Name: Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel de la translocation de la PKC dans les neurones sensoriels d'Aplysia et les cellules Sf9. Cette méthode par microscopie confocale permet d'étudier la régulation différentielle des isoformes de PKC par les seconds messagers.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) Subvention à Wayne S. Sossin. Carole A. Farah est le récipiendaire d&#39;une bourse postdoctorale du Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) et un Conrad Harrington bourse. Les auteurs tiennent à remercier Joanna Bougie, Margaret Hastings et Margaret Labban de l&#39;aide pour le tournage vidéo et Madeline Richmond Piscine pour aider à la présentation graphique.

1. Préparation et entretien des cultures monocouche cellulaire Sf9 <ol><li> Sf9 culture cellulaire et de la maintenance est effectuée sous une hotte de culture de tissus. </li><li> Les cellules Sf9 sont dérivées de cellules de Spodoptera frugiperda l&#39;ovaire (cellules Sf21) et peut être acheté comme cellules congelées dans les médias Grace chez Invitrogen. </li><li> Placer 8 ml de milieu d&#39;insectes de Grace, complétées (1X), à laquelle 30% de sérum bovin fœtal (FBS) a été ajoutée dans un flacon de 75 cm2 de culture cellulaire avec un col incliné. </li><li> Décongelez le tube congelé des cellules Sf9 rapidement dans un bain à 37 ° C eau en déplaçant le tube avant et en arrière (environ 1-2 minutes). </li><li> Transfert des cellules Sf9 aux 75 cm 2 flacon de culture cellulaire et la plaque de pierre doucement par la main pour distribuer les cellules uniformément. </li><li> Incuber 1-2 heures à 27 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules ont attaché. </li><li> Retirer ancien milieu et la remplacer par 10 ml de milieu d&#39;insectes freshGrace avec 30% de FBS. </li><li> Incuber à 27 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules sont confluentes. </li><li> Pour maintenir les cultures en monocouche, retirez ancien milieu du ballon confluentes de cellules Sf9 et ajouter 5 ml de milieu de Grace insectes avec 10% de FBS. </li><li> Frapper légèrement sur le côté du flacon à plusieurs reprises de se détacher des cellules Sf9. </li><li> En utilisant une pipette de 10 ml et une pipette, une pipette les médias de haut en bas une fois de douceur, la pulvérisation murale flacon lors du pipetage vers le bas. Transférer les cellules à un tube de 15 ml stériles en polystyrène. </li><li> Ajouter 2 mL de suspension cellulaire Sf9 à 8 ml de milieu de Grace insectes avec du FBS à 10% (dilution 1:05 de maintenir la phase de croissance logarithmique) dans de nouvelles de 75 cm 2 flacon de culture cellulaire et la plaque de pierre doucement par la main. </li><li> Incuber à 27 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules sont confluentes. </li></ol> 2. Expression des PKC par fluorescence Taggé dans des cellules Sf9 <ol><li> Pour vivre l&#39;expérience d&#39;imagerie, la culture des cellules Sf9 en 35 mm MatTek disheswith à fond de verre de la culture d&#39;une surface de verre de 14 mm et une épaisseur de lamelle de 0,16 à 0,19 mm. </li><li> PKC taggés avec des protéines fluorescentes sont exprimés dans des cellules Sf9 en utilisant Cellfectin recommandation II réactif de transfection suivants du constructeur avec les modifications détaillées ci-dessous. </li><li> Jour 1: Avant de plaquer les cellules, traitent chaque plat avec un milieu de MatTek insectes de Grace avec du FBS à 10% pendant au moins 30 minutes. </li><li> Comptez cellules Sf9 de l&#39;étape 11 (ci-dessus) en utilisant un hématimètre. </li><li> Plate 0,05 x 10 6 cellules sur chaque lamelle de verre de MatTek dans un volume total de 150 pi. Laisser les cellules se fixer pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 2 mL de Grace complété avec 10% de FBS à chaque plat une mL à la fois lentement pour éviter