Name: Déficits locomoteur Dosage, apprentissage et mémoire dans Drosophile Modèles de la neurodégénérescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Découvrez les tests comportementaux pour évaluer les fonctions locomotrices, l'apprentissage et la mémoire chez Drosophila melanogaster. Ces méthodes permettent d'étudier la neurodégénérescence et les bases génétiques des maladies.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Charles Luetje pour fournir le labyrinthe en T et la salle de comportement. Ce travail est soutenu par l&#39;American Heart Association (pour JA), l&#39;Institut national pour les troubles neurologiques et des maladies Grant R01NS64269 (au RGZ), et le Pew Charitable Trust (au RGZ).

1. Présentation Dans cette vidéo, nous allons démontrer deux tests comportementaux en utilisant la drosophile afin de démontrer la mesure de la locomotion et les fonctions d'apprentissage et de mémoire qui sont compromis dans les troubles neurodégénératifs. Tout d'abord, nous allons montrer comment le comportement locomoteur peut être mesurée en utilisant le dosage géotaxie négative. Deuxièmement, nous allons évaluer les capacités d'apprentissage et de mémoire en utilisant des mouches positivement phototactiques qui sont formés pour associer la lumière avec un goût amer et aversifs ensuite testé 6 heures plus tard pour évaluer les fonctions de mémoire. Enfin, nous allons discuter les implications et les limites de ces tests de comportement. 2. Équipements et de réactifs <ol><li> Fly travaux <ul><li> Champ stéréo (Zeiss) </li><li> Petits pinceaux pour pousser mouches </li><li> Drosophile dioxyde de carbone (CO 2) les appareils d'anesthésie (Geneseesci, Inc) </li></ul></li><li> Assay géotaxie négative <ul><li> 28,5 x 95 mm de polystyrène Vial (Capitol Vial, Inc) </li><li> Mini-alarme Minuteur / Chronomètre (VWR International) </li><li> Stylos Sharpie </li><li> Ruban adhésif </li></ul></li><li> Assay aversives répression phototaxie <ul><li> Chlorhydrate de quinine (Sigma Aldrich, numéro du CAS: 6119-47-7) </li><li> Eau distillée </li><li> Numérique échelle de mesure pour la dilution précise en poids </li><li> Connecteurs rapide Débranchez, polyéthylène haute densité (NALGENE VWR Catalog No. 62868-021) </li><li> Tube de 15 ml à centrifuger (VWR International), coupé à la marque de 2 ml d'extrémité fermée pour s'adapter à l'adaptateur Débrancher le connecteur rapide pour source de lumière </li><li> Monocanal 200 uL pipetteur pour charger solution de quinine sur un papier filtre tapissant la chambre de </li><li> T-Maze (Simple systèmes comportementaux; Figure 1) </li><li> Aluminium Foil </li><li> Source de lumière (Zeiss) </li><li> Une lampe avec une lumière rouge. </li><li> Papier filtre </li><li> Mini-alarme Minuteur / Chronomètre (VWR International) </li></ul></li></ol> 3. Préparation des Mouches <ul><li> Les mouches sont maintenues sur la norme de farine de maïs-agar-mélasse-levure à 25 ° C sur une période de 12 h cycle lumière / obscurité. </li><li> Virgin vole sont isolés sous anesthésie dioxyde de carbone sur le jour de l'éclosion. Pour les études de vieillissement, les mouches sont maintenus dans des groupes de vingt par flacon et transféré dans un flacon frais tous les 3 jours. Il est important d'utiliser des mouches fratrie du même croisement des parents pour les études de vieillissement, de minimiser les différences résultant de fonds génétiques. </li><li> Pour les deux essais, les mouches sont sexuées et maintenus en groupes de dix mouches par flacon. La différence entre les sexes sur le comportement est significatif et il est conseillé de ne pas mélanger les mouches mâles et femelles dans une étude que les données peuvent être difficiles à interpréter et à reproduire 6. </li><li> Pour le dosage géotaxie négative, les mouches sont triés en groupes de dix par flacon et testé une heure après l'anesthésie. Il est important pour les mouches se remettre complètement de l'anesthésie, car cela pourrait avoir un effet sur les activités de locomotion. </li><li> Pour le dosage APS, les mouches de chaque groupe sont placés dans un flacon en polystyrène vides avec de l'eau du papier filtre imbibé pendant six heures avant le dosage est effectué. Cela garantit que les mouches sont affamés avant le dosage et sera plus perspicace au goût aversif. Juste avant le dosage est effectué, chaque volée à partir d'un groupe de dix est placé