Terminaux de chargement nerveuse chez la drosophile avec des indicateurs de calcium

Bonjour, je m'appelle Greg McLeod. Mon laboratoire étudie la régulation du calcium dans les terminaisons nerveuses et son impact sur la neurotransmission. Nous menons ces recherches chez Drosophila melanogaster.

La drosophile constitue un modèle attrayant pour les neuroscientifiques en raison de sa malléabilité génétique et de son système nerveux simple et accessible. Dans ce système nerveux, des indicateurs fluorescents génétiquement ENC covid sont disponibles pour détecter les variations du calcium dans les terminaisons nerveuses. Toutefois, ces indicateurs présentent une sensibilité limitée au calcium et montrent souvent une réponse non linéaire.

Les indicateurs synthétiques conviennent mieux à la mesure des variations rapides du calcium associées à l'activité nerveuse. Nous allons démontrer une technique permettant de charger des indicateurs synthétiques de calcium conjugués à la dextrine dans des terminaisons nerveuses vivantes dans de la lave ophtalmique. La conjugaison à la dextrine contribue à empêcher les indicateurs de calcium d'être séquestrés dans des organites tels que les mitochondries.

La technique de chargement peut être appliquée de manière équivalente aux larves, aux embryons et aux adultes. Nous allons disséquer une larve dans un petit bain en forme de cigare sur une lame de verre. La cire dentaire bleue servira de support à un lit de chargement en verre.

Prenez une larve de troisième stade issue d'un flacon peu encombré. Placez la larve dans quelques gouttes de solution de Schneider refroidie et fixez-la par la tête et la queue, le dos vers le haut. Utilisez une paire de micro-ciseaux pointus pour faire une petite incision.

Une petite incision entre les segments thoraciques ici, suffisamment grande pour permettre à la lame inférieure des ciseaux de pénétrer. Couper la cuticule le long de la ligne médiane dorsale entre les segments thoraciques jusqu'à la tête. Tourner la larve de 180 degrés et prolonger l'incision jusqu'à l'extrémité de la queue.

Il est important de ne pas laisser la lame inférieure pénétrer trop profondément dans les viscères, mais bien dans la larve, car cela endommagerait les muscles et les nerfs que l'on souhaite examiner. La majeure partie des viscères remontera par l'incision ; sectionnez la piste ici près de la queue d'un côté, puis sectionnez la trachée sous-jacente sur toute la longueur jusqu'à la tête. Répétez l'opération de l'autre côté.

Retirez la majeure partie des viscères en les coupant et en les sortant du bain. Prenez un moment pour poser les ciseaux et prendre une deuxième paire de forceps. Saisissez le bord coupé de la cuticule et épinglez-la sur le côté.

Répétez pour l'autre côté. Avancez de quatre segments vers la tête pour répéter la procédure. Coupez. Toute viscère restante à ce stade, assurez-vous qu'aucun dommage n'a été causé aux muscles 7, 6, 13 ou 12 dans aucun des segments.

Si certains ont été endommagés, disséquez une autre larve, car ces dommages entraînent inévitablement des contractions géniques qui rendront tout examen ultérieur par imagerie problématique. Les hémisphères cérébraux, le ganglion ventral et les nerfs segmentaires sont désormais visibles dans les étapes suivantes. Nous allons introduire l'extrémité coupée sous pression dans le nerf segmentaire sur un lit de FOP en verre, puis utiliser un filament de remplissage en plastique pour appliquer un indicateur calcique sur l'extrémité exposée du nerf.

Mais tout d'abord, nous allons démontrer comment fabriquer le filament de remplissage et l'effet de remplissage pour créer le filament de remplissage. Une technique de tirage en deux étapes sera appliquée à un jaune défectueux, chauffé lentement à mi-longueur jusqu'à ce que le plastique devienne mou et transparent. Arrêtez le chauffage à ce stade et tirez immédiatement sur l'extrémité pour l'étirer en un fin brin.

