Name: Arabidopsis thaliana profilage glycolipides polaires par chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la chromatographie gaz-liquide (GLC) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Apprenez à profiler les lipides polaires chez Arabidopsis thaliana par chromatographie sur couche mince couplée à la chromatographie gaz-liquide. Cette méthode simple permet une analyse quantitative des esters méthyliques d'acides gras.

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Ce travail est soutenu par une subvention du US National Science Foundation à Christoph Benning.

1. L'extraction des lipides <ol><li> Commencez l'extraction des lipides par la récolte de 30 mg feuilles d'Arabidopsis 4 semaines d'âge à partir de plantes cultivées sur gélose solidifiée moyen ou le sol et les transférer dans des tubes de 1,5 ml en polypropylène réaction. Les feuilles fraîches peuvent être éclair congelés dans l'azote liquide et stockés à -80 ° C. </li><li> Ajouter 300 uL d'extraction solvant composé de méthanol, le chloroforme et l'acide formique (20:10:01, v / v / v) pour chaque échantillon. Agiter vigoureusement (à l'aide d'une peinture ou un shaker similaire) pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter 150 ul de 0,2 M d'acide phosphorique (H 3 PO 4), 1 M de chlorure de potassium (KCl) et brièvement au vortex. </li><li> Centrifuger à 13000 xg à température ambiante pendant 1 minute. Les lipides dissous dans la phase inférieure chloroformique seront déposés sur des plaques de CCM. </li></ol> 2. Chromatographie sur couche mince (CCM) 15 <ol><li> Pour préparer des plaques de CCM, immerger un gel de silice TLC 20cmx20cm plaque recouverte de chargement de bande de 30 sec en sulfate d'ammonium 0,15 M ((NH 4) 2 SO 4) solution, après avoir submergé pendant 30 secondes, sèche la plaque pendant au moins 2 jours dans un récipient couvert. Lors de l'activation de la sublimation de l'ammonium laisse derrière lui l'acide sulfurique, qui protone phosphatidylglycérol nécessaires à sa séparation d'avec les autres glycérolipides. </li><li> Le jour de l'expérience, d'activer TLC plaques par cuisson dans un four à 120 ° C pendant 2,5 heures. </li><li> Après refroidissement les plaques activées à la température ambiante, utilisez un crayon pour dessiner une ligne droite (1,5 cm du bord de la plaque) sur la plaque à l'origine du chromatogramme. </li><li> Dans une hotte, lentement livrer 3 X 20 pi d'extrait lipidique dans la phase inférieure chloroformique aide d'une pipette 20 pl avec 200 pi jaunes pointes en plastique sous un faible courant de N 2. À cette fin, un tube Tygon est relié au régulateur de la N 2 réservoir. Gardez le spot inférieure à 1 cm de diamètre. Chaque plaque peut contenir jusqu'à 10 échantillons (lorsque l'analyse ultérieure GLC est prévu). </li><li> Comme les lipides taches complètement sec dans la hotte, préparer le solvant de développement composé d'acétone, de toluène, de l'eau (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Si l'humidité de l'air ambiant relative est élevée, la séparation pourrait être affectée. Dans ce cas, l'eau doit être réduite pour donner (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) pour obtenir la séparation souhaitée. </li><li> Verser 80 ml solvant de développement dans un TLC refermable développement de chambre (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) et placer la plaque dans la cuve avec la fin de l'échantillon vers le bas. Sceau de la cuve à l'aide de la pince. Le solvant montera sur le plateau et les lipides seront séparés. Le temps de développement est d'environ 50 minutes à température ambiante. </li><li> Lorsque le front du solvant a atteint 1 cm du haut de la plaque, enlevez soigneusement la plaque de la cuve et le sécher dans la hotte pendant 10 minutes environ. </li><li> Lipides séparés par CCM peut être réversible teinté brièvement avec de l'iode pour l'analyse quantitative ou irréversiblement coloré avec l'acide sulfurique ou α-naphtol. <ol><li> Carbonisation