Name: Changement de forme dimagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Découvrez l'imagerie confocale en temps réel des changements de forme cellulaire dans les embryons de Drosophila melanogaster. Cette méthode permet d'observer la cellularisation et les dynamiques du développement embryonnaire.

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Nous remercions chaleureusement Eric Wieschaus, qui a fourni la base sur laquelle ce protocole a été développé. Notre travail est soutenu par un ministère Verna &amp; Marrs McLean, de Biochimie et Biologie Moléculaire Start-up Award, Baylor College of Medicine.

<ol><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).</li>
<li>Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).</li>
<li>Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+genetic+basis+of+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the genetic basis of neural tube defects.</a> Clin Genet. 71, 295-310 (2007).</li>
<li>Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+tube+morphogenesis+during+Drosophila+tracheal+development+requires+Piopio%2C+a+luminal+ZP+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein.</a> Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131, 3021-3034 (2004).</li>
<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).</li>
<li>Lecuit, T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+insertion+of+new+membrane+from+a+cytoplasmic+reservoir+during+cleavage+of+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo.</a> J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).</li>
<li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+polarity+and+compartmentalization+are+established+before+cellularization+in+the+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo.</a> Dev Cell. 16, 93-104 (2009).</li>
<li>Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Actin+Dynamics+Facilitate+Early-Stage+Centrosome+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation.</a> Curr Biol. , (2010).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+actin-dependent+endocytosis+is+zygotically+controlled+to+initiate+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 14, 775-786 (2008).</li>
<li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abelson+kinase+%28Abl%29+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134, 567-578 (2007).</li>
<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457, 495-499 (2009).</li>
<li>Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+junction+remodelling+controls+planar+cell+intercalation+and+axis+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation.</a> Nature. 429, 667-671 (2004).</li>
<li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li>
<li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li>
<li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li>
<li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

Le protocole décrit aux présentes permettra de vivre, l&#39;imagerie confocale d&#39;un certain nombre de changements de forme cellulaire dans l&#39;embryon de mouche en développement. Stocks GFP pour l&#39;imagerie peut être préparé par un laboratoire individuel (tableau 2), mais beaucoup de ces stocks sont également accessibles au public à partir des centres tels que la drosophile Bloomington Stock Center à l&#39;Université d&#39;Indiana ( <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indian...

<table><tbody><tr><td>Lames</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Lames couvre-objets 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>Flacons pulvérisateurs (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Embouts pour pipettes, 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de scintillation avec bouchons</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Béchers Tri-Corn, 100 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de Petri BD Falcon 60x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulaire BD Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette jaunes</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>Maille en acier inoxydable, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre de 5&amp;#190; pouces</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre P4</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>Élastiques</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Scotch double face, &amp;frac12; pouce</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Brosses à peinture Robert Simmons Expression E85 ronde n°2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont n°5, haute précision en inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Huile de halocarbone 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>Héptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar BD Bacto</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Acide p-hydroxybenzoïque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Levure sèche active Red Star</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Serviettes en papier, pliées en C</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier d’aluminium extra fort</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jus de pomme 100 %</td><td>Ocean Spray ou Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie drosophile embryons