de détacher les cellules. </li><li> Incuber à 27 ° C pendant la nuit. </li><li> De ce point, utilisez les recommandations du fabricant pour la transfection de cellules Sf9 avec l&#39;ADN plasmidique. </li><li> Jour 2: Transfecter cellules Sf9 avec PKC fluorescence marqués en utilisant le réactif de transfection Cellfectin II. Nous avons souvent co-exprimées dans ce système PKC tagués avec améliorée Green Fluorescent Protein (eGFP) et monomères protéine fluorescente rouge (RDRF) (détails pour la construction du plasmide ont été décrits précédemment 2,5). Expression d&#39;une protéine fluorescente à un moment rendements d&#39;environ 70-80% de cellules exprimant 72 heures post-transfection. La co-expression de deux protéines fluorescentes diminue l&#39;efficacité de transfection à environ 30% de co-expression de cellules. Lorsque co-exprimant eGFP-taggés PKC et RDRF marqués à la PKC, utiliser plus d&#39;ADN plasmidique 2x pour la protéine RDRF-marqués pour l&#39;expression protéique optimal. </li><li> Jouez en live-imagerie 48-72 heures post-transfection (pour l&#39;expression protéique optimal, attendez 72 heures). </li></ol> 3. Expression des PKC par fluorescence Tagged dans les neurones sensoriels aplysie <ol><li> Préparation des cultures de cellules neuronales aplysie a été décrit dans un article de la vidéo par Zhao et 4 collègues. </li><li> PKC taggés avec des protéines fluorescentes sont exprimés dans les neurones sensoriels aplysie en utilisant la procédure détaillée ci-dessous la microinjection. </li><li> Préparer une solution stock de 1% Fast Green (FCF) dans l&#39;eau distillée, filtrer à l&#39;aide d&#39;une seringue et une seringue de 28 mm de filtre (0,20 m). Aliquoter et conserver à -20 ° C. </li><li> Microinjection des neurones sensoriels peuvent être effectuées le jour 1 ou 2 jours après avoir isolé les neurones, mais nous constatons que deux jours d&#39;attente permet de mieux l&#39;adhérence cellulaire à la lamelle. </li><li> Le jour 2, après l&#39;isolement des neurones sensoriels, décongeler une aliquote de vert rapide et filtrer à nouveau en utilisant une seringue et un 28 mm filtre seringue (0,20 m). </li><li> Préparer une solution d&#39;ADN plasmidique dans l&#39;eau distillée contenant 0,5% de vert rapide. Les concentrations d&#39;ADN plasmidique aussi élevées que 0,4 ug / uL peut être utilisé mais il est recommandé de ne pas aller au-dessus de ces valeurs. </li><li> Filtre de l&#39;ADN plasmidique / Fast solution verte en utilisant une seringue de 1 mL et de 4 mm filtre seringue (0,20 m). </li><li> Centrifuger l&#39;ADN plasmidique / Fast solution verte à 16110 xg pendant 15 minutes à l&#39;aide d&#39;un microrocentrifuge. </li><li> Préparer électrodes forte pour la microinjection de neurones aide d&#39;un extracteur de microélectrodes (Sutter Flaming / Brown Micropipette Puller, modèle P-97). En utilisant un filament de la boîte, tirez microélectrodes en verre avec 1 mm de diamètre extérieur, 0,75 mm de diamètre intérieur et 100 mm de longueur à l&#39;aide à paroi mince de verre capillaires avec un filament à l&#39;intérieur (World Precision Instruments TW100F-4). Pour plus d&#39;informations sur des électrodes en tirant microinjection s&#39;il vous plaît se référer à l&#39;électrode livre Sutter. </li><li> Remplissez chaque électrode avec 2 pi d&#39;ADN plasmidique / Fast solution verte en utilisant microloader pointe de la pipette (Eppendorf CA32950-050). </li><li> Transfert du verre plat en bas de MatTek culture contenant des cultures de neurones aplysie à la station de microinjection. </li><li> La station de microinjection compose des éléments suivants: une maison étape de grand verre de tenir les boîtes de culture sur une table anti-vibrations (Kinetic Systems poste de travail anti-vibrations), une stéréo-portée avec éclairage halogène externe, un micromanipulateur (Sutter