dans un tube à centrifuger de 15 ml vide, qui est alors plafonnée lâchement, pour éviter de s'échapper. </li></ul> 4. Assay géotaxie négative <ul><li> Géotaxie est généralement mesurée pendant dix à vingt groupes de dix individus de même génotype ou de traitement (100-200 mouches total pour chaque génotype / traitement) 7. Trier des groupes de dix mouches féminine ou masculine sur un appareil d'anesthésie CO 2 et le lieu de chaque groupe dans un flacon séparé. Prévoyez au moins une heure pour les mouches pour se remettre de l'anesthésie. </li><li> Préparez l'appareil d'escalade pour chaque groupe, de telle sorte que deux flacons vides en polystyrène sont verticalement rejoint par la bande en face de l'autre. Il est important de s'assurer que les ouvertures des flacons sont parfaitement alignés les uns avec les autres pour offrir une surface plane d'escalade pour les mouches. </li><li> Pour le bas du flacon, de mesurer une distance verticale de 8 cm au-dessus de la surface du fond et de marquer chaque flacon en traçant un cercle autour de la circonférence de la fiole. </li><li> Transfert d'un groupe de dix mouches dans le bas du flacon soigneusement pour empêcher la fuite de toute volée. Recouvrir immédiatement le bas flacon avec le flacon de bandes en haut et en toute sécurité à proximité des ouvertures de contact. Autoriser les mouches de s'acclimater à la nouvelle configuration pendant 1 minute avant d'effectuer le dosage. </li><li> Tapoter doucement la vole vers le bas du flacon et de mesurer le nombre de mouches qui peuvent grimper dessus de la barre de 8 cm par 10 secondes après le robinet. </li><li> Répétez ce test pour le même groupe de dix fois, permettant une période de repos entre chaque minute d'essai. </li><li> Notez le nombre de mouches par groupe qui a franchi la barre de 8 cm comme unpourcentage de mouches total. </li></ul> 5. Assay aversives répression phototaxie (APS Assay) Originaire adapté du Bourg et Buecher (2002) 4, ce test exploite le comportement positif dans phototactiques mouches pour les former à associer la lumière avec des stimuli aversifs (dans ce cas, le goût amer de la quinine). Après une phase de formation / le conditionnement, les mouches de type sauvage sera capable d'associer la zone éclairée avec goût aversif et l'éviter. Les mouches avec des capacités d'apprentissage compromis ne parviendra pas à faire de cette association. Par ailleurs, le dosage APS peuvent également être utilisés pour mesurer la fonction de mémoire courte durée de mouches 5 en soumettant déjà mouches formés pour le même test de conditionnement 6 heures après pour tester leur capacité à se souvenir des tâches apprises. <ol><li> Préparation de la solution de quinine <ul><li> Dissoudre le chlorhydrate de quinine dans l'eau distillée pour obtenir une solution stock de 0,1 M (1.98g dans 50 ml d'eau distillée). La solution stock peut être conservé à -20 ° C jusqu'à un an dans de petites aliquotes </li><li> Préparer une solution de travail de 1 uM en diluant la solution stock dans de l'eau distillée. </li></ul></li><li> Préparation de la T-Maze <ul><li> Labyrinthe en T se compose de la colonne du centre avec la trappe et deux chambres indépendantes, une "sombre" de chambre et un "allumé" chambre (figure 1). </li><li> Préparation de la Chambre: prendre deux tubes à centrifuger de 15 ml en plastique et couper à 2 mL de la marque en bas à bout fermé avec une scie manuelle. Monter les adaptateurs à chaque extrémité, et scelle le lien avec du parafilm. L'adaptateur à l'extrémité du tube sert la fente d'entrée pour la source de lumière à col de cygne. Connectez un tube avec la source de lumière et de ce tube sera le "éclairés" de chambre. Enveloppez l'autre tube de papier d'aluminium pour servir de "sombre" de chambre. </li><li> Ajouter 180uL soit de l'eau distillée ou une solution de quinine à filtre en papier et les placer dans la chambre de lumière. </li><li> Assemblez le labyrinthe en T, par vissage des chambres lumineuses et sombres de chaque côté de la colonne du centre, avec la trappe dans le milieu fermé (figure 1). </li><li> Insérez la source de lumière dans la chambre éclairée. </li></ul></li><li> Formation des mouches pour supprimer phototaxie avec des stimuli aversifs <ul><li> Dévissez la chambre noire du labyrinthe en T et de transférer une seule mouche dans cette chambre et immédiatement visser le tube noir vers le