d'acide sulfurique: la plaque de pulvérisation avec de l'acide sulfurique à 50% dans de l'eau dans un vaporisateur en verre dans la hotte et cuire au four à 120 ° C pendant 15 minutes (figure 2A). </li><li> α-naphtol coloration pour glycolipides: pulvériser la plaque avec 2,4% (p / v) α-naphtol dans 10% (v / v) d'acide sulfurique, 80% (v / v) d'éthanol et cuire au four à 120 ° C pendant 3-5 minutes jusqu'à ce que les bandes glycolipide sont colorés roses ou pourpres (figure 2B). Surtraitement mènera à la carbonisation de toutes les lipides due à la présence d'acide sulfurique dans le réactif. </li><li> Coloration à l'iode: dans une hotte, placer la plaque dans une cuve fermée avec TLC cristaux d'iode (dans un bac sur le fond conduisant à une saturation de l'atmosphère avec la vapeur d'iode jusqu'à ce lipides sont visibles). Ne pas exposer la plaque à l'iode trop longtemps que l'iode peut modifier de façon covalente des acides gras polyinsaturés (figure 2C). Sinon, pour éviter toute oxydation des lipides, des voies réservées aux standards entrecoupées de ruelles échantillon doit être teinté en utilisant une laine de verre bouché pipette Pasteur avec des cristaux d'iode à travers lequel le N 2 est soufflé individuels voies standard. </li></ol></li></ol> 3. Acyl ester méthylique (FAME) Réaction 16 <ol><li> Retirez la silice entourant taches lipides identifiés à partir de la plaque de CCM avec une lame de rasoir. Grattez la silice et le transfert lipidique contenant la poudre de silice en utilisant un entonnoir dans un tube en verre avec un bouchon à vis en téflon (PTFE)-alignés. </li><li> Ajouter 1 mL 1 N d'acide chlorhydrique (HCl) dans le methanol anhydre pour chaque échantillon en verre pipette. </li><li> Ajouter 100 uL 50 pg ml -1 pentadécanoïque acide (15h00) avec 200 uL pipette pour chaque échantillon comme étalon interne à l'aide d'une pipette 200 ul avec 200 uL embout en plastique jaune. Gardez un tube avec seulement l'acide pentadecenoic de HCl méthanolique comme un contrôle. Fermer les tubes en verre hermétiquement avec téflon bouchons. </li><li> Incuber gltubes cul dans une 80 ° C bain-marie pendant 25 minutes. Tubes doivent être scellés de telle sorte que le solvant ne s'évapore pas. </li><li> Après les tubes ont refroidi, ajouter 1 ml de chlorure de sodium à 0,9%, suivi par une mL d'hexane et vortexer vigoureusement. Centrifuger les échantillons à 1000xg pendant 3 minutes. </li><li> Dans la hotte, enlever la couche d'hexane / supérieure de l'échantillon avec une pipette Pasteur et le placer dans un nouveau tube en verre 13x100 mm. </li><li> Evaporer l'hexane sous un faible courant de N 2 sans sécher complètement. </li><li> Dissoudre le résultant acyl esters méthyliques s dans 60 uL d'hexane. Transfert des échantillons dans des flacons échantillonneur automatique et bouchon. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pour le court terme et -20 ° C pendant quelques jours. </li></ol> 4. Chromatographie gaz-liquide (GLC) 10 <ol><li> Avant de commencer GLC, s'assurer que l'hélium, l'hydrogène et des bouteilles d'air sont remplis. </li><li> Hexane suffisante doit être ajoutée au réservoir de solvant et le conteneur à déchets doit être vide. Pour la séparation gras esters méthyliques d'acyle, joignez une DB-23 colonne à la machine. </li><li> Placez les flacons dans l'échantillonneur automatique. Démarrez le logiciel Chemstation pour GLC sur l'ordinateur du système. </li><li> Réglez la température d'entrée à 250 ° C avec un débit d'hélium à 48,6 mL -1 min et la pression à 21.93 psi. Le rapport de division est de 30,0: 1. </li><li> La température du four est fixé initialement à 140 ° C pendant 2 min et porté à 160 ° C à une vitesse de 25 ° C min -1. Ensuite, réglez la température pour augmenter de 160 ° C à 250 ° C à une vitesse de 8 ° C min -1 et maintenir à 250 ° C pendant 4 min suivie d'une baisse à 140 ° C à une vitesse de 38 ° C min - 1. Une descente prend environ 21 minutes. </li><li> La température du détecteur à ionisation de flamme est de 270 ° C avec un débit d'hydrogène de 30,0 ml min -1, débit d'air à 400 mL -1 min et le débit de l'hélium à 30,0 mL -1 min. </li><li> Entrez le nombre de flacons et les noms de l'échantillon dans le tableau séquence d'exécution. Réglez l'injecteur 10 uL d'injecter un échantillon de 2 l par flacon. </li><li> Lorsque l'instrument est prêt, lancer la séquence de courir. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Exemples de coloration irréversible des TLC séparés lipides à partir de plants d'Arabidopsis 4 semaines d'âge sont représentées dans la figure 2. Les lipides d'acide sulfurique coloré (figure 2A) sont carbonisés et apparaissent comme des taches brunes. α-naphtol est préférable de teindre des glycolipides tels que MGDG, DGDG, SQDG glycolipides etc colorés avec α-naphtol mener une couleur rose-violet tandis que d'autres lipides polaires tache jaune (figure 2B). La coloration à l'iode est réversible et donne une couleur jaunâtre lipides qui vont disparaître sur une courte période comme l'iode s'évapore (figure 2C). Lipides d'iode brièvement tachés peuvent être soumises à une analyse GLC bien lipides non colorés sont préférables pour réduire briser des lipides. Si c'est fait avec succès, des signaux distinctifs représentant différents acyl ester méthylique sera observée après CGL (figure 3). Fatty ester méthylique d'acyle avec la chaîne carbonée plus courte et moins de doubles liaisons ont temps de rétention en utilisant le DB-23 de la colonne. Acyl ester méthylique de profilage est un outil sensible pour identifier les mutants avec la composition lipidique altéré. Dans la figure 4, la MGDG18: 3 ratio d'acides gras molaire est diminué chez le mutant tgd4-1 par rapport au type sauvage 18. En divisant les moles de acyl ester méthylique pour une classe de lipides avec les taupes de toutes les classes de lipides, le rapport molaire de chaque lipide sont calculés. Par exemple, pour calculer le ratio molaire de MGDG: (MGDG) mol% =% x100 Σ [FAME (MGDG)] / Σ [FAME (total)] Les ratios molaires résultant de chaque classe de lipides à la fois du type sauvage et le mutant peut être comparé. Par exemple, le mutant tgd4-1 a augmenté les quantités relatives de la MGDG et PG, mais diminué des montants de DGDG et PE (figure 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Organigramme Figure 1. De l'analyse des lipides polaires en utilisant des plants d'Arabidopsis. Les lipides totaux sont extraits des plants d'Arabidopsis de 4 semaines, âgé et séparés par CCM. Les lipides peuvent être séparés raclées plaque de CCM pour la transestérification suivie par l'analyse GLC. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Séparation des lipides sur des plaques de CCM. Extraits lipidiques de 35 mg (poids frais) des plants de type sauvage sont séparés par CCM et colorées par l'acide sulfurique (A), α-naphtol (B) ou des vapeurs d'iode (C). Trois répétitions sont indiquées dans chaque méthode de coloration. DGDG, digalactosyldiacylglycérol; MGDG, monogalactosyldiacylglycérol; PC, la phosphatidylcholine, PE, la phosphatidyléthanolamine, PG, phosphatidylglycerol; PI, phosphatidylinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Analyse GLC d'esters méthyliques d'acides gras (FAME) dérivés de MGDG de type sauvage. FAME sont séparés sur une colonne capillaire de 30 m et détectés par ionisation de flamme. Pentadécanoïque acide (15:00) est utilisé comme standard interne. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Profil des acides gras MGDG dans le type sauvage Col2 (colonnes blanches) et les tgd4-1 mutante (colonnes noires). Les acides gras sont présentées comme le nombre de carbones suivie par le nombre de doubles liaisons. Trois répétitions sont en moyenne et les écarts types sont représentés. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Polar composition des lipides de type sauvage Col2 (colonnes blanches) et les tgd4-1 mutante (colonnes noires). Trois répétitions sont en moyenne et les écarts types sont représentés par des barres d'erreur.

