vers par millilitre. Dans le milieu S complet, ajouter de la carbenicilline à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre et de l'amphotéricine B à une concentration finale de 0,1 microgramme par millilitre. Agiter sur un agitateur.

Si vous préparez de plus grandes quantités de vers, utilisez un flacon non clon de 600 millilitres avec un bouchon filtrant. À 14 h 30, ajoutez l'OP 50 préparé dans la première partie à une concentration finale de six milligrammes par millilitre. Remettez l'OP 50 à quatre degrés Celsius. Transférez 120 microlitres de la solution de vers en OP 50 dans chaque puits d'une plaque de 96 puits avec fond transparent.

Veillez à conserver les vers et la suspension tout en pipetant ; scellez la plaque à l’aide d’un scellant adhésif afin d’éviter toute contamination et évaporation. Agitez la plaque sur un agitateur pour plaque microtitration pendant deux minutes, puis incubez-la pendant deux jours à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que les animaux atteignent le stade L4. Ensuite, pour stériliser les animaux, ajoutez 30 microlitres d’une solution mère de FUDR à 0,6 millimolaire dans chaque puits.

Cette étape permet d'ajuster le volume final de chaque puits à 150 microlitres et de réduire la concentration finale d'OP 50 de six milligrammes par millilitre à cinq milligrammes par millilitre. Scellez la plaque à l'aide de films adhésifs et agitez-la pendant deux à trois minutes sur un agitateur pour microplaque. Si l'OP 50 a été ajouté à 2 h 30 le jour moins deux, il est important d'ajouter le FUDR avant midi et de replacer les plaques dans l'incubateur à 20 degrés Celsius au plus tard à 9 h 00 le lendemain.

La majorité des animaux doivent être adultes et contenir plusieurs œufs. Ajouter à chacun les médicaments dont l'effet sur la durée de vie doit être testé, à la concentration souhaitée. Si les médicaments sont dissous dans du DMSO, la concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 0,6 %, car des concentrations de DMSO supérieures à 0,6 % raccourcissent la durée de vie d'*elgan* après l'ajout du médicament.

Sceller les plaques avec un film adhésif et les agiter pendant deux à trois minutes sur un agitateur pour plaque microtitration. Remettre les plaques dans l'incubateur à 20 degrés Celsius. L'ajout des médicaments peut occasionnellement entraîner la mort de quelques animaux par plaque, particulièrement lorsqu'on utilise un solvant autre que l'eau.

Utilisez un microscope inversé pour vérifier la présence d'animaux morts. Généralement, il devrait y avoir moins de 10 animaux morts par plaque de 96 puits. Replacez les plaques dans l'incubateur à 20 degrés Celsius pendant deux jours afin de permettre à l'oxygène frais de pénétrer dans la culture. Retirez le scellant.

Attendre une minute et refermer la plaque. Agiter la plaque pendant deux à trois minutes sur un agitateur de plaque microtiter, répéter une fois par semaine le cinquième jour de la période adulte. Ajouter cinq microlitres de la solution OP50 à 100 milligrammes par millilitre préparée précédemment dans chacun des 96 puits afin d'éviter la privation alimentaire. Les vers sont évalués pour leur durée de vie en fonction de leur mouvement trois fois par semaine, dès le début de l'expérience jusqu'à leur mort.

Utilisez un microscope inversé muni d'un objectif 2 x ou 2,5 x pour observer les vers dans des plaques à 96 puits au jour zéro, au début de l'expérience. Comptez le nombre total de vers dans chaque puits.

Les puits capteurs contenant plus de 18 animaux à partir de l'analyse présenteront un nombre insuffisant de OP 50 et montreront des effets de restriction alimentaire lors de chaque session de comptage. Enregistrez la date et le nombre d'animaux qui se déplacent comme animaux vivants. Le déplacement et le liquide sont bien plus faciles que sur milieu solide et peuvent être induits par une lumière intense.

L'utilisation d'un grossissement plus élevé peut aider à observer des mouvements très subtils, comme ceux situés à l'extrémité du pharynx. De tels mouvements subtils sont souvent les seuls observés chez les animaux très âgés. Remettez les boîtes dans l'incubateur à 20 degrés Celsius.

Répétez les séances de comptage tous les deux à trois jours jusqu'à ce que tous les animaux soient morts. Voici un exemple d'organisation d'une feuille Excel pour enregistrer les données de durée de vie pour chaque puits. Les coordonnées sur la plaque, la souche, la concentration du médicament, ainsi que le nombre total d'animaux vivants au jour zéro sont enregistrés au début de l'expérience.

Enregistrer la date ainsi que le nombre d'animaux vivants et morts trois fois par semaine afin de suivre la survie des différentes populations dans chaque puits. Cette figure présente les résultats de l'élégance marine, des courbes de durée de vie enregistrées à 20 degrés Celsius et à 25 degrés Celsius. Le test de durée de vie basé sur des microplaques reproduit fidèlement les variations de la durée de vie dépendantes de la température.

De même, comme illustré ici, le test en plaque microtitration reproduit les variations de durée de vie observées chez des mutants dont la durée de vie diffère de celle des animaux de type sauvage N2. Cette figure montre comment des doses croissantes de mirtazapine affectent la durée de vie moyenne de *C. elegans*. Les données obtenues à l’aide du test en plaque microtitration sont suffisamment quantitatives pour permettre de déterminer des relations dose-réponse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour cribler de grandes bibliothèques chimiques afin d’identifier des molécules allongeant la durée de vie chez *C. elegans*.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.