labyrinthe. </li><li> Éteignez les lumières dans la pièce et allumer la lampe rouge. </li><li> Autoriser la volée de s'acclimater dans la chambre noire pendant 30 secondes et tourner lentement sur la source lumineuse éclairant la chambre éclairée. Lentement ouvrir la trappe qui sépare les deux chambres. </li><li> Si la mouche se dirige vers la chambre allumée pendant 10 secondes, il est considéré positivement phototactiques et est prêt à être formés pour le dosage. Le défaut de phototaxie indique des problèmes dans le système visuel et les mouches avec du phototaxie négatives doivent être exclus de l'analyse. </li><li> Pour aversives répression phototaxie (APS) de formation, appuyez sur la mouche qui a démontré phototaxie positifs à la chambre noire, près de la trappe et éteignez la lumière. Attendre 30 secondes d'acclimatation. Pendant ce temps, placez le papier filtre avec une solution de quinine dans la chambre éclairée. Lentement ouvrir la trappe et allumez la lumière. Autoriser la marche voler dans la chambre éclairée la quinine couché. Après une minute, appuyez sur le vol de retour à la chambre noire et répétez cette 9 fois plus. (En général, éviter les mouches de type sauvage de la chambre allumée après 3 à 5 essais de formation.) </li><li> Immédiatement après la formation, cinq essais de test sera effectué. Dans chaque essai essai, attendez 10 secondes après la lumière est allumée pour la mouche entraînés à marcher dans la chambre éclairée. Le défaut de marcher sur le flacon allumée sera enregistré comme «Pass», qui est équivalent à «tâche appris par renforcement». Le taux de réussite au cours des cinq essais consécutifs est enregistré et montré dans la figure 2 ci-dessous que PC0 (0 conditionné après h). </li></ul></li><li> Évaluation de la fonction mémoire à court terme chez des mouches <ul><li> Après une formation initiale et PC0 enregistrements, chaque mouche est replacé dans son flacon d'origine et l'alimentation tenu à l'écart pendant six heures. </li><li> Six heures après la formation, sous réserve de chaque mouche à 5 essais à nouveau de la même manière que précédemment, et d'enregistrer le nombre de fois à la volée évite (passe) ou va dans (échec) le flacon éclairée. Ce taux de réussite est enregistré comme PC6 (6 heures après le conditionnement), qui est un indicateur de la mémoire à court terme. </li></ul></li></ol> 6. Interprétation et analyse des données statistiques <ol><li> Assay géotaxie négative <ul><li> Les données brutes générées par ce test représente le nombre de mouches traversant la marque de 8 cm en 10 secondes dans chaque groupe. Convertis cette proportion et de calculer le taux de réussite moyen pour chaque groupe de plus de 10 séances. </li><li> Les données sont représentées graphiquement comme un taux de réussite moyen par groupe (génotype, traitement, etc) avec l'erreur-type de la moyenne (SEM). </li><li> Différences entre les groupespeut alors être déterminée pour être statistiquement significatif ou non en utilisant un test t de Student ou l'ANOVA. </li></ul></li><li> Assay aversives répression phototaxie <ul><li> Les données brutes de ce test est représenté comme le nombre de fois chaque mouche évite la chambre allumée dans cinq essais successifs. Le taux de réussite est calculé comme le pourcentage d'essais d'évitement succès au cours des essais au total. Calculer le taux de réussite moyen de cette manière pendant un minimum de 15 mouches par groupe. </li><li> Les données sont représentées graphiquement comme taux de réussite moyen PC0 (immédiatement après le conditionnement; «apprentissage» d'indicateur) ou taux de réussite moyen PC6 (6 heures après conditionnement; «mémoire» témoin) avec MEB respectif. </li><li> Indices d'apprentissage et la mémoire sont comparés entre les groupes à la fois avec le type sauvage et «génétiquement manipulé-bénigne" du groupe (tels que la GFP surexprimant d'oiseau) de manière appropriée. </li></ul></li></ol> 7. Les résultats représentatifs Dans cette expérience, la vidéo, nous évaluons les déficits d'apprentissage et la mémoire et le moteur de mouches surexprimant Tau humaines dans le système nerveux central et en comparant leurs performances à celles des mouches surexprimant GFP. Surexpression de Tau neuronales humaines chez la drosophile a été montré pour causer de graves vacuolisation dans le cerveau 8 et conduire à des déficits importants dans l'apprentissage et des