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TLC couplé avec CGL offre un outil robuste et rapide pour l&#39;analyse quantitative des lipides polaires dans les plantes. De petits changements dans la composition lipidique peut être identifié, par conséquent, cette méthode a été utilisée pour le dépistage à grande échelle des mutants déficients dans les régions polaires des voies métaboliques des lipides 1,20. Cette méthode est également largement utilisé pour les activités de surveillance des enzymes utilisant des lipides polaires comme substrat. 2,6,7 Outre les feuilles, la composition lipidique des autres tissus végétaux comme les racines et les graines ou les fractions subcellulaires comme les chloroplastes et les mitochondries peuvent également être déterminés de la même manière. Le système de solvants (acétone, toluène, eau) utilisé ici est optimisé pour la séparation des glycolipides et des phospholipides dans les plantes. Cependant, dans tgd1, 2,3,4 mutants et les chloroplastes isolés, TGDG s&#39;exécute avec PE tandis tetragalactosyldiacylglycerol fonctionne avec un PC. Dans ce cas, un système de solvant avec du chloroforme, le méthanol, l&#39;acide acétique et de l&#39;eau (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) est utilisé 13. Parfois deux dimensions TLC en utilisant deux différents systèmes de solvants est effectué pour d&#39;autres glycolipides et des phospholipides séparés 19. En outre, les tissus de la plante peuvent être directement soumis à la réaction suivie par GLC FAME pour déterminer le profil des acides gras totaux sans séparation initiale sur TLC 5. A côté de la CCM ont démontré GLC-système, une autre méthode utilisée pour le profilage des lipides est basé sur la masse d&#39;ionisation électrospray directe tandem de spectrométrie 17. Dans cette méthode, la séparation chromatographique initiale de lipides dans l&#39;extrait est omise. Cependant, cette méthode nécessite un équipement coûteux et un personnel expérimenté, ce qui rend moins utile pour des analyses de routine en laboratoire ou pour le dépistage mutant.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-naphtol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>HCl méthanolique 3N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>Diluer à 1N avec du méthanol</td></tr><tr><td>Plaques de CCM Si250-PA</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>Avec support préabsorbant</td></tr><tr><td>Chambre de CCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à vis</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons à vis</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>Disque en PTFE</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>Système de CPG</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>Colonne DB-23</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>Vials de CPG</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons des vials de CPG</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis thaliana profilage glycolipides polaires par chromatographie sur couche mince (ccm) couplée à la chromatographie gaz-liquide (glc)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biologique des cellules des membranes distincte de l&#39;environnement. D&#39;une cellule unique pour les plantes et les animaux multicellulaires, glycérolipides, tels que la phosphatidylcholine ou la phosphatidyléthanolamine, membranes bicouches forme qui agissent à la fois comme des limites et des interfaces pour l&#39;échange chimique entre les cellules et leur environnement. Contrairement aux animaux, les cellules végétales ont un organite spéciale pour la photosynthèse, les chloroplastes. Le système de membrane du chloroplaste complexes glycérolipides contient uniques, à savoir glycolipides manque de phosphore: monogalactosyldiacylglycérol (MGDG), digalactosyldiacylglycérol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Les rôles de ces lipides sont tout simplement au-delà des structures. Ces glycolipides et glycérolipides autres ont été trouvés dans les structures cristallines du photosystème I et II indiquant l&#39;implication de glycérolipides dans la photosynthèse 8,11. Pendant la famine de phosphate, DGDG est transféré sur des membranes extraplastidic pour compenser la perte de phospholipides 9,12. Une grande partie de notre connaissance de la biosynthèse et la fonction de ces lipides a été dérivé d&#39;une combinaison d&#39;études génétiques et biochimiques de 14 Arabidopsis thaliana. Durant ces études, une procédure simple pour l&#39;analyse des lipides polaires a été essentiel pour le dépistage et l&#39;analyse des lipides et des mutants seront décrites en détail. Un extrait lipidique des feuilles est d&#39;abord séparés par chromatographie sur couche mince (CCM) et glycérolipides sont colorées de manière réversible avec la vapeur d&#39;iode. Les lipides individuels sont grattées de la plaque de CCM et convertis en esters méthyliques gras acyle (FAME), qui sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (FID-GLC) (figure 1). Cette méthode a été prouvée pour être un outil fiable pour le dépistage du mutant. Par exemple, le tgd1, 2,3,4 réticulum endoplasmique-à-plastes mutants trafic de lipides ont été découvertes basées sur l&#39;accumulation d&#39;une galactoglycerolipid anormale: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) et une diminution de la quantité relative de 18h03 (carbones: double obligations) groupes acyle gras dans les lipides de la membrane 3,13,18,20. Cette méthode est également applicable pour la détermination des activités enzymatiques de protéines en utilisant des lipides comme substrat 6.

