Mesure Caenorhabditis elegans à 96 plaques de microtitration bien

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la durée de vie des vers de mer Elgan qui ont été traités avec des médicaments d’intérêt. Ceci est réalisé en préparant d’abord OP 50, une souche bactérienne, qui est utilisée pour nourrir les vers. Une population de vers synchronisée par âge est ensuite générée et ensemencée dans des plaques de 96 puits avec la bactérie nourricière OP 50.

Au cours des deux jours suivants, les vers atteignent le stade larvaire L quatre et le médicament FUDR est ajouté pour empêcher la reproduction. Le lendemain, les vers atteignent l’âge adulte et les médicaments d’intérêt sont ajoutés aux puits individuels. À partir de ce moment, le nombre de vers vivants et morts est déterminé tous les deux à trois jours jusqu’à ce que tous les vers soient morts.

L’observation se fait à l’aide d’un microscope inversé et le nombre de vers morts et vivants est enregistré à chaque séance. Bonjour, je m’appelle Greg Solis. Je travaille au laboratoire Petro du département de physiologie chimique de l’Institut de recherche Scripps.

Aujourd’hui, je vais vous montrer comment synchroniser les vers et les distribuer dans 96 plaques de microtitration murales. Le principal avantage de cette technique par rapport à vos méthodes existantes est qu’elle permet d’identifier rapidement les molécules qui prolongent la durée de vie et l’élégance du C. Alors commençons.

Pour préparer l’alimentation des bactéries à l’élégance C, commencez le jour moins sept en inoculant cinq millilitres de TB contenant 100 microgrammes par millilitre et de la persine, et 0,1 microgramme par millilitre et de la térine B avec une seule colonie d’OP 50, incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un agitateur bactérien tôt le lendemain matin, diluez la culture de nuit d’OP 51 en 2000 dans 300 millilitres de TB contenant 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Incuber la culture dans un agitateur bactérien pendant huit à 12 heures à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la saturation soit atteinte. Ne laissez pas la culture pousser plus de 14 heures.

Transférez l’OP 50 dans un tube de centrifugation pré-lesté stérile Granulez l’OP 50 par centrifugation pendant 10 minutes à 3 500 tr/min ou 2 200 fois G dans une centrifugeuse de table. Jetez le surnageant S, remettez en suspension le granulé OP 50 et allumez notre eau et rep le granulé par centrifugation. Répétez cette opération, lavez deux fois après la seconde.

Lavez soigneusement et retirez soigneusement toute l’eau restante. Pesez le tube de centrifugation contenant le granulé et soustrayez le poids du tube de centrifugation vide afin de déterminer le poids du granulé. Ensuite, remettez complètement en suspension le granulé dans S Complete à une concentration de 100 milligrammes par millilitre.

Il ne faut pas laisser de grumeaux. La concentration de 100 milligrammes par millilitre OP 50 doit correspondre à deux fois 10 à 10 bactéries par millilitre. Utilisez le photospectromètre pour déterminer le nombre de bactéries par millilitre si la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries par millilitre est connue.

Si nécessaire, ajustez la concentration de la solution d’alimentation OP 50 à deux fois 10 à 10 bactéries par millilitre. Enfin, conservez la solution OP 50 à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour la culture de vers afin de générer une population de vers synchrone selon l’âge. Commencer en fin d’après-midi le jour moins six avec une plaque NGM vieille de cinq à dix jours sur laquelle la population de vers se compose principalement de larves L one affamées.

Stérilisez une spatule métallique en la chauffant brièvement sur un bec Bunsen. Laissez refroidir. Ensuite, utilisez la spatule froide pour découper des morceaux d’agar dans la plaque contenant les vers affamés.

Transférez plusieurs de ces morceaux sur une plaque NGM fraîche de 10 centimètres ensemencée avec OP 50. Incuber les vers pendant environ 65 heures à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que la majorité de la population de vers soit constituée d’adultes graves. Le temps qu’il faut aux animaux L one affamés pour devenir des adultes graves peut varier d’une souche à l’autre.

Après l’incubation, récupérez les vers de la plaque de 10 centimètres en les lavant de la plaque avec cinq à 10 millilitres d’eau stérile. Transférez la solution d’eau de ver dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez les vers en les centrifugeant pendant deux minutes dans une centrifugeuse de table à 1, 200 tr/min ou 280 fois G. Jetez le supinate et ajoutez 10 millilitres d’eau.

Répétez l’étape de lavage, retirez le liquide de sup et ajoutez cinq millilitres d’eau de Javel fraîchement préparée. La solution d’hydroxyde de sodium incubée pendant cinq minutes à RT jusqu’à ce que les vers s’ouvrent. Assurez-vous de vortex doucement chaque minute.

Surveiller la progression de la réaction au microscope de dissection dès que tous les adultes se dissolvent. Ajoutez cinq millilitres de tampon M neuf pour neutraliser la réaction. Lavez les œufs trois fois avec 10 millilitres de tampon M neuf en centrifugant pendant deux minutes à 2 500 tr/min ou 1 100 fois G.Lavez ensuite les œufs une fois avec 10 millilitres de S complets en centrifugant pendant deux minutes à 2 500 tr/min ou 1 100 fois G.Retirez le morceau.

Ajoutez 10 millilitres de S complet et transférez la solution dans un tube conique frais de 50 millilitres. Ajoutez 30 millilitres de S complet à un volume final de 40 millilitres. Agitez doucement le tube pendant la nuit à température ambiante sur un mutateur ou un appareil similaire pour ensemencer les plaques animales le lendemain vers midi.