Huxley Micromanipulateur type mur qui permet un positionnement à la fois grossier et ultra-fines dans les trois axes), un porte-microélectrode reliée à une pompe pneumatique (instruments de précision mondiale PV820 pneumatique Pico-pompe). L&#39;entrée de pression de la pompe pneumatique est relié à un réservoir d&#39;azote comprimé. </li><li> Insérer une microélectrode dans le support de microélectrodes. </li><li> Voir sous un stéréomicroscope, insérez la pointe de la micropipette dans le noyau cellulaire. </li><li> Délivrer des impulsions de pression courte de l&#39;azote (10 à 100 ms en durée, 20 lb / po 2) jusqu&#39;à ce que le noyau devient uniformément vert. </li><li> Incuber les cellules pendant 4 heures à température ambiante et de garder à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Pour la translocation de PKC optimale, en live-imagerie expérience de 20 à 24 heures après l&#39;injection. </li></ol> 4. Visualisation de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 vie et dans les neurones sensoriels aplysie <ol><li> Pour l&#39;imagerie, nous utilisons un microscope inversé Zeiss LSM510 confocale avec une 200 Axiovert. </li><li> Imagerie protocole est le même pour les cellules Sf9 et pour les neurones sensoriels aplysie, sauf pour les éléments suivants: les cellules Sf9 sont imagés avec un objectif x63 huile d&#39;immersion alors neurones sensoriels aplysie sont imagés avec un objectif x40 immersion dans l&#39;huile. Les cellules Sf9 sont imagés dans une chambre à température contrôlée maintenu à 26-27 ° C alors que les neurones sensoriels aplysie sont imagés à la température ambiante maintenue environ 18-20 ° C. </li><li> Nous utilisons un laser Argon 30 mW (excitation à 488nm) avec une sortie laser de 50% à l&#39;image de PKC tagués avec protéine EGFP et un laser HeNe (excitation à 543nm) de la PKC Tagged Image avec des protéines RDRF. L&#39;argon et lignes laser HeNe sont atténués à 4% et de sortie de transmission de 50% respectivement avant l&#39;imagerie et le sténopé est ajusté à un. </li><li> Il est important d&#39;avoir stabilisé la boîte de culture sur la scène d&#39;imagerie et d&#39;éviter tout mouvement ou vibration. </li><li> Retirer 1 ml de milieux de culture de l&#39;antenne doucement à l&#39;aide d&#39;une pipette 10 ml en laissant 1 ml de volume total dans le plat. </li><li> Prenez des photos dans la section du milieu des cellules où le noyau peut être vu. </li><li> Mettre en place une série de temps de 10-20 images confocales de prendre une photo toutes les 30 secondes. </li><li> Démarrer la série chronologique. </li><li> Après deux photos sont prises (après le point de temps de 30 secondes), ajouter 1 mL de la drogue (2X la concentration) doucement goutte à goutte au-dessus des cellules à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000. Le médicament est ajouté en continu pendant environ 30 secondes. </li><li> Certains médicaments induisent une translocation rapide qui peut être visible immédiatement un traitement médicamenteux (à la fois le point 60 secondes) tandis que d&#39;autres induisent une translocation lente qui est seulement 5-10 minutes optimale post-traitement (Film 1 et Film 2). </li><li> Si le médicament doit être emportés, utiliser 2 x 10 ml pipettes pour faire la lessive, le pipetage du tampon de lavage doucement avec une pipette sur un côté du plat et de pipetage jusqu&#39;à les médias de l&#39;autre côté. </li><li> Si le lavage a été efficace et si l&#39;effet de la drogue est réversible, la PKC retourne vers le cytosol dans les 30-60 secondes. </li><li> Enregistrer le film en tant que fichier RMLL. </li><li> Utilisez NIH Image J logiciel pour ouvrir les fichiers LSM et de quantifier les images pré et post traitement médicamenteux. La quantification a été décrit ailleurs 1. </li></ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

