Déficits locomoteur Dosage, apprentissage et mémoire dans Drosophile Modèles de la neurodégénérescence

L'objectif général de la procédure est d'étudier l'apprentissage et la mémoire chez des adultes Esso Melan Gaster, en premier lieu pour déterminer si les mouches présentent des déficits locomoteurs. Elles sont testées dans l'essai de géotaxie négative. Le comportement phototactique positif est ensuite vérifié en plaçant les mouches dans un labyrinthe en T et en enregistrant la latence à se déplacer vers la chambre éclairée préférée.

Les mouches présentant une phototaxie positive sont ensuite conditionnées pour associer la chambre éclairée au goût amer de la quinine. Enfin, on évalue dans quelle mesure les mouches associent l’stimulus aversif à la chambre éclairée, ce qui fournit une mesure de l’apprentissage et de la mémoire. Ola, bienvenue dans le laboratoire X.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter deux tests comportementaux couramment utilisés pour étudier la neurodégénérescence chez Drosophila. Tout d'abord, nous vous montrerons le test de suppression de la phototaxie aversive, démontré par Wil Fredo Sala, un étudiant de licence dans notre laboratoire, et par moi-même, suivi du test de géotaxie négative, démontré par Kaiwan, un étudiant diplômé de notre laboratoire. Maintenez les mouches sur un milieu standard à base d'agar, de farine de maïs, de mélasse et de levure, à 25 °C, selon un cycle lumineux de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité.

Le jour de l'occlusion, trier les mouches vierges par groupes de 20. Les mouches vierges sont identifiables par leur couleur claire et une tache verdâtre foncée située sur la face inférieure de leur abdomen. Les mouches doivent être transférées dans un nouveau tube tous les trois jours, et des mouches sœurs doivent être utilisées afin de minimiser les différences liées aux fonds génétiques.

De 10 à 20 groupes par génotype ou traitement doivent être testés dans une étude de géotaxie. Commencez par trier les mouches femelles et mâles en groupes de 10. Ces mouches doivent être testées séparément.

Étant donné que le comportement est fortement influencé par le sexe, attendez au moins une heure après l'anesthésie avant de poursuivre, afin de vous assurer que l'activité locomotrice n'est pas altérée. Une fois que les mouches sont parfaitement préparées, alignez les ouvertures de deux flacons vides en polystyrène en les reliant verticalement sur le flacon inférieur.

À huit centimètres du fond, tracez un cercle autour de la circonférence. Une fois l'appareil assemblé, transférez un groupe de 10 mouches dans le flacon inférieur. Réunissez immédiatement les flacons et laissez les mouches s'acclimater pendant une minute avant le test.

Une fois que les mouches se sont calmées, tapez doucement sur le tube pour les faire descendre au fond, puis mesurez le nombre de mouches qui grimpent au-dessus de la marque de huit centimètres en 10 secondes. Le nombre de mouches par groupe ayant franchi cette marque est enregistré en pourcentage du nombre total de mouches. Répétez cette procédure 10 fois par groupe, en laissant les mouches se reposer une minute entre chaque essai.

Six heures avant un test PS, trier les mouches femelles dans des flacons en polystyrène contenant du papier filtre humidifié avec de l'eau. Cette étape garantit que les mouches sont privées de nourriture et plus sensibles au goût désagréable. Dans ce test, une solution de quinine sert de stimulus aversif.

Préparez une solution de travail d'un micromolaire à partir d'une solution mère de 0,1 molaire. Le labyrinthe en T se compose d'une colonne centrale munie d'une trappe et de deux compartiments latéraux : une chambre sombre et une chambre éclairée. Au repère de deux millimètres, utilisez une scie manuelle pour couper l'extrémité fermée de deux tubes en plastique de 15 millilitres, fixez des adaptateurs de raccordement à chaque extrémité et scellez les raccords avec du paraform.

