Name: Changement de forme dimagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Découvrez l'imagerie confocale en temps réel des changements de forme cellulaire dans les embryons de Drosophila melanogaster. Cette méthode permet d'observer la cellularisation et les dynamiques du développement embryonnaire.

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Nous remercions chaleureusement Eric Wieschaus, qui a fourni la base sur laquelle ce protocole a été développé. Notre travail est soutenu par un ministère Verna &amp; Marrs McLean, de Biochimie et Biologie Moléculaire Start-up Award, Baylor College of Medicine.

<ol><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).</li>
<li>Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).</li>
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<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131, 3021-3034 (2004).</li>
<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).</li>
<li>Lecuit, T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+insertion+of+new+membrane+from+a+cytoplasmic+reservoir+during+cleavage+of+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo.</a> J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).</li>
<li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+polarity+and+compartmentalization+are+established+before+cellularization+in+the+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo.</a> Dev Cell. 16, 93-104 (2009).</li>
<li>Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Actin+Dynamics+Facilitate+Early-Stage+Centrosome+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation.</a> Curr Biol. , (2010).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+actin-dependent+endocytosis+is+zygotically+controlled+to+initiate+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 14, 775-786 (2008).</li>
<li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abelson+kinase+%28Abl%29+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134, 567-578 (2007).</li>
<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457, 495-499 (2009).</li>
<li>Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+junction+remodelling+controls+planar+cell+intercalation+and+axis+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation.</a> Nature. 429, 667-671 (2004).</li>
<li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li>
<li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li>
<li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li>
<li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

Le protocole décrit aux présentes permettra de vivre, l&#39;imagerie confocale d&#39;un certain nombre de changements de forme cellulaire dans l&#39;embryon de mouche en développement. Stocks GFP pour l&#39;imagerie peut être préparé par un laboratoire individuel (tableau 2), mais beaucoup de ces stocks sont également accessibles au public à partir des centres tels que la drosophile Bloomington Stock Center à l&#39;Université d&#39;Indiana ( <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indian...

<table><tbody><tr><td>Lames</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Lames couvre-objets 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>Flacons pulvérisateurs (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Embouts pour pipettes, 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de scintillation avec bouchons</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Béchers Tri-Corn, 100 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de Petri BD Falcon 60x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulaire BD Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette jaunes</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>Maille en acier inoxydable, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre de 5&amp;#190; pouces</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre P4</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>Élastiques</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Scotch double face, &amp;frac12; pouce</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Brosses à peinture Robert Simmons Expression E85 ronde n°2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont n°5, haute précision en inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Huile de halocarbone 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>Héptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar BD Bacto</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Acide p-hydroxybenzoïque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Levure sèche active Red Star</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Serviettes en papier, pliées en C</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier d’aluminium extra fort</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jus de pomme 100 %</td><td>Ocean Spray ou Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie drosophile embryons

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Le développement de l&#39;embryon de Drosophila melanogaster subit un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont extrêmement sensibles à vivre l&#39;imagerie confocale. Les changements de forme cellulaire chez la mouche sont analogues à celles dans les organismes supérieurs, et ils conduisent la morphogenèse des tissus. Ainsi, dans de nombreux cas, leur étude a des implications directes pour la compréhension de la maladie humaine (tableau 1) 1-5. Sur l&#39;échelle sub-cellulaire, ces changements de forme des cellules sont le produit d&#39;activités allant de l&#39;expression génique au transduction du signal, la polarité cellulaire, le remodelage du cytosquelette et le trafic membranaire. Ainsi, l&#39;embryon de drosophile permet non seulement le contexte pour évaluer les changements de forme cellulaire comme ils se rapportent à la morphogenèse des tissus, mais offre également un environnement complètement physiologique pour étudier les activités sub-cellulaire que les cellules forme. Le protocole décrit ici est conçu à l&#39;image d&#39;un changement de cellule spécifique forme appelée cellularisation. Cellularisation est un processus de croissance de la membrane plasmique dramatique, et il convertit finalement l&#39;embryon syncytial dans le blastoderme cellulaire. C&#39;est, à l&#39;interphase du cycle mitotique 14, la membrane plasmique s&#39;invagine simultanément autour de chacun des noyaux ~ 6000 corticale ancré à générer une feuille de cellules épithéliales primaires. Contre les suggestions précédentes, cellularisation n&#39;est pas entraîné par la myosine-2 de la contractilité 6, mais est plutôt largement alimentée par exocytose de la membrane des magasins internes 7. Ainsi, cellularisation est un excellent système pour étudier le trafic membranaire pendant les changements de forme des cellules qui nécessitent une invagination membrane plasmique ou d&#39;expansion, comme la cytocinèse ou transversale-tubules (T-tubules) morphogenèse dans le muscle. Notez que ce protocole est facilement appliquée à l&#39;imagerie d&#39;autres changements de forme cellulaire dans l&#39;embryon de mouche, et ne nécessite que de légères adaptations telles que changer la scène de la collecte d&#39;embryons, ou en utilisant &quot;colle embryon&quot; pour monter l&#39;embryon dans une orientation spécifique (tableau 1) 8-19. Dans tous les cas, le workflow est fondamentalement le même (figure 1). Les méthodes standard pour le clonage et la transgénèse chez la drosophile sont utilisées pour préparer les stocks de mouche des étables qui expriment une protéine d&#39;intérêt, fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variantes, et ces mouches de fournir une source renouvelable d&#39;embryons. Alternativement, les protéines fluorescentes / sondes sont directement introduits dans des embryons volée via simples techniques de la micro-injection 9-10. Ensuite, selon l&#39;événement de développement et de changer de forme cellulaire à imager, les embryons sont collectés et mis en scène par la morphologie d&#39;un microscope à dissection, et enfin positionné et monté pour imagerie time-lapse sur un microscope confocal.

Le développement précoce de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est caractérisée par un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont bien adaptés pour des approches d&#39;imagerie. Cet article décrit les outils et méthodes de base nécessaires à l&#39;imagerie confocale direct d&#39;embryons de drosophile, et mettra l&#39;accent sur un changement de forme de la cellule appelée cellularisation.

Changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons

L'embryon de Drosophila melanogaster en développement subit un certain nombre de changements de morphologie cellulaire qui se prêtent particulièrement bien à l'imagerie confocale sur cellules vivantes. La forme des cellules...

L'objectif général de cette procédure est d'observer les changements de forme cellulaire dans des embryons de drosophile vivants. Cela est réalisé en premier lieu en générant et en élargissant des lignées de mouches transgéniques exprimant des sondes protéiques marquées par la GFP. La deuxième étape de la procédure consiste à transférer ces mouches dans des gobelets de collecte d'embryons.La troisième étape de la procédure consiste à collecter les embryons. La quatrième étape consiste à recouvrir et monter l'embryon. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les changements de forme cellulaire, tels que les cellules, par imagerie confocale en temps réel des embryons montés.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'imagerie de tissus fixés, réside dans la possibilité de capturer les aspects dynamiques des changements de forme cellulaire dans le contexte d'embryons vivants. Bien que la méthode décrite ici soit adaptée à la formation de l'œsophage, elle peut être modifiée et appliquée à d'autres changements de forme cellulaire accompagnant le développement précoce de la drosophile, tels que la formation du sillon vent

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