Nous avons décrit une technique pour la translocation des PKC l&#39;image par fluorescence marqués en temps réel dans des cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie. Les cellules Sf9 de fournir un système simple à l&#39;image de translocation de PKC, depuis la culture et de les transfecter est assez simple. En revanche, la micro-injection de neurones sensoriels aplysie prend un certain temps à maîtriser, jusqu&#39;à quelques mois. Difficultés liées à cette technique comprennent colmatage de l...

<table><tbody><tr><td>Cellules Sf9 congelées</td><td>&lt;em&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; cellules ovariennes</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>Milieu pour insectes Grace&amp;rsquo;s, supplémenté (1X), liquide</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>Utilisé pour cultiver les cellules Sf9</td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire incliné Corning 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Outil</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>Utilisé pour cultiver les cellules Sf9</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Réactif</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>Supplémenter le milieu Grace&amp;rsquo;s avec du SVF avant utilisation</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Utilisée pour filtrer la solution de vert rapide</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Utilisée pour filtrer l’ADN plasmidique / la solution de vert rapide</td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Outil</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>Utilisé pour filtrer la solution de vert rapide</td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Outil</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>Utilisé pour filtrer l’ADN plasmidique / la solution de vert rapide</td></tr><tr><td>Plaque à fond en verre</td><td>Outil</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Utilisée pour cultiver les cellules Sf9 avant transfection et imagerie</td></tr><tr><td>Réactif Cellfectin II</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Utilisé pour exprimer des PKC marquées par fluorescence dans les cellules Sf9</td></tr><tr><td>Vert rapide FCF</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>Utilisé pour visualiser l’injection intracellulaire de solution d’ADN plasmidique dans les neurones sensoriels de &lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Capillaires en verre à paroi mince</td><td>Outil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>Utilisés pour fabriquer des micr&amp;#8211;électrodes pour microinjection</td></tr><tr><td>Micro-pipette Microloader</td><td>Outil</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>Stériliser au autoclave avant utilisation pour remplir les micr&amp;#8211;électrodes destinées à la microinjection</td></tr><tr><td>Pompe pneumatique PicoPump PV820</td><td>Outil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>Élément de la station de microinjection</td></tr><tr><td>Support de micr&amp;#8211;électrode</td><td>Outil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>Utilisé pour maintenir la micr&amp;#8211;électrode</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Outil</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>Utilisé pour positionner la micr&amp;#8211;électrode selon les trois axes</td></tr></tbody></table>

live-imagerie de la translocation de la pkc dans les cellules sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

La protéine kinase C (PKC) sont des sérine thréonine kinases qui jouent un rôle central dans la régulation d&#39;une grande variété de processus cellulaires tels que la croissance cellulaire et de l&#39;apprentissage et la mémoire. Il ya quatre familles connues des isoformes de la PKC chez les vertébrés: PKC classiques (α, ßi, βII et γ), le type de roman que je PKC (ε et η), le roman de type II PKC (δ et θ), et des PKC atypiques (ζ et ι ). La PKC classiques sont activés par le Ca 2 + et diacylclycerol (DAG), tandis que le roman de PKC sont activées par le DAG, mais sont Ca 2 +-indépendante. La PKC atypiques sont activés par Ca 2 + ni, ni DAG. En Aplysia californica, notre système modèle pour étudier la formation de la mémoire, il ya trois système nerveux spécifiques isoformes de PKC un de chaque grande catégorie, à savoir le traditionnel PKC Apl I, le type de roman que je PKC Apl II et l&#39;atypique PKC Apl III. PKC sont des lipides kinases activées et donc l&#39;activation des PKC classiques et novatrices en réponse aux signaux extracellulaires a été fréquemment corrélée à la translocation de la PKC cytoplasme vers la membrane plasmique. Ainsi, en visualisant la translocation de la PKC dans le temps réel dans des cellules vivantes est devenu un outil précieux pour élucider les voies de transduction du signal qui conduisent à l&#39;activation de PKC. Par exemple, cette technique a permis d&#39;établir que différentes isoformes de la PKC translocation dans des conditions différentes de médiation types distincts de la plasticité synaptique et que la sérotonine (5HT) activation de la PKC Apl II nécessite la production de deux DAG et l&#39;acide phosphatidique (PA) pour translocation 1-2. Fait important, la capacité de visualiser le même neurone a à plusieurs reprises nous a permis, par exemple, pour mesurer la désensibilisation de la réponse de la PKC dans le détail exquis 3. Dans cette vidéo, nous démontrons chaque étape de la préparation des cultures de cellules Sf9, des cultures de neurones sensoriels aplysie ont été décrites dans un autre article 4 vidéo, en exprimant PKC fluorescence marqués dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie et en direct de la translocation de la PKC imagerie en réponse à activateurs différents en utilisant le laser-microscopie à balayage.

Dans cette vidéo, nous démontrons la visualisation de la translocation de la PKC dans les cellules vivantes en utilisant PKC fluorescence marqués.

Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

Les protéines kinases C (PKC) sont des sérine/thréonine kinases qui jouent un rôle central dans la régulation d'une grande variété de processus cellulaires tels que la croissance cellulaire et...

L'objectif de cette procédure est de visualiser la translocation de la PKC marquée par un fluorochrome dans des cellules vivantes. Cette étape est réalisée en préparant tout d'abord des cultures de cellules SF9 ou des cultures de neurones sensoriels provenant de Plegia californica. La deuxième étape consiste à exprimer dans les cellules des PKC marquées par un fluorochrome.La dernière étape consiste à imager la translocation de la PKC en réponse à différents activateurs en utilisant la microscopie à balayage laser. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une régulation différentielle des différentes isoformes de la PKC par des messagers secondaires tels que le diacylglycérol, grâce à l'imagerie en temps réel de la translocation de la PKC dans des cellules vivantes. Bonjour, je m'appelle Carol Ferra.Je suis chercheur associé dans le laboratoire du Dr Wayne Sawn à l'Institut neurologique de Montréal. Aujourd'hui, je vais démontrer l'imagerie en temps réel de la translocation de la PKC dans des neurones sensoriels d'Aplysia. Cette méthode permet de répondre à des questions fondamentales dans le domaine de la plasticité synaptique, telles que la manière dont les différentes isoformes de la PKC sont activées durant la formation de la mémoire.Pour préparer les cultures monosouches de cellules SF9 dans une hotte de culture tissulaire, ajouter huit millilitres de milieu Grace pour insectes contenant 30 % de sérum bovin fœtal dans un flacon de culture cellulaire de 75 centimètres carrés, puis décongeler rapidement le tube congelé de cellules SF9 dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius en déplaçant le tube d'avant en arrière pendant environ une à deux minutes. Ensuite, transférer les cellules SF9 dans le flacon de culture cellulaire et agiter doucement le flacon à la main pour répartir les cellules uniformément. Incuber les cellules pendant une à deux heures à 27 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles se soient fixées.Ensuite, retirez le milieu ancien du flacon et remplacez-le par 10 millilitres supplémentaires de milieu d'insecte Grace frais contenant 30 % de FBS, puis incubez les cellules à 27 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles atteignent la confluence. Pour maintenir les cultures en monocouche, retirez le milieu ancien du flacon confluent de cellules SF9 et ajoutez 5 millilitres de milieu d'insecte Grace contenant 10 % de FBS ; tapez doucement plusieurs fois sur le côté du flacon afin de détacher les cellules SF9. Puis, à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, aspirez et redistribuez délicatement le milieu plusieurs fois.Pulvériser une fois sur la paroi du flacon pendant le prélèvement, puis transférer les cellules dans un tube stérile en polystyrène de 15 millilitres. Ajouter deux millilitres de suspension cellulaire SF9 à huit millilitres de milieu insecte de Grace contenant 10 % de FBS dans un nouveau flacon de culture cellulaire de 75 centimètres carrés, selon un rapport de dilution de un à cinq. Pour maintenir une croissance en phase logarithmique, agiter doucement le flacon à la main.Ensuite, incuber à nouveau les cellules à 27 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient confluentes. Après l'incubation, les cellules SF9 sont prêtes à être utilisées pour l'expression de PKC marquées par un fluorophore, comme décrit dans la procédure écrite précédant l'expression de PKC marquées par un fluorophore. Des cultures cellulaires neuronales primaires sont préparées dans des boîtes de culture à fond en verre MatTek, comme décrit précédemment. Deux jours après l'isolement des neurones sensoriels, filtrer une solution préalablement préparée de vert de faste à l'aide d'une seringue et d'un filtre de seringue de 20 millimètres avec une taille de pore de 0,2 micron.Préparez une solution d'ADN plasmidique codant pour E-G-F-P-P KC API deux dans de l'eau distillée contenant 0,5 % de vert rapide à une concentration n'excédant pas 0,4 microgramme par microlitre. Filtrez la solution d'ADN plasmidique au vert rapide à l'aide d'une seringue d'un millilitre et d'un filtre à seringue de quatre millimètres avec une taille de pore de 0,2 micron. Puis centrifugez la solution d'ADN plasmidique au vert rapide à 16 110 ×g pendant 15 minutes à l'aide d'une microcentrifugeuse.Ensuite, préparez des électrodes pointues pour l'injection microscopique de neurones à l'aide d'un tireur d'électrodes. Tirez des microélectrodes en verre en utilisant des capillaires en verre à paroi mince contenant des filaments internes. Remplissez chaque électrode avec deux microlitres de solution de plasmide ADN au vert rapide.