fonctions de mémoire 9. Comme le montre la figure 2A, 10 jours vieux mâle ou femelle vole surexprimant humaine Tau ont des déficits locomoteurs significative par rapport à appariés selon l'âge surexprimant GFP mouches. En outre, ces mouches échoué à associer la lumière avec un goût amer comme le montrent les taux de réussite par rapport PC0 au groupe de contrôle, ainsi que ne pas se rappeler de cette association, comme indiqué par une baisse des taux de réussite PC6 (figure 2B). Cette expérience confirme en outre que les modèles drosophiles peuvent être utilisées pour étudier les humains des maladies neurodégénératives et récapitulant certains des phénotypes comportementaux observés chez les humains et les mammifères. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. T-Maze Configuration pour Assay aversives répression phototaxie. A. La configuration globale expérimentale pour l'expérience APSA avec la source lumineuse reliée au "éclairés" tube falcon, de papier-filtre et le "sombre" du tube sur la gauche (couvert en fleuret), séparés par une trappe. B. Pendant la phase d'entraînement et d'essai, la mouche est dans la chambre noire et la trappe s'est ouverte après la lumière est allumée dans la chambre éclairée. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Les résultats représentatifs de la géotaxie négative et d'expérimenter l'APS en utilisant des mouches surexprimant GFP ou Tau avec un pilote pan-neuronale. A. Dans le dosage géotaxie négative, 10 jours anciens de sexe masculin (colonne bleue) ou femelle (colonne rouge) vole surexprimant GFP a montré une plus grande activité d'escalade que de Tau-surexprimant mouches. B. de 20 jours féminine ancienne mouches surexprimant GFP a montré un meilleur apprentissage (PC0) et mémoire (PC6) de fonctions que Tau surexprimant mouches.

<ol><li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Lloyd, T. E. &amp, Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Le Bourg, E., Buecher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learned+suppression+of+photopositive+tendencies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Learning+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster.</a> Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).</li>
<li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aversive+phototaxic+suppression%3A+evaluation+of+a+short-term+memory+assay+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster.</a> Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).</li>
<li>Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-selective+patterns+of+aggressive+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).</li>
<li>Leal, S. M., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+for+GABAergic+regulation+of+specific+behaviors+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).</li>
<li>Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+Neurodegeneration+Without+Neurofibrillary+Tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+deficits+upon+TAU+accumulation+in+Drosophila+mushroom+body+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons.</a> Learn Mem. 11, 277-287 (2004).</li>
<li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+Suppression+Involving+Behavioral+Mutants+with+Altered+Nerve+Excitability+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 100, 597-614 (1982).</li>
<li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+mutants+in+Drosophila+and+their+effects+on+the+structure+and+function+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system.</a> J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).</li>
</ol>

Les deux géotaxie négatifs et des dosages de l&#39;APS sont robustes tests comportementaux pour mesurer l&#39;évolution de locomotion ou d&#39;apprentissage et les capacités de mémoire résultant de manipulations génétiques ou environnementaux. Cependant, il ya quelques inconvénients à ces épreuves qui attendent une optimisation plus poussée. En test géotaxie négative, des mutations dans certains gènes peuvent rendre dysfonctionnements moteurs sévères chez les mouches. Dans de tels cas, les mouches peuvent difficilement escalader les murs en réponse à la gravité sur l&#39;agitation. Autre comportement des dosages qui mesurent directement le mouvement peut être plus approprié. Ces tests comprennent comportement réflexe de redressement que les mesures de la paralysie et la saisie de 10, et