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Le développement de l&#39;embryon de Drosophila melanogaster subit un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont extrêmement sensibles à vivre l&#39;imagerie confocale. Les changements de forme cellulaire chez la mouche sont analogues à celles dans les organismes supérieurs, et ils conduisent la morphogenèse des tissus. Ainsi, dans de nombreux cas, leur étude a des implications directes pour la compréhension de la maladie humaine (tableau 1) 1-5. Sur l&#39;échelle sub-cellulaire, ces changements de forme des cellules sont le produit d&#39;activités allant de l&#39;expression génique au transduction du signal, la polarité cellulaire, le remodelage du cytosquelette et le trafic membranaire. Ainsi, l&#39;embryon de drosophile permet non seulement le contexte pour évaluer les changements de forme cellulaire comme ils se rapportent à la morphogenèse des tissus, mais offre également un environnement complètement physiologique pour étudier les activités sub-cellulaire que les cellules forme. Le protocole décrit ici est conçu à l&#39;image d&#39;un changement de cellule spécifique forme appelée cellularisation. Cellularisation est un processus de croissance de la membrane plasmique dramatique, et il convertit finalement l&#39;embryon syncytial dans le blastoderme cellulaire. C&#39;est, à l&#39;interphase du cycle mitotique 14, la membrane plasmique s&#39;invagine simultanément autour de chacun des noyaux ~ 6000 corticale ancré à générer une feuille de cellules épithéliales primaires. Contre les suggestions précédentes, cellularisation n&#39;est pas entraîné par la myosine-2 de la contractilité 6, mais est plutôt largement alimentée par exocytose de la membrane des magasins internes 7. Ainsi, cellularisation est un excellent système pour étudier le trafic membranaire pendant les changements de forme des cellules qui nécessitent une invagination membrane plasmique ou d&#39;expansion, comme la cytocinèse ou transversale-tubules (T-tubules) morphogenèse dans le muscle. Notez que ce protocole est facilement appliquée à l&#39;imagerie d&#39;autres changements de forme cellulaire dans l&#39;embryon de mouche, et ne nécessite que de légères adaptations telles que changer la scène de la collecte d&#39;embryons, ou en utilisant &quot;colle embryon&quot; pour monter l&#39;embryon dans une orientation spécifique (tableau 1) 8-19. Dans tous les cas, le workflow est fondamentalement le même (figure 1). Les méthodes standard pour le clonage et la transgénèse chez la drosophile sont utilisées pour préparer les stocks de mouche des étables qui expriment une protéine d&#39;intérêt, fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variantes, et ces mouches de fournir une source renouvelable d&#39;embryons. Alternativement, les protéines fluorescentes / sondes sont directement introduits dans des embryons volée via simples techniques de la micro-injection 9-10. Ensuite, selon l&#39;événement de développement et de changer de forme cellulaire à imager, les embryons sont collectés et mis en scène par la morphologie d&#39;un microscope à dissection, et enfin positionné et monté pour imagerie time-lapse sur un microscope confocal.

Le développement précoce de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est caractérisée par un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont bien adaptés pour des approches d&#39;imagerie. Cet article décrit les outils et méthodes de base nécessaires à l&#39;imagerie confocale direct d&#39;embryons de drosophile, et mettra l&#39;accent sur un changement de forme de la cellule appelée cellularisation.

Changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons

L'embryon de Drosophila melanogaster en développement subit un certain nombre de changements de morphologie cellulaire qui se prêtent particulièrement bien à l'imagerie confocale sur cellules vivantes. La forme des cellules...