Cela représente environ un demi-millimètre de diamètre. Coupez le filament sur une longueur de 50 millimètres. Placez maintenant le filament sous un microscope stéréo et fixez l'extrémité coupée.

Terminez par une pastille et tirez l’autre extrémité pour extraire un fin filament d’un centimètre de longueur. Celui-ci doit être coupé avec une lame de rasoir neuve sur du papier absorbant afin d’éviter de l’écraser et de rendre son tranchant insuffisant pour préparer le remplissage. Commencez avec une capillaire à paroi fine sans aucun filament.

Donnez-lui une pointe effilée à l’aide d’un tireur de micropipettes. Placez cette micropipette préparée sous un microscope stéréoscopique et rayez la partie effilée avec un morceau de papier de verre. Poussez l’extrémité distale par rapport au trait de rayure, dans la direction opposée au côté rayé, de sorte que l’extrémité casse nettement.

Le diamètre intérieur de la rupture doit être supérieur au diamètre extérieur. À l'extrémité du filament de remplissage, utilisez un micro-four pour rétrécir par chauffage la rupture dans le verre jusqu'à ce qu'il atteigne un diamètre interne d'environ 12 micromètres. Utilisez un bec Bunsen pour polir l'extrémité émoussée de la pointe.

Une pression négative peut être appliquée à l'extrémité émoussée de l'effet à l'aide d'un tube en celtic ajusté hermétiquement, couplé à un tube rigide en polyligne et à une seringue. Le même tube et la même seringue seront utilisés pour aspirer et expulser l'indicateur de calcium à partir du filament. L'indicateur de calcium doit être dissous dans de l'eau distillée à une concentration de cinq milli.

Divisez cette solution en aliquotes de cinq microlitres. Chauffez-les à quatre degrés poissons. Ne congélez pas ces quats afin de les maintenir non congelés jusqu'à leur utilisation.

Prélevez maintenant un à deux centimètres de l'indicateur calcique dans le filament et vous êtes prêt à passer à l'étape la plus critique de cette technique de chargement. Prenez vos ciseaux et votre pince, puis sectionnez individuellement les nerfs du segment le plus antérieur, au plus près des ganglions ventraux. La masse nerveuse du segment le plus antérieur provient du ventre ventral.

Retirez tous les débris. Placez le filament de remplissage sur la rampe en cire dentaire, avec la pointe au centre de la larve. Fixez le tube scolaire et la seringue.

Aspirez un peu de solution de Schneider dans une pointe parfaite. Aspirez maintenant l'extrémité du nerf dans la pointe. L'ajustement doit être étanche mais pas trop serré.

Il doit bloquer toute entrée ultérieure des Schneiders dans la zone à protéger. Retirez généralement le tube scolaire et la seringue, puis fixez-les au filament F. Touchez le côté du filament aux Schneiders dans le bain afin de dissiper toute électricité statique, puis insérez immédiatement l'effet gomme du filament à moins de 50 microns de la section du nerf, sans toutefois le toucher.

Éjecter lentement l'indicateur de calcium afin d'augmenter le volume du milieu Schneider d'environ un tiers. La concentration finale de l'indicateur de calcium sera ainsi légèrement inférieure à deux milli. Laisser la préparation pendant environ 40 minutes dans un endroit sombre et humide, à température ambiante. Je souhaite souligner ici deux points importants.

Tout d'abord, une solution physiologique doit être présente dans la pointe pour diluer l'indicateur de calcium, car l'indicateur de calcium a été solubilisé uniquement dans l'eau. La solution physiologique doit contenir du calcium à une concentration de plusieurs millimolaires, car le phénomène de plafonnement de l'axone dépend du calcium, et ce plafonnement est essentiel pour préserver la santé des terminaisons nerveuses.