le comportement optomoteur 11 qui enregistre une perte de coordination des mouvements. En test APS, le premier obstacle peut être vole au hasard s&#39;arrêter à l&#39;entrée de la chambre allumée sans avancer. Cela devient plus problématique si le vieillissement est l&#39;une des conditions étudiées, puisque plus des mouches sont moins actifs en général et ont tendance à s&#39;arrêter et se reposer pendant de longues périodes de temps. Dans ce cas, l&#39;expérimentateur doit fournir des stimuli mécaniques pour promouvoir le mouvement, qui n&#39;est pas toujours efficace. Deuxièmement, on pourrait soutenir que l&#39;échec pour aller à la chambre de résultats éclairée par une perte de phototaxie positif. Ce qui est rarement le cas, puisque les travaux antérieurs ont montré que les mouches retourner à la lumière une fois la réactivité négative est enlevée renforcent 4. Troisièmement, la durée de contact avec le stimulus aversif peuvent varier d&#39;un essai à. Cette variation peut généralement être réduite en encerclant la paroi intérieure de la chambre avec un papier filtre imprégné d&#39;empêcher les mouches de se soustraire à la quinine. En outre, l&#39;expérimentateur peut garantir que chaque volée passer assez de temps en contact avec le papier filtre en augmentant la quantité de temps passé dans la chambre de l&#39;indication contraire 1 minute. En résumé, géotaxie négatifs et des dosages de l&#39;APS sont des moyens simples et rapides d&#39;évaluation des déficits comportementaux et quantitativement indiquent locomoteur et de l&#39;apprentissage et les capacités de mémoire chez la drosophile. Ces tests sont particulièrement utiles dans la modélisation des maladies neurodégénératives humaines chez la drosophile.

<table border="1"><tbody><tr><th> Matériaux </th><th> Société </th><th> Nombre de catalogue </th><th> Commentaire </th></tr><tr><td> Flacon en polystyrène </td><td> Vial Capitole, Inc </td><td> 28Fly </td><td> 28,5 x 95 mm de polystyrène Vial, la qualité des documents importants, mauvaise si elle est trop glissante pour les mouches de grimper. </td></tr><tr><td> Dissection Stéréoscope </td><td> Zeiss </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2 Guide des branches de lumière en col de cygne (12V/30W) </td></tr><tr><td> Chlorhydrate de quinine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6119-47-7 </td><td> Dissoudre dans l&#39;eau distillée. </td></tr><tr><td> Connecteurs rapide Débranchez </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> Polyéthylène haute densité </td></tr><tr><td> T-Maze </td><td> Simple systèmes comportementaux </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monocanal 200 pipettes uL </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

déficits locomoteur dosage, apprentissage et mémoire dans drosophile modèles de la neurodégénérescence

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Les progrès dans les méthodes génétiques ont permis l&#39;étude de gènes impliqués dans des maladies neurodégénératives humaines en utilisant la drosophile comme système modèle 1. La plupart de ces maladies, y compris la maladie d&#39;Alzheimer, de Parkinson et la maladie de Huntington sont caractérisées par l&#39;âge-dépendant détérioration des fonctions d&#39;apprentissage et de mémoire et 2 la coordination des mouvements. Ici, nous utilisons des tests de comportement, y compris le dosage géotaxie négative 3 et le dosage aversifs de suppression phototaxic (APS test) 4,5, pour montrer que certaines des caractéristiques de comportement liés à une neurodégénérescence humaine peut être récapitulée dans mouches. Dans le dosage géotaxie négative, la tendance naturelle des mouches de se déplacer contre la gravité lorsqu&#39;il est agité est utilisé pour étudier les gènes ou les conditions qui peuvent entraver les capacités locomotrices. Dans le dosage de l&#39;APS, les fonctions d&#39;apprentissage et de mémoire sont testés dans positivement phototactiques mouches formés à associer la lumière avec aversifs goût amer et donc éviter cette tendance naturelle de se déplacer autrement, vers la lumière. Tester ces mouches formé 6 heures post-formation est utilisée pour évaluer les fonctions de mémoire. L&#39;utilisation de ces tests, la contribution de tous les facteurs génétiques ou environnementaux vers la neurodégénérescence développement peuvent être facilement étudiées chez les mouches.