Composition des extraits lipidiques polaires et la composition en acides gras de glycérolipides individuels sont déterminés dans une expérience de profilage des lipides simples et robustes. À cette fin, glycérolipides sont isolés par chromatographie sur couche mince et soumis à transméthylation de leurs groupes acyle. Fatty acyl esters méthyliques sont quantifiés par chromatographie gaz-liquide.

Arabidopsis thaliana profilage glycolipides polaires par chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la chromatographie gaz-liquide (GLC)

Les membranes biologiques séparent les cellules de leur environnement. De la cellule unique aux plantes et animaux multicellulaires, les glycérolipides, tels que...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la composition en lipides polaires des plantules d'arabidopsis. Cela est réalisé en extrayant d'abord les lipides des plantules. Les lipides polaires sont ensuite séparés par chromatographie sur couche mince.Ensuite, les taches spécifiques de lipides sont isolées à partir de la plaque de chromatographie sur couche mince et converties en esters méthyliques d'acides gras par transestérification. La dernière étape de la procédure consiste à quantifier la composition des esters méthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse-liquide. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant le rapport molaire et le profil en acides gras de chaque lipide polaire chez le type sauvage et le mutant.Bonjour, je m'appelle Christophe Benning. Plusieurs d'entre vous nous ont demandé comment effectuer une analyse quantitative des lipides polaires. Nous utilisons une méthode très simple et robuste, qui s'est révélée efficace lors du criblage à grande échelle de mutants chez la plante modèle *Arabidopsis thaliana* ou chez des moteurs RG kilométriques.D'autres excellentes méthodes, telles que le profilage lipidique par spectrométrie de masse, nécessitent des équipements coûteux ainsi qu'une grande expérience et une formation approfondie. Nous utilisons une procédure en deux étapes qui implique une chromatographie sur couche mince simple, combinée à la quantification des esters méthyliques d'acides gras après l'isolement de mutants. Généralement, une analyse plus quantitative est requise.Cela est réalisé par l'isolement des lipides membranaires à partir de la plaque en couche mince et la préparation d'esters méthyliques d'acides gras, qui sont quantifiés par chromatographie en phase gazeuse. La méthode est hautement reproductible et les résultats sont comparables à ceux obtenus avec des techniques plus complexes basées sur la spectrométrie de masse, démontrant que la procédure sera effectuée par Zen Wang, étudiant diplômé de mon laboratoire. Commencez l'extraction des lipides en récoltant 30 milligrammes de feuilles d'Arabidopsis âgées de quatre semaines, provenant de plantes cultivées sur milieu solide à base d'agar ou en terre. Transférez les feuilles dans des tubes à réaction en polypropylène de 1,5 millilitre.Ajouter 300 microlitres de solvant d'extraction composé de méthanol, de chloroforme et d'acide formique à chaque échantillon. Agiter vigoureusement les échantillons pendant cinq minutes. Ensuite, ajouter 150 microlitres d'acide phosphorique 0,2 molaire, de chlorure de potassium 1 molaire, et vortexer.Centrifuger brièvement l'échantillon à 13 000 ×g pendant une minute. À température ambiante, les lipides dissous dans la phase inférieure de chloroforme seront déposés sur des plaques de chromatographie sur couche mince. Pour préparer les plaques CCM, plonger une plaque de CCM de 20 sur 20 centimètres recouverte de gel de silice avec bande de chargement dans une solution de sulfate d'ammonium 0,15 M.Après une immersion de 30 secondes, séchez la plaque pendant au moins deux jours dans un récipient couvert. Lors de l'activation, la sublimation de l'ammonium laisse de l'acide sulfurique, qui protonate le phosphate du glycérol, nécessaire à sa séparation des autres lipides glycérolés. Le jour de l'expérience, activez les plaques de CCM en les faisant cuire au four à 120 degrés Celsius pendant deux heures et demie.Après avoir refroidi les plaques activées à température ambiante, utilisez un crayon pour tracer une ligne droite à travers la plaque au point de départ du chromatogramme. Dans une hotte, un tube tigon relié au régulateur de la bouteille d'azote est utilisé pour fournir