L'objectif général de cette procédure est d'observer les changements de forme cellulaire dans des embryons de drosophile vivants. Cela est réalisé en premier lieu en générant et en élargissant des lignées de mouches transgéniques exprimant des sondes protéiques marquées par la GFP. La deuxième étape de la procédure consiste à transférer ces mouches dans des gobelets de collecte d'embryons.La troisième étape de la procédure consiste à collecter les embryons. La quatrième étape consiste à recouvrir et monter l'embryon. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les changements de forme cellulaire, tels que les cellules, par imagerie confocale en temps réel des embryons montés.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'imagerie de tissus fixés, réside dans la possibilité de capturer les aspects dynamiques des changements de forme cellulaire dans le contexte d'embryons vivants. Bien que la méthode décrite ici soit adaptée à la formation de l'œsophage, elle peut être modifiée et appliquée à d'autres changements de forme cellulaire accompagnant le développement précoce de la drosophile, tels que la formation du sillon ventral, l'extension de la bande germinative, la trachéogenèse et la fermeture dorsale. Les personnes novices dans cette technique ont souvent du mal à manipuler et monter les embryons sous le microscope stéréoscopique.Ma directrice de thèse, Anna Marie Soki, et moi-même allons démontrer cette procédure. Cette procédure commence par la fabrication d'un récipient pour la collecte des embryons : à l'aide d'un rasoir, découpez le fond d'un bécher tricorn de 100 millilitres, en lissant le bord autant que possible. Retranchez les trois coins du haut afin de faciliter la manipulation du récipient.Ensuite, découpez un carré de treillis métallique de six centimètres sur six centimètres en travaillant sous une hotte. Placez un morceau de papier d’aluminium renforcé sur une plaque chauffante préchauffée et posez un carré de treillis métallique sur le papier d’aluminium. Appliquez fermement le bord inférieur découpé du gobelet sur le treillis chaud.Attendez quelques secondes, puis soulevez le gobelet avec le maillage désormais fixé. Si la feuille d'aluminium adhère également, retirez-la délicatement. Laissez le gobelet toute la nuit le jour suivant.Retirez l'excès de treillis avec des ciseaux et poncez les bords tranchants à l’aide d’un papier de verre fin. La prochaine étape consiste à préparer une pâte de levure, qui favorisera la production d’embryons par les femelles. Remplissez un petit récipient avec des quantités à peu près égales de levure sèche active Red Star et d’eau distillée, puis mélangez jusqu’à dissolution complète de la levure.La pâte doit avoir une consistance similaire à celle du beurre d'arachide humide. Lorsque la pâte de levure est prête, retirez les plaques d'agar jus de pomme du stockage à quatre degrés Celsius. La description de la préparation des plaques d'agar jus de pomme se trouve dans le manuscrit associé intitulé « streak ».Placer les plaques contenant le jus de pomme et la pâte de levure et attendre au moins une heure pour que les plaques atteignent la température ambiante. Plier un papier filtre circulaire en deux, puis encore en deux.Coupez le papier en un cercle de huit à neuf centimètres de diamètre. Réalisez des plis en accordéon dans le quart de cercle. Dépliez le cercle, retournez-le, puis insérez-le dans un godet de collecte jusqu’à ce qu’il touche le maillage.Veillez à ce que le papier soit bien fixé dans le gobelet afin qu'il ne tombe pas et n'écrase pas les mouches. Il est maintenant temps de transférer les mouches. Prenez une bouteille de souche de mouches ayant eu deux semaines pour se reproduire. Cette bouteille devrait contenir suffisamment de mouches pour remplir un gobelet de collecte d'embryons avec un minimum de 50 femelles et de 30 mâles.Pour une ponte optimale, utilisez des mouches âgées de moins de cinq jours après l'éclosion. Étiquetez le gobelet de collecte avec le nom de la souche et la date. Retournez la bouteille contenant les mouches et secouez-la doucement au-dessus du gobelet afin de transférer les mouches dans celui-ci, puis recouvrez immédiatement le gobelet avec une plaque de jus de pomme préparée.Fixez la plaque à la coupelle à l'aide d'un élastique. Placez la coupelle en maille à l'abri, à température ambiante, dans un endroit exposé à la lumière directe. Veillez à ce qu'aucune ombre ne tombe sur la coupelle, car les mouches ne pondront pas correctement dans l'obscurité. Après deux heures, récupérez les embryons en remplaçant la plaque de jus de pomme par une nouvelle plaque pour nos collectes à température ambiante.Convient bien pour l'imagerie cellulaire. Ensuite, préparez une chambre de montage pour les embryons. Pour ce faire, coupez un morceau de ruban adhésif double face d'une longueur de deux à trois centimètres et placez-le sur une lame en alignant les axes longs du ruban et de la lame.Coupez un deuxième morceau de ruban adhésif double face d'une longueur de deux à trois centimètres et superposez-le sur l'autre morceau de ruban, en veillant à aligner leurs bords. À l’aide d’un scalpel, effectuez deux incisions d’environ trois millimètres d’écart au centre du ruban, perpendiculairement à l’axe longitudinal de la lame. Retirez le ruban situé entre les deux incisions afin de former un canal, puis déposez une goutte de pipette d’huile halo carbone 27 dans le canal.Ce canal est l'endroit où les embryons seront montés. Traitez les embryons en recouvrant la boîte