Comportement des dosages pour mesurer des fonctions locomotrices, l&#39;apprentissage et les capacités de mémoire<em&gt; Drosophile</em&gt;.

Déficits locomoteur Dosage, apprentissage et mémoire dans Drosophile Modèles de la neurodégénérescence

Les progrès des méthodes génétiques ont permis l'étude de gènes impliqués dans les maladies neurodégénératives humaines en utilisant Drosophila comme système modèle1. La plupart de...

L'objectif général de la procédure est d'étudier l'apprentissage et la mémoire chez des adultes Esso Melan Gaster, en premier lieu pour déterminer si les mouches présentent des déficits locomoteurs. Elles sont testées dans l'essai de géotaxie négative. Le comportement phototactique positif est ensuite vérifié en plaçant les mouches dans un labyrinthe en T et en enregistrant la latence à se déplacer vers la chambre éclairée préférée.Les mouches présentant une phototaxie positive sont ensuite conditionnées pour associer la chambre éclairée au goût amer de la quinine. Enfin, on évalue dans quelle mesure les mouches associent l’stimulus aversif à la chambre éclairée, ce qui fournit une mesure de l’apprentissage et de la mémoire. Ola, bienvenue dans le laboratoire X.Aujourd'hui, nous allons vous présenter deux tests comportementaux couramment utilisés pour étudier la neurodégénérescence chez Drosophila. Tout d'abord, nous vous montrerons le test de suppression de la phototaxie aversive, démontré par Wil Fredo Sala, un étudiant de licence dans notre laboratoire, et par moi-même, suivi du test de géotaxie négative, démontré par Kaiwan, un étudiant diplômé de notre laboratoire. Maintenez les mouches sur un milieu standard à base d'agar, de farine de maïs, de mélasse et de levure, à 25 °C, selon un cycle lumineux de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité.Le jour de l'occlusion, trier les mouches vierges par groupes de 20. Les mouches vierges sont identifiables par leur couleur claire et une tache verdâtre foncée située sur la face inférieure de leur abdomen. Les mouches doivent être transférées dans un nouveau tube tous les trois jours, et des mouches sœurs doivent être utilisées afin de minimiser les différences liées aux fonds génétiques.De 10 à 20 groupes par génotype ou traitement doivent être testés dans une étude de géotaxie. Commencez par trier les mouches femelles et mâles en groupes de 10. Ces mouches doivent être testées séparément.Étant donné que le comportement est fortement influencé par le sexe, attendez au moins une heure après l'anesthésie avant de poursuivre, afin de vous assurer que l'activité locomotrice n'est pas altérée. Une fois que les mouches sont parfaitement préparées, alignez les ouvertures de deux flacons vides en polystyrène en les reliant verticalement sur le flacon inférieur.À huit centimètres du fond, tracez un cercle autour de la circonférence. Une fois l'appareil assemblé, transférez un groupe de 10 mouches dans le flacon inférieur. Réunissez immédiatement les flacons et laissez les mouches s'acclimater pendant une minute avant le test.Une fois que les mouches se sont calmées, tapez doucement sur le tube pour les faire descendre au fond, puis mesurez le nombre de mouches qui grimpent au-dessus de la marque de huit centimètres en 10 secondes. Le nombre de mouches par groupe ayant franchi cette marque est enregistré en pourcentage du nombre total de mouches. Répétez cette procédure 10 fois par groupe, en laissant les mouches se reposer une minute entre chaque essai.Six heures avant un test PS, trier les mouches femelles dans des flacons en polystyrène contenant du papier filtre humidifié avec de l'eau. Cette étape garantit que les mouches sont privées de nourriture et plus sensibles au goût désagréable. Dans ce test, une solution de quinine sert de stimulus aversif.Préparez une solution de travail d'un micromolaire à partir d'une solution mère de 0,1 molaire. Le labyrinthe en T se compose d'une colonne centrale munie d'une trappe et de deux compartiments latéraux : une chambre sombre et une chambre éclairée. Au repère de deux millimètres, utilisez une scie manuelle pour couper l'extrémité fermée de deux tubes en plastique de 15 millilitres, fixez des adaptateurs de