Enveloppez un tube dans du papier d'aluminium pour constituer la chambre sombre. Assemblez les TMA en vissant les chambres éclairée et sombre de chaque côté de la colonne centrale. Avec la porte de piège au milieu fermée, terminez le montage en raccordant une source lumineuse directement à l'adaptateur de la chambre éclairée. Avant d'effectuer le test, transférez chaque mouche à partir d'un groupe de 10 individus dans un tube de centrifugation vide de 15 millilitres et fermez-le légèrement pour éviter toute évasion.

Ensuite, dévissez la chambre sombre des TAM. Transférez une mouche unique dans le tube et insérez-le immédiatement de nouveau dans le labyrinthe. Éteignez les lumières de la pièce et allumez une lampe rouge.

Laisser la mouche s'acclimater dans la chambre sombre pendant 30 secondes, puis allumer lentement la source lumineuse éclairant la chambre illuminée. Une fois la lumière allumée, ouvrir la trappe qui sépare les deux chambres. Si la mouche pénètre dans la chambre illuminée dans les 10 secondes, elle est considérée comme phototaxique positive et est prête à être entraînée.

Le fait de ne pas réagir de cette manière indique un problème au niveau du système visuel et impose l'exclusion de l'essai. Une fois que la phototaxie positive a été confirmée, tapez doucement sur la mouche pour la faire revenir dans la chambre sombre, fermez la porte piège et éteignez la lumière pendant une période de repos de 32 secondes. Préparez le stimulus aversif en plaçant le papier filtre dans la chambre éclairée et en pipetant un millilitre de solution de quinine sur le papier filtre.

S'assurer que tout le papier filtre soit complètement humide avec les stimuli aversifs. Pour commencer l'entraînement, ouvrez lentement la trappe et allumez la lumière. Laissez la mouche entrer dans la chambre éclairée parfumée à la quinine.

Après une minute, tapez doucement sur la mouche pour la faire revenir dans la chambre sombre. Répétez cette procédure neuf fois, pour un total de 10 essais de conditionnement. Généralement, chez les mouches de type sauvage, l'évitement de la chambre éclairée apparaît après trois à cinq essais d'entraînement, et persiste immédiatement après l'entraînement.

Effectuez cinq essais préliminaires. Si la mouche entraînée n'entre pas dans la lumière de la chambre dans les 10 secondes, cela est enregistré comme un succès. Le taux de réussite sur cinq essais consécutifs est enregistré et désigné.

PC zéro. Après l'entraînement et les enregistrements initiaux de PC zéro, chaque mouche est replacée dans son tube à nourriture numéroté d'origine et conservée pendant six heures. Six heures après l'entraînement, réalisez cinq essais supplémentaires comme indiqué précédemment ; ce taux de réussite représente le PC six et constitue une mesure de la mémoire à court terme.

Dans le test de géotaxie négative, le nombre de mouches franchissant la marque de huit centimètres est converti en pourcentage et présenté comme le taux de passage au test d'escalade. Sur 10 essais comme indiqué ici à droite, des mouches mâles ou femelles âgées de 10 jours et surexprimant la protéine humaine tau présentent des déficits locomoteurs significatifs par rapport aux mouches contrôles âgées de 10 jours surexprimant GFP, situées à gauche.

La performance dans le test de suppression de la phototaxie aversive est représentée par le taux de réussite moyen ou par le pourcentage d'essais d'évitement réussis. Sur l'ensemble des essais, les mouches surexprimant la protéine tau, représentées ici à droite, montrent une capacité réduite à associer la lumière à un goût amer par rapport au groupe témoin situé à gauche, aussi bien immédiatement après l'entraînement qu'au cours du test réalisé six heures plus tard. À la suite de cette procédure, des échantillons peuvent être prélevés afin d'effectuer une analyse immunohistochimique permettant de répondre à des questions supplémentaires concernant d'éventuelles différences morphologiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier l'apprentissage et la mémoire chez les mouches.

Et n'oubliez pas, tout repose sur vous.