de jus de pomme avec de l'eau de Javel à 50 % pendant 30 à 60 secondes. Récupérez les embryons dans un tamis à cellules et rincez-les énergiquement avec de l'eau distillée à l'aide d'une bouteille pulvérisatrice.Tapotez le tamis sur des serviettes en papier. Utilisez un pinceau humide pour transférer de 10 à 50 embryons enrobés dans une plaque propre contenant du jus de pomme, sans pâte de levure. Absorbez l’eau à l’aide du bord déchiré d’une serviette en papier et recouvrez immédiatement les embryons d’une petite quantité d’huile halo carbon 27.Déplacer la plaque de jus de pomme vers un microscope stéréo utilisant la lumière transmise. Stager les embryons selon les critères morphologiques de Bounds. Utiliser une pince pour transférer cinq embryons en cycle mitotique 11 ou 12, correspondant au stade 4 de Bounds, dans le canal de la chambre de montage.Disposer les embryons en ligne de manière à ce que les côtés dorsal et ventral soient visibles et que leur face latérale soit orientée vers le bas. Les embryons s'organisent facilement dans cette orientation dans l'huile seule. Pour éviter d'entasser les embryons les uns contre les autres, laisser un espace d'au moins la moitié de la longueur d'un embryon entre chaque embryon.Placez un bord d'une lame carrée de 25 sur 25 millimètres sur le ruban adhésif double face située d'un côté du canal, en alignant un bord de la lame avec un bord du ruban. Abaissez la lame pour recouvrir le canal. Si de l'air est emprisonné sous la lame, appliquez une petite quantité d'huile sur le bord de la lame.L'action capillaire fera pénétrer l'huile dans le canal et chassera l'air. Placer la chambre de montage sur le microscope confocal et localiser les embryons en lumière transmise. Puis passer à l'imagerie confocale pour focaliser sur une région d'intérêt afin d'obtenir une image cellulaire en un seul plan situé près du milieu de l'embryon.Pour suivre la dynamique de l'invagination, utilisez des intervalles allant de 30 à 62 pour l'imagerie en temps réel. Après avoir acquis les images, analysez-les à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images tel que le logiciel gratuit d'NIH appelé ImageJ. Les données peuvent ensuite être présentées sous forme de films, de séquences ou de graphiques CH. Pour imager un changement de forme cellulaire autre que cellulaire, il peut être nécessaire de monter les embryons dans une orientation spécifique qui n'est pas facilement maintenue à l'huile seule.Pour ce faire, utilisez une méthode de montage alternative à celle décrite précédemment. Commencez par préparer une colle pour embryons en mélangeant 20 centimètres de ruban adhésif double face avec 250 microlitres d'heptane dans un flacon d'incubation. Placez ce flacon sur un agitateur ou une plateforme rotative et mélangez toute la nuit.Le lendemain, plongez une pointe de pipette jaune dans la colle pour embryons, puis faites glisser la pointe le long d'une lame en laissant une traînée de colle pendant que l'heptane de la colle s'évapore. Disposez les embryons étalonnés sur un bloc d'agar de manière à ce que la surface de l'embryon à imager soit tournée vers l'agar. Par exemple, pour imager le changement de forme cellulaire.Lors de la formation des rangées, montez les embryons de manière à ce que leur face ventrale soit tournée vers l'agar. Retournez la lame munie de la colle à embryons et appuyez délicatement la traînée de colle contre les embryons situés sur le bloc d'agar. Retournez ensuite à nouveau la lame.La plupart des embryons doivent adhérer à la lame dans l'orientation appropriée. Ensuite, ajoutez deux couches de ruban adhésif double face de chaque côté des embryons. Recouvrez-les d'huile halo carbone 27 et appliquez une lamelle. Les embryons sont désormais prêts à être observés. Ces photos montrent une imagerie en time-lapse d'embryons cellulaires montés avec les côtés dorsal et ventral clairement visibles, et prises près de leur milieu. Pour suivre la membrane plasmique en coupe dans les images, l'embryon présenté ici exprime une sonde GFP-myosine II, qui s'accumule aux extrémités des invaginations de la membrane plasmique. Le suivi de l'entrée de ce front au fil du temps permet d'obtenir la vitesse à laquelle la membrane plasmique s'invagine ; le point zéro correspond au début de la cellularisation, peu après que le point temporel de 56 minutes, le gastrula commence sur le côté ventral de l'embryon.Ce film accéléré de cellules commencé lors du cycle mitotique précédent, 13, capture une pseudo-cytokinèse, une régression du sillon et se poursuit jusqu'à l'apparition de mouvements gastriques sur le côté ventral de l'embryon. Une fois maîtrisées, la préparation et l'acquisition d'images peuvent être réalisées en 60 à 90 minutes si elles sont effectuées correctement. Bien entendu, la collecte des embryons nécessite un temps supplémentaire et doit être coordonnée avec la préparation et l'acquisition d'images.Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de faire tout ce qui est possible pour préserver une bonne santé des embryons. Par exemple, ne pas sur-désinfecter les embryons et limiter leur exposition au laser lors de l'observation en microscopie après cette procédure. Des techniques d'imagerie plus sophistiquées, telles que le photoblanchiment et la commutation optique, peuvent être utilisées pour répondre à d'autres questions, comme : quelles sont les dynamiques du cytosquelette et des membranes associées à un changement de forme cellulaire donné ?

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