À l’aide d’une micro-pipette, la microinjection est réalisée au niveau de la station de microinjection. Cette station est composée d’un plateau en verre de grande taille, fabriqué maison, destiné à accueillir les boîtes de culture sur une table d’isolation des vibrations. Elle comprend un stéréomicroscope avec éclairage halogène externe, un micromanipulateur et un porte-électrode microscopique relié à une pompe pneumatique.L'entrée de pression de la pompe pneumatique est reliée à un réservoir d'azote comprimé. Transférez la boîte de culture Matech à fond en verre contenant les cultures de neurones plegia vers la station de micro-injection et insérez une microélectrode dans le porte-microélectrode. Observez les neurones au microscope stéréo et insérez la pointe de la micropipette dans le noyau de la cellule.Appliquez de courtes impulsions de pression d'azote d'une durée de 10 à 100 millisecondes et de 20 livres par pouce carré jusqu'à ce que le noyau devienne uniformément vert. Incubez les cellules pendant quatre heures à température ambiante, puis conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation sur un microscope confocal inversé Zeiss LSM 510 équipé d'un axia avert. 200 est utilisé pour l'imagerie des cellules SF9 et des neurones sensoriels de plegia.L'imagerie des neurones sensoriels de la plegia est démontrée dans cette vidéo. Les détails concernant l'imagerie des cellules SF nine sont disponibles dans le protocole écrit. Utilisez un laser argon de 30 milliwatts avec une puissance de sortie de 50 % pour imager la PKC marquée avec la protéine EGFP.Ensuite, atténuez la ligne laser d'Argonne à une sortie de transmission de 4 %. Réglez ensuite le diaphragme à un, stabilisez la boîte de culture sur le plateau d'imagerie et évitez tout mouvement ou vibration. Retirez délicatement un millilitre de milieu de culture de la boîte à l’aide d’une pipette de 10 millilitres et laissez un volume total d’un millilitre.Dans la boîte. Localiser la section médiane des cellules où le noyau est visible. Configurer une série temporelle de 10 à 20 images confocales avec des intervalles de 30 secondes.Démarrez le film et, après la prise de la deuxième image, induisez la translocation en ajoutant délicatement un millilitre de médicament à une concentration deux fois supérieure. Ajoutez le médicament goutte à goutte directement au-dessus des cellules de manière continue pendant environ 30 secondes. Ici, la sérotonine est utilisée pour induire une translocation rapide, qui peut être visible immédiatement après le traitement par le médicament.Certains médicaments induisent une translocation lente, qui n'est optimale qu'entre cinq et dix minutes après le traitement. Éliminez le médicament à l'aide de deux pipettes de 10 millilitres, en ajoutant délicatement le tampon de lavage avec une pipette d'un côté de la boîte, tout en aspirant le milieu de l'autre côté. Si le lavage est efficace et que l'effet du médicament est réversible, la PKC retournera dans le cytosol en 30 à 60 secondes. Enregistrez le film sous forme de fichier LSM indiqué.Voici les résultats représentatifs d'un imagerie en direct de la translocation de la PKC dans des neurones sensoriels de plexus. L'APL deux E-G-F-P-P KC était exprimé dans un neurone sensoriel et une série de 10 images confocales a été enregistrée à des intervalles de temps de 30 secondes. Dans cet exemple, la sérotonine a été ajoutée dans la boîte après 30 secondes d'enregistrement.Dans cet exemple, l'imagerie en direct de la translocation de la PKC est montrée dans des cellules SF nine. L'EGFP-PKC APL un et le MRFP-PKC APL deux ont été coexprimés dans des cellules SF nine et une série de 10 images confocales a été enregistrée à des intervalles de temps de 30 secondes. Un deux DIOCTYL SN glycérol.Un analogue perméable à la cellule du glycérol DYL a été ajouté à la boîte après 30 secondes d'enregistrement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment exprimer des PKC marquées par un fluorophore dans des neurones sensoriels d'aplysie, ainsi que comment imager la translocation de la PKC dans des cellules vivantes.