raccordement à chaque extrémité et scellez les raccords avec du paraform.Enveloppez un tube dans du papier d'aluminium pour constituer la chambre sombre. Assemblez les TMA en vissant les chambres éclairée et sombre de chaque côté de la colonne centrale. Avec la porte de piège au milieu fermée, terminez le montage en raccordant une source lumineuse directement à l'adaptateur de la chambre éclairée. Avant d'effectuer le test, transférez chaque mouche à partir d'un groupe de 10 individus dans un tube de centrifugation vide de 15 millilitres et fermez-le légèrement pour éviter toute évasion.Ensuite, dévissez la chambre sombre des TAM. Transférez une mouche unique dans le tube et insérez-le immédiatement de nouveau dans le labyrinthe. Éteignez les lumières de la pièce et allumez une lampe rouge.Laisser la mouche s'acclimater dans la chambre sombre pendant 30 secondes, puis allumer lentement la source lumineuse éclairant la chambre illuminée. Une fois la lumière allumée, ouvrir la trappe qui sépare les deux chambres. Si la mouche pénètre dans la chambre illuminée dans les 10 secondes, elle est considérée comme phototaxique positive et est prête à être entraînée.Le fait de ne pas réagir de cette manière indique un problème au niveau du système visuel et impose l'exclusion de l'essai. Une fois que la phototaxie positive a été confirmée, tapez doucement sur la mouche pour la faire revenir dans la chambre sombre, fermez la porte piège et éteignez la lumière pendant une période de repos de 32 secondes. Préparez le stimulus aversif en plaçant le papier filtre dans la chambre éclairée et en pipetant un millilitre de solution de quinine sur le papier filtre.S'assurer que tout le papier filtre soit complètement humide avec les stimuli aversifs. Pour commencer l'entraînement, ouvrez lentement la trappe et allumez la lumière. Laissez la mouche entrer dans la chambre éclairée parfumée à la quinine.Après une minute, tapez doucement sur la mouche pour la faire revenir dans la chambre sombre. Répétez cette procédure neuf fois, pour un total de 10 essais de conditionnement. Généralement, chez les mouches de type sauvage, l'évitement de la chambre éclairée apparaît après trois à cinq essais d'entraînement, et persiste immédiatement après l'entraînement.Effectuez cinq essais préliminaires. Si la mouche entraînée n'entre pas dans la lumière de la chambre dans les 10 secondes, cela est enregistré comme un succès. Le taux de réussite sur cinq essais consécutifs est enregistré et désigné.PC zéro. Après l'entraînement et les enregistrements initiaux de PC zéro, chaque mouche est replacée dans son tube à nourriture numéroté d'origine et conservée pendant six heures. Six heures après l'entraînement, réalisez cinq essais supplémentaires comme indiqué précédemment ; ce taux de réussite représente le PC six et constitue une mesure de la mémoire à court terme.Dans le test de géotaxie négative, le nombre de mouches franchissant la marque de huit centimètres est converti en pourcentage et présenté comme le taux de passage au test d'escalade. Sur 10 essais comme indiqué ici à droite, des mouches mâles ou femelles âgées de 10 jours et surexprimant la protéine humaine tau présentent des déficits locomoteurs significatifs par rapport aux mouches contrôles âgées de 10 jours surexprimant GFP, situées à gauche.La performance dans le test de suppression de la phototaxie aversive est représentée par le taux de réussite moyen ou par le pourcentage d'essais d'évitement réussis. Sur l'ensemble des essais, les mouches surexprimant la protéine tau, représentées ici à droite, montrent une capacité réduite à associer la lumière à un goût amer par rapport au groupe témoin situé à gauche, aussi bien immédiatement après l'entraînement qu'au cours du test réalisé six heures plus tard. À la suite de cette procédure, des échantillons peuvent être prélevés afin d'effectuer une analyse immunohistochimique permettant de répondre à des questions supplémentaires concernant d'éventuelles différences morphologiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier l'apprentissage et la mémoire chez les mouches.Et n'oubliez pas, tout repose sur vous.

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