Le deuxième point est qu'aucune période supérieure à cinq minutes ne doit s'écouler entre la section des nerfs et l'application du colorant sur l'extrémité coupée du nerf. Après cinq minutes, les extrémités proximales des axones excluront les indicateurs calciques conjugués au dextran ayant des masses moléculaires de 10 000. Respecter cette limite de temps nécessitera un peu d'entraînement.

Ne tentez pas de ralentir le plafonnement de l'axone en réduisant les niveaux de calcium, car cela compromettrait uniquement la fonction physiologique future du nerf lésé. Après l'incubation de 40 minutes, placez la préparation dans du Schneiders en touchant le côté du filament de remplissage contre le bain, puis réinsérez-le afin d'éliminer la majeure partie de la solution indicatrice de calcium présente à l'extrémité et dans le démarreur. Ensuite, à l’aide du filament, aspirez du nouveau milieu Schneiders depuis le bain et remplissez complètement la chambre avec du Schneiders.

Il ne doit y avoir aucune bulle dans le lit, car la solution de Schneider servira l'un des conducteurs isolés du bain tandis que le verre de la pipette stimulera le nerf ; placez à nouveau le montage dans un endroit sombre pendant au moins 60 minutes, mais pas plus de quatre heures, et remplacez les milieux par du Schneider frais toutes les 30 minutes pendant l'incubation. L'indicateur de calcium est transporté vers le bas. L'axone s'accumule dans la terminaison nerveuse 20 minutes avant l'examen du montage. Rincez-le avec la solution HL6.

Contenir le niveau souhaité de calcium lorsque le taux de calcium est supérieur à environ 0,4 millimolaire, en ajoutant du glutamate ou de l'acide L-glutamique à la solution HL6/7 à 7 millimolaire afin d'arrêter la contraction musculaire induite par le nerf. La solution de Schneider n'est pas adaptée à l'imagerie du calcium, car elle contient déjà des concentrations élevées de glutamate et de calcium. Vous devrez ajuster ces concentrations.

Tate est également présent, ce qui permet d'effectuer le chargement autofluorescent de Schneider et l'imagerie en milieu HL6, à condition que le calcium soit présent à une concentration d'au moins 2 millions pendant le chargement. Lors de la mise en place du montage sur un microscope composé pour l'imagerie, veillez de nouveau à décharger toute électricité statique. Ensuite, touchez à la fois la solution dans le bain et l'objectif avec une paire de forceps.

Si l'objectif est un objectif à immersion, abaissez-le jusqu'au bain, puis reliez momentanément la base à la masse de manière appropriée, ou placez une électrode dans le bain et insérez l'autre dans le remplissage de la chambre ; des impulsions DC carrées de moins de trois volts et d'une durée de 300 microsecondes déclencheront de façon fiable un potentiel d'action dans le nerf. Ici, nous observons deux groupes de terminaisons nerveuses dans l'espace situé entre les muscles six et sept, rendus visibles grâce à l'expression cytosolique de la GFP. Ces terminaisons ont également été rétrogradement remplies avec l'indicateur calcique Rod Dextran, qui possède des spectres d'excitation et d'émission différents de ceux de la GFP.

Ce champ de vision contient encore les terminaisons nerveuses, mais Rod Rin possède une faible affinité pour le calcium et est presque invisible lorsque le nerf est au repos. Il réagit toutefois fortement au calcium pénétrant dans les terminaisons lors de potentiels d'action isolés ou de courtes séries de stimuli de deux secondes. Comme illustré ici dans l'analyse de fluorescence des trains rapprochés à 80 hertz précédemment montrés, les réponses dans les terminaisons de type 1 S sont généralement plus importantes que celles observées dans les terminaisons de type 1 B.

Indicateurs calciques à faible affinité tels que le dextran rouge et le fluo. Un dextran quatre montre une réponse presque linéaire aux fréquences de stimulation nerveuse dans ces terminaisons, dans une gamme allant de 10 à 80 hertz. L'exemple présenté ici provient d'une terminaison nerveuse sur le muscle numéro quatre, chargée avec du Dextran Rouge.