Transformation d'ADN plasmidique dans E. coli en utilisant la méthode du choc thermique

Bonjour, je m’appelle Alex Hoge. Je travaille au gymnase Hall Lab du département de physiologie et de biophysique de l’Université de Californie à Irvine. Et aujourd’hui, je vais vous montrer comment transformer un e coli électriquement compétent par la méthode de chaque choc.

Donc, aujourd’hui, j’utilise cette technique pour transformer un coli avec mon produit de lation parce que je fais un problème pour faire une monture complète chez le poisson zèbre. D’accord, nous allons commencer à faire la transformation. Donc, vous devez d’abord avoir votre bain-marie ou votre bus sec à 42 degrés.

Vous devez avoir vos bactéries que vous venez de sortir de la ville principale dans de la glace. Aujourd’hui, nous utilisons des cellules de compétence électrique d’ités et aussi votre ADN dans la glace. Vous avez également besoin d’un tube de média SOC à la température domestique ou 37 et de vos plaques de VG plus un média antibiotique.

Alors maintenant, je vais ajouter l’ADN avec les bactéries. Je travaille donc à côté de la flamme pour ne pas contaminer les bactéries. J’ajoute donc de la lation avec les bactéries.

C’est 50 microlitres de bactéries, puis immédiatement dans la glace, vous pouvez le tapoter un peu pour mélanger les bactéries et votre ADN et vous laissez jusqu’à 15 minutes dans la glace. Alors maintenant, 15 minutes se sont écoulées et nous sommes prêts à faire le choc thermique, c’est-à-dire mettre les bactéries à 42 degrés pendant 45 secondes. Donc, je retire les tubes de la glace directement à 42 degrés, 30 minuterie 45 secondes, puis je les remets très rapidement dans la glace et je les mets sur 42 directement sur la glace.

Et puis nous attendons deux minutes. Alors maintenant, je vais ajouter le milieu SOC dans les bactéries et les mettre à 37 pendant 30 minutes. Alors je le vaporise 500 microlitres de média SOC et je le mets dans les bactéries et les mets dans ma petite chambre de fortune.

Donc, si vous allez utiliser des tubes d’extrémité et une chambre de fortune pour votre incubateur, assurez-vous de mettre vos tubes d’extrémité à l’horizontale car ils trembleront beaucoup mieux comme ça. Nous sommes donc maintenant prêts à mettre les tubes dans l’agitateur. C’est pourquoi nous avons cette petite chambre à 37 degrés pendant 30 minutes.

Nous avons maintenant terminé l’incubation à 37 degrés et nous allons mettre les bactéries en plaques sur lb plus des antibiotiques. Donc, dans mon cas, c’est du chloral. Donc, à I 50 microlitres de chaque échantillon et mettez-le sur la plaque.

Donc, avec les 500 microlitres restants, vous les faites tourner dans une petite table, certains refusent afin de peler les bactéries. Donc, après l’ification, nous obtenons une belle pastille et ce que nous allons faire maintenant, c