un courant d'azote gazeux ; délivrez lentement, trois fois, 20 microlitres de l'extrait lipidique provenant de la phase inférieure de chloroforme sur la plaque à l’aide d’une micropipette de 20 microlitres équipée d’une pointe plastique jaune de 200 microlitres, sous un flux lent d’azote gazeux. Une micropipette de 20 microlitres est utilisée afin de maintenir la tache inférieure à un centimètre de diamètre.Chaque plaque peut contenir jusqu'à 10 échantillons une fois que les taches lipidiques sont complètement sèches. Dans la hotte, préparez le solvant de développement composé d'acétone, de toluène et d'eau. Versez 80 millilitres du solvant de développement dans une chambre de développement TLC hermétique et placez la plaque dans le réservoir.Avec l'extrémité de l'échantillon orientée vers le bas, scellez le réservoir. À l'aide de la pince, le solvant remontera la plaque et les lipides seront séparés. Le temps de développement est d'environ 50 minutes à température ambiante.Lorsque le front de solvant a atteint un centimètre du haut de la plaque, retirez soigneusement la plaque du réservoir et faites-la sécher complètement sous la hotte pendant 10 minutes. Les lipides séparés par chromatographie sur couche mince peuvent être soit brièvement colorés de manière réversible à l'iode pour une analyse quantitative, soit colorés de manière irréversible à l'acide sulfurique ou à l'alpha natal. Pour colorer irréversiblement la plaque par carbonisation à l'acide sulfurique.Vaporiser la plaque avec de l'acide sulfurique à 50 % dans l'eau à l'aide d'un flacon pulvérisateur en verre sous la hotte et faire cuire à 120 degrés Celsius pendant 15 minutes. Alternativement, pour la coloration au naphtol pour les glycolipides, vaporiser la plaque avec du naphtol à 2,4 % poids par volume dans un mélange contenant 10 % volume par volume d'acide sulfurique et 80 % volume par volume d'éthanol, puis faire cuire la plaque à 120 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes, jusqu'à ce que les taches de glycolipides apparaissent roses ou violettes.Réalisez la coloration à l'iode. Dans une hotte, préparez un réservoir LC fermé contenant des cristaux d'iode dans un plateau placé au fond du réservoir, de manière à saturer l'atmosphère en vapeur d'iode. Placez la plaque de CCM dans le réservoir pour l'exposer à l'iode jusqu'à ce que les lipides deviennent visibles. N'exposez pas trop longtemps à l'iode, car l'iode pourrait se lier de façon covalente.Modifier les acides gras polyinsaturés. Retirer la silice entourant les taches lipidiques identifiées sur la plaque de CCM à l’aide d’un scalpel et gratter la silice contenant les lipides. À l’aide d’un entonnoir, transférer la poudre de silice dans un tube en verre muni d’un bouchon vissable en téflon.Ajouter un millilitre d’acide chlorhydrique dans du méthanol anhydre à chaque échantillon à l’aide d’une pipette en verre. Puis ajouter 100 microlitres d’acide pentadécanoïque à 50 microgrammes par millilitre à chaque échantillon comme étalon interne, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres équipée d’une pointe plastique jaune de 200 microlitres. Préparer également un tube contenant uniquement de l’acide pentadécanoïque dans du méthanol acide chlorhydrique comme témoin.Fermer hermétiquement les tubes en verre avec des bouchons revêtus de téflon. Incuber les tubes en verre dans un bain-marie à 80 degrés Celsius pendant 25 minutes. Les tubes doivent être scellés afin que le solvant n'évapore pas après refroidissement des tubes.Ajoutez un millilitre de chlorure de sodium à 0,9 %, suivi d'un millilitre d'hexane, puis vortexez vigoureusement. Centrifugez les échantillons à 1000 × g pendant trois minutes. Après la centrifugation, retirez la couche supérieure d'hexane de l'échantillon à l’aide d’une pipette Pasteur dans la hotte aspirante et placez-la dans un nouveau tube en verre de 13 sur 100 millimètres. Évaporez l'hexane sous un flux lent d'azote sans sécher complètement. Dissolvez les esters méthyliques d'acides gras obtenus dans 60 microlitres d'hexane. Transférez les échantillons dans des vials d'auto-échantillonneur, puis fermez-les hermétiquement.Les échantillons peuvent être conservés à quatre degrés Celsius à court terme et à moins 20 degrés Celsius pendant quelques jours avant de commencer la GLC. Vérifiez que les bouteilles d'hélium, d'hydrogène et d'air sont remplies, que du