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Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode pour l'imagerie de cellules vivantes de façon asymétrique divisant sensorielles des cellules progénitrices d'organes et les cellules épidermiques...

Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d&#39;organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Nous montrons comment les changements dans la concentration de calcium libre intracellulaire et l'efficacité synaptique peut être surveillés simultanément dans une préparation de...

Mesure des variations de la concentration de calcium intracellulaire et de l&#39;efficacité synaptique dans le mollusque<em&gt; Aplysie</em

Source : Jongbloets, B. C., et al. Visualisation de l’activité de la protéine kinase A chez des souris ayant un comportement fixe à l’aide de la microscopie d’imagerie à vie à vie à fluorescence à deux photons in vivo. (2019){{}} Cette vidéo présente une procédure de microscopie d’imagerie à vie de fluorescence à deux photons pour visualiser l’activité de la protéine kinase A chez des souris ayant un comportement fixe pendant la locomotion forcée.

Visualisation de l’activité de la protéine kinase A chez une souris à l’aide de la microscopie d’imagerie à vie par fluorescence à deux photons 

Nous présentons ici un roman Ca 2+ -Imagerie approche utilisant un journaliste bioluminescente. Cette approche utilise une construction GFP-aequorine condensé qui se lie au Ca 2+ et émet de la lumière, éliminant le besoin d'une lumière d'excitation. Significativement cette méthode permet à long imagerie continue, l'accès à des structures profondes du cerveau et une haute résolution temporelle.

In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d&#39;imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et intracellulaire. Ici, je décris un protocole in vivo d’enregistrement et d’analyse du transport axonal et de chez c. elegans.

Immobilisation Caenorhabditis elegans , à analyser le Transport intracellulaire dans les neurones

Une procédure est présentée pour visualiser les activités de kinase a de protéine dans les souris head-fixed, se comportant. Un journaliste amélioré d'activité de A-kinase, tAKARMD, est exprimé dans les neurones corticaux et rendu accessible pour la formation image par une fenêtre crânienne. La microscopie d'imagerie à vie à deux photons est utilisée pour visualiser les activités de LPJ in vivo pendant la locomotion forcée.

Visualisation de la protéine Kinase Une activité chez des souris à behaving à l'aide de la microscopie d'imagerie à deux photons in vivo fluorescence à vie

Ce protocole présente une méthode d’imagerie de l’activité de la population neuronale avec une résolution unicellulaire chez des espèces d’invertébrés non transgéniques à l’aide de colorants sensibles à la tension d’absorbance et d’un réseau de photodiodes. Cette approche permet un flux de travail rapide, dans lequel l’imagerie et l’analyse peuvent être poursuivies au cours d’une seule journée.

Imagerie optique basée sur des photodiodes pour l’enregistrement de la dynamique des réseaux avec une résolution mononeurone chez les invertébrés non transgéniques

Ce protocole décrit les applications de l’immobilisation de l’échantillon à l’aide de caillots de Fibrine, limitant la dérive et permettant l’ajout et le lavage de réamen pendant l’imagerie en direct. Les échantillons sont transférés à une goutte de Fibrinogen contenant du milieu de culture à la surface d’un coverslip, après quoi la polymérisation est induite par l’ajout de thrombine.

Applications de l’immobilisation des tissus drosophiles avec caillots de fibrine pour l’imagerie en direct

Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

Cet article présente un protocole détaillé par étapes sur la façon d’utiliser un système intégré multifonctionnel et programmable par l’utilisateur qui permet l’imagerie multicanal automatique et l’analyse mécanobiologique pour élucider la mécanosensibilité de la protéine associée au Oui (YAP).

Interrogation mécanobiologique entièrement optique de protéines associées au Oui dans le cancer humain et les cellules normales à l’aide d’un système multifonctionnel

Ici, nous démontrons comment combiner la transfection des neurones primaires de rongeurs de l’hippocampe avec l’imagerie confocale de cellules vivantes pour analyser les effets induits par les protéines pathologiques sur le transport axonal et identifier les voies mécanistes médiant ces effets.

Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

Découvrez l'imagerie en temps réel de la translocation de la PKC dans les neurones sensoriels d'Aplysia et les cellules Sf9. Cette méthode par microscopie confocale permet d'étudier la régulation différentielle des isoformes de PKC par les seconds messagers.

Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

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