Sous une lunette de dissection, vérifiez si les vers ont éclos pendant la nuit. Déterminez la concentration de vers dans la solution complète S en comptant le nombre de vers dans des gouttes de 10 microlitres. À l’aide d’une lunette de dissection, comptez au moins 10 gouttes pour chaque échantillon. Resus.

Suspendez les vers à une concentration de 80 à 100 vers par millilitre. Dans le milieu complet S, ajoutez de la carbénicilline à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre et de l’amphotéricine B à une concentration finale de 0,1 microgramme par millilitre. Secouez sur un mutateur.

Si vous préparez de plus grandes quantités de vers, utilisez une fiole non clonée de 600 millilitres avec un capuchon filtrant À 14h30 Ajoutez l’OP 50 préparé dans la première partie jusqu’à une concentration finale de six milligrammes par millilitre. Ramenez l’OP 50 à quatre degrés Celsius. Transférez 120 microlitres de la solution de vis sans fin OP 50 dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond transparent.

Assurez-vous de garder les vers et la suspension pendant le pipetage, scellez la plaque à l’aide d’un scelleur à ruban pour éviter la contamination et l’évaporation. Agitez la plaque sur un agitateur à microtitration pendant deux minutes et incubez pendant deux jours à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que les animaux atteignent le stade L quatre. Ensuite, pour stériliser les animaux, ajoutez 30 microlitres d’une solution mère FUDR de 0,6 millimolaire dans chaque puits.

Cette étape porte le volume final dans chaque puits à 150 microlitres et réduit la concentration finale d’OP 50 de six milligrammes par millilitre à cinq milligrammes par millilitre. Scellez la plaque à l’aide de scelleuses à ruban adhésif et secouez-la pendant deux à trois minutes sur un agitateur à plaque microt. Si l’OP 50 a été ajouté à deux h 30 le jour moins deux, il est important que le FUDR soit ajouté avant midi pour retourner les plaques à l’incubateur à 20 degrés Celsius avant 9h00 le lendemain.

La plupart des animaux doivent être graves et contenir plusieurs œufs. Chacun ajoute les médicaments dont l’effet sur la durée de vie est à tester à la concentration souhaitée. En cas de dissolution des médicaments dans le DMSO, les concentrations finales de DMSO ne doivent pas dépasser 0,6 %car les concentrations de DMSO supérieures à 0,6 % raccourcissent la durée de vie elgan après l’ajout du médicament.

Scellez les plaques avec du ruban adhésif et secouez-les pendant deux à trois minutes sur une plaque de microtitration. L’agitateur remet les plaques dans l’incubateur à 20 degrés Celsius. L’ajout de médicaments peut parfois tuer quelques animaux par plaque, surtout si vous utilisez un solvant autre que l’eau.

Utilisez un microscope inversé pour vérifier s’il y a des animaux morts. En général, il devrait y avoir moins de 10 animaux morts par 96 plaques du monde. Remettez les plaques dans l’incubateur à 20 degrés Celsius pendant deux jours pour permettre à l’oxygène frais d’entrer dans la culture. Retirez le scellant.

Attendez une minute et refermez la plaque. Agitez la plaque pendant deux à trois minutes sur une plaque plus étanche au microt, répétez l’opération une fois par semaine le cinquième jour de la vie adulte, ajoutez cinq microlitres de la solution OP 50 de 100 milligrammes par millilitre qui a été préparée plus tôt dans chacun des 96 puits pour éviter la famine. La durée de vie des vers est évaluée en fonction de leur mouvement trois fois par semaine depuis le début de l’expérience jusqu’à leur mort.

Utilisez un microscope inversé avec un objectif deux x ou 2,5 x pour observer les vers en 96. Plaques de puits au jour zéro au début de l’expérience. Comptez le nombre total de vers dans chaque puits.

Les puits de capteurs qui contiennent plus de 18 animaux de l’analyse, car les animaux dans ces puits n’auront pas assez d’OP 50 et montreront les effets de la restriction alimentaire à chaque séance de comptage. Notez la date et le nombre d’animaux qui se déplacent en tant qu’animaux vivants. Le mouvement et le liquide sont beaucoup plus faciles que sur des supports solides et peuvent être induits par des lumières fortes.

L’utilisation d’un grossissement plus élevé peut aider à repérer des mouvements très subtils comme ceux à l’extrémité du pharynx. De tels mouvements subtils sont souvent les seuls mouvements observés chez les animaux très âgés. Remettez les plaques dans l’incubateur à 20 degrés Celsius.

Répétez les séances de comptage tous les deux à trois jours jusqu’à ce que tous les animaux soient morts. Il s’agit d’une conception d’une feuille Excel permettant d’enregistrer les données de durée de vie de chaque puits. Sa coordonnée dans la souche de plaque, la concentration du médicament et le nombre total d’animaux vivants au jour zéro sont enregistrés au début de l’expérience.

Enregistrez la date ainsi que le nombre d’animaux vivants et morts trois fois par semaine afin de suivre la survie des différentes populations dans chaque puits. Cette figure montre les résultats de l’élégance de la mer, de la durée de vie, des courbes enregistrées à 20 degrés Celsius et 25 degrés Celsius. Le test de durée de vie basé sur le microtitration reproduit avec précision les changements de durée de vie en fonction de la température.

De même, comme le montre ici, le test de la plaque de microtitration reproduit les changements de durée de vie des mutants signalés comme ayant des durées de vie différentes de celles des animaux sauvages de type N deux. Cette figure montre comment l’augmentation des doses de mirtazapine affecte la durée de vie moyenne de l’élégance de la mer. Les données obtenues par le dosage sur plaque de microtitration sont suffisamment quantitatives pour déterminer les relations dose-réponse Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour cribler de grandes bibliothèques chimiques à la recherche de molécules qui prolongent la durée de vie et donnent de l’élégance.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.