hexane a été ajouté au réservoir de solvant et que le contenant des déchets est vide pour la séparation des esters méthyliques d'acides gras. Fixez une colonne DB 23 à l'appareil.Placer les vials dans l'échantillonneur automatique. Démarrer le logiciel ChemStation pour CPG sur l'ordinateur du système. Régler la température de l'injecteur à 250 degrés Celsius, avec un débit d'hélium de 48,6 millilitres par minute et une pression de 21,93 PSI.Le rapport de division est de 30 pour un. La température du four est initialement réglée à 140 degrés Celsius pendant deux minutes, puis augmentée jusqu'à 160 degrés Celsius à un taux de 25 degrés Celsius par minute. Ensuite, réglez la température pour qu'elle passe de 160 degrés Celsius à 250 degrés Celsius à un taux de huit degrés Celsius par minute, avec maintien de la température à 250 degrés Celsius pendant quatre minutes, suivi d'une diminution jusqu'à 140 degrés Celsius à un taux de 38 degrés Celsius par minute.À l’aide de ce profil thermique, un cycle dure environ 21 minutes. La température du détecteur à ionisation de flamme est de 270 degrés Celsius, avec un débit d’hydrogène de 30 millilitres par minute. Le débit d’air est de 400 millilitres par minute et celui de l’hélium de 30 millilitres par minute.Saisissez le nombre de vials et les noms des échantillons dans le tableau de séquence d'exécution. Réglez l'injecteur de 10 microlitres pour injecter deux microlitres de l'échantillon par vial. Lorsque l'appareil est prêt, lancez la séquence d'exécution.Des exemples de coloration de lipides séparés par chromatographie sur couche mince (CCM) provenant de jeunes plants d'Arabidopsis âgés de quatre semaines sont présentés ici. Les lipides colorés à l'acide sulfurique sont carbonisés et apparaissent sous forme de taches brunes. L'alpha natal est préféré pour la coloration des glycolipides tels que M-G-D-G-D-G-D-G et SQ dg.Les glycolipides colorés avec l'alpha natal présentent une teinte rose violacée, tandis que les autres lipides polaires apparaissent en jaune. La coloration par l'iode est réversible et confère aux lipides une couleur jaunâtre qui disparaîtra rapidement à mesure que l'iode s'évapore. Brièvement, les lipides colorés à l'iode peuvent être soumis à une analyse par CPG, bien que les lipides non colorés soient préférables afin de limiter la dégradation des lipides, si cela est réalisé avec succès.Des signaux distinctifs représentant différents méthyl esters d'acides gras seront observés après chromatographie en phase gazeuse. Les méthyl esters d'acides gras ayant des chaînes carbonées plus courtes et moins de doubles liaisons présentent un temps de rétention plus court. En utilisant la colonne DB 23, le profilage des méthyl esters d'acides gras constitue un outil sensible pour identifier des mutants dont la composition lipidique est modifiée.Le rapport molaire des trois acides gras de l’MGDG 18 est réduit chez le mutant TGD4-1 par rapport au type sauvage, en divisant le nombre de moles d’ester méthylique d’acide gras pour une classe de lipides par le nombre de moles d’ester méthylique d’acide gras de l’ensemble des classes de lipides. Les rapports molaires de chaque classe de lipides sont calculés ; les rapports molaires obtenus pour chaque classe de lipides peuvent ainsi être comparés entre le type sauvage et le mutant. Il est évident que le mutant TGD4-1 présente des quantités relatives accrues d’MGDG et de pg, mais des quantités réduites de DGDG-NPE. La chromatographie sur couche mince permet l’analyse parallèle de nombreux échantillons et autorise un examen visuel des principales différences dans les profils lipidiques.En outre, en observant une CCM, vous examinez essentiellement de nombreux enzymes et gènes nécessaires à la synthèse des lipides et donc au profil lipidique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser la composition des lipides polaires par COT et CGT. Merci d'avoir regardé la vidéo et bonne chance dans votre expérience.

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Arabidopsis thaliana profilage glycolipides polaires par chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la chromatographie gaz-liquide (GLC) (Vidéo) | JoVE Journal

Arabidopsis thaliana profilage glycolipides polaires par chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la chromatographie gaz-liquide (GLC)

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