Infection sous-cutanée du Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)

L'objectif général de l'expérience suivante est d'examiner la survie et la dissémination du staphylocoque doré résistant à la méthicilline, ou MA, ainsi que les niveaux de chimiokines et de cytokines aux sites d'infection. Cela est réalisé en éliminant le pelage du dos des souris afin d'obtenir une zone d'observation claire. Dans un deuxième temps.

Le SARM en suspension sera administré aux souris par voie sous-cutanée trois jours après l'infection ; les pathologies infectieuses et les décomptes bactériens peuvent être évalués en déterminant le nombre d'unités formant des colonies à partir d'homogénats tissulaires sur des boîtes de gélose. Bonjour, comment allez-vous ? Je m'appelle De Lordon.

Je suis chercheuse postdoctorante. Bonjour, je m'appelle Mariel Sanchez. Je suis étudiante au doctorat et je suis Andrea Huda.

Je suis chercheur associé, nous faisons partie du laboratoire de George Lee au sein du service de pédiatrie du centre médical Cedar-Sinai. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine médical, telles que la modélisation d'infections graves, incluant la myosite, la polymyosite et la fasciite nécrosante. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur les infections graves en urgence, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes tels que le streptocoque du groupe A et d'autres organismes.

En outre, nous pouvons étudier la fonction et la pathogenèse d'autres organismes responsables de myosite et de polymyosite. Généralement, les personnes novices dans cette procédure peuvent éprouver des difficultés car l'un des membres des zones de caucus du régulateur mondial est hautement mutable. Si des précautions ne sont pas prises, les données recueillies peuvent présenter des variations importantes, ce qui rendra difficile l'interprétation des résultats.

Commençons. Dans une installation de niveau de sécurité biologique 2, préparez une gélose au sang de mouton sur base TSA et une anse stérile à l’aide d’un bloc congelé. Retirez la culture témoin de Mercer du stockage à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, à l’aide de la boucle stérile, prélevez un petit fragment de glace à partir de la culture témoin et déposez-le sur la boîte de Petri. Dès l’obtention d’un petit fragment de la culture témoin Mercer, remettez immédiatement la culture témoin au congélateur afin d’éviter toute décongélation, car des cycles répétés de congélation et décongélation endommageraient la culture témoin. Utilisez la boucle pour ensemencer la gélose afin de favoriser la croissance de colonies individuelles de Mercer.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit sans supplément de CO₂. Le lendemain, préparer et étiqueter une nouvelle lame pour prélèvement sanguin, une plaque TSA, et un tube de 15 millilitres à bouchon vissé contenant trois millilitres de THB.

Récupérez la plaque M SSA cultivée pendant la nuit et examinez le phénotype hémolytique des colonies. À l’aide d’une anse stérile, choisissez une colonie dont le phénotype est conforme à celui des colonies expérimentales précédentes. Inoculez le THB avec la colonie sélectionnée en utilisant la même stérilisation par passage en flammes.

Incuber la solution de THB dans la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit avec agitation à 220 tours par minute. Ces bactéries seront utilisées pour inoculer la culture destinée à l'infection sous-cutanée des souris dans les étapes ultérieures. Placer également la plaque d'agar sang dans l'incubateur.

La plaque sera utilisée le lendemain matin pour confirmer que le phénotype hémolytique des bactéries dans la solution THB correspond à celui de la colonie initialement sélectionnée. Si le phénotype hémolytique ne correspond pas à celui du clone d'origine, ne pas commencer l'expérience. Transférer la souris sur une plateforme et raser les poils de son dos.

Si l'animal est excessivement agressif, une sédation à l'isoflurane peut être nécessaire. Appliquer environ cinq millimètres cubes de crème dépilatoire, telle que NA, sur la zone rasée. NA peut être acheté en pharmacie locale.

Veillez à acheter la crème dépilatoire contenant de l'huile pour bébé, car le produit sans huile pour bébé serait trop stimulant pour les souris. Laissez la crème agir à la surface de la peau pendant environ une minute ; pendant que la crème dépilatoire agit, humidifiez quelques serviettes en papier avec de l'eau doublement distillée après une minute. Utilisez les serviettes humides pour nettoyer la zone rasée.

Vérifiez que la peau est débarrassée de la crème dépilatoire. Préchauffez 10 millilitres de THB dans un tube de 50 millilitres à bouchon vissé à 37 degrés Celsius dans un incubateur à bactéries pendant quatre à dix heures. Transférez 20 microlitres de la culture bactérienne de nuit dans le THB préchauffé. Ceci diluera la culture de nuit.

Une suspension à un sur 500. Placer le tube à 37 degrés Celsius dans un incubateur agité à 220 tours par minute pendant environ deux heures et demie à trois heures après la période d'incubation. Utiliser davantage de THB pour diluer davantage la suspension bactérienne à un sur 10 et mesurer la suspension à l'aide d'un spectrophotomètre.

Avec une absorbance à 514 nanomètres. Réincuber la suspension à 37 degrés Celsius avec agitation à 220 tours par minute jusqu'à ce que la suspension diluée au 1/10 atteigne 0,25. Pour recueillir les M er, centrifuger le tube de 50 millilitres à 3 225 ×g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius, puis jeter le surnageant. Resus.

Suspendez la palette bactérienne dans 10 millilitres de PBS-DP et lavez à nouveau les bactéries en répétant l'étape de centrifugation pour ce modèle d'infection sévère. Resuspendez le culot bactérien dans environ un millilitre de PBS-DP, ce qui donne environ 1 × 10¹⁰ unités formant colonies par millilitre. Préparez des plaques A-R-T-S-A au sang de mouton, diluez les bactéries sériellement du facteur 10¹ à 10⁸ dans du PBS-DP, puis ensemencez les plaques.

Déposer des gouttes de 10 microlitres de la suspension bactérienne diluée en série, en triple, sur une plaque d'agar-sang. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après une incubation de 16 à 18 heures, observer et noter le phénotype d'hémolyse de l'inoculum.

Comptez les unités formant des colonies sur les boîtes. L'inoculum d'infection sera calculé en fonction du nombre d'unités formant des colonies sur les boîtes.

Préparez une seringue avec 100 microlitres de la suspension bactérienne dans le DPBS préparé précédemment. Avant l'injection, les souris doivent être sédatées afin que leur fréquence respiratoire soit d'environ une respiration par seconde. À des fins de démonstration, une souris euthanasiée est présentée dans cette vidéo.

Injecter le sérum M dans un flanc après l'injection. Replacer la souris dans sa cage. Observer les animaux pendant trois à cinq heures après l'injection pour s'assurer que la souris est vivante avant de la ramener en salle d'animaux.

Surveiller quotidiennement les lésions sur le dos des animaux après leur sacrifice. Mesurer et noter la taille et l'état des lésions cutanées. Les zones de lésions cutanées et musculaires sont quantifiées en multipliant la longueur par la largeur de la lésion en millimètres.

Les lésions de forme irrégulière doivent être divisées en fragments plus petits et symétriques, puis chaque fragment doit être mesuré selon la même méthode. Préparez des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de DPBS pour la collecte des tissus. Incisez légèrement la peau à l’aide d’un scalpel stérile, puis excisez la lésion à l’aide de ciseaux stériles.

Lors de l'excision de la lésion, veillez à inclure environ deux à cinq millimètres de peau saine entourant la zone. Placez la lésion dans des tubes de collecte tissulaire destinés à l'analyse des lésions musculaires. Retirez soigneusement la peau afin de mesurer la taille de la lésion et d'enregistrer son état sur le tissu musculaire.

Prélevez la rate et les reins. Placez ces tissus dans des tubes de collecte individuels. Homogénéisez les tissus en agitant avec une seringue d'un millilitre pendant environ 30 secondes.

Ajouter 900 microlitres de DPBS dans chaque tube. Préparer les plaques THA et vortexer les échantillons de tissu homogénéisés pendant cinq minutes. Diluer l'échantillon en série.

Les suspensions sont diluées d’un facteur allant de un à dix puissance six. Dans des plaques de 96 puits, distribuez 10 microlitres de chaque suspension diluée en série sur les puits. Incubez les plaques toute la nuit dans un incubateur bactérien à 37 degrés Celsius.

Le lendemain matin, compter les unités formant colonies sur les boîtes de culture et calculer le nombre d'unités formant colonies en fonction des facteurs de dilution. Si l'infection est réalisée correctement, une cloque sera observée à la surface de la peau immédiatement après l'injection sous-cutanée. En l'absence d'observation de cloque, l'injection risque d'être trop profonde, ce qui pourrait affecter l'issue de l'infection.

La taille de la lésion et la survie bactérienne peuvent être évaluées à différents moments après l'infection à l'aide de MSA. Les lésions cutanées suivantes ont été examinées au troisième jour post-infection et illustrent un exemple de lésion chez une souris CD un infectée sur un flanc avec une concentration de un fois dix puissance sept unités formant colonies. Les lésions musculaires se localisent généralement dans le tissu sous-jacent aux lésions cutanées.

Voici des exemples de lésions musculaires superficielles correspondant aux photos de lésions cutanées présentées précédemment. Il s'agit de lésions musculaires observées au troisième jour suivant l'infection chez une souris infectée par une dose de 1 × 10⁷ unités formant colonies. La zone lésée est déterminée par la longueur multipliée par la largeur de la lésion, mesurée en millimètres, et peut être quantifiée afin d'évaluer les dommages tissulaires de la peau.

Le nombre d'unités formant des colonies des bactéries localisées au site d'infection peut être quantifié sur les lésions excisées. Le décompte des unités formant des colonies peut indiquer si un facteur de virulence confère à l'MSA un avantage de survie. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'appliquer les précautions standard de sécurité en raison de l'utilisation d'aiguilles et de micro-organismes hautement pathogènes après cette procédure.

Enfin, dans le modèle d'abcès, nous utilisons une inoculum 1 000 fois plus faible que dans notre modèle ; ce dernier peut servir à répondre à des questions supplémentaires, telles que : quels sont les facteurs S qui favorisent une infection persistante de RSA ? N'oubliez pas que manipuler des seringues remplies de Mars A peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, comme jeter la seringue directement dans un conteneur pour objets tranchants, sont importantes afin d'éviter toute piqûre accidentelle par l'aiguille. Par ailleurs, pour cette expérience, il est essentiel de suivre les protocoles standard de niveau de sécurité biologique 2 (BSL-2) afin d'assurer une désinfection adéquate de la zone de travail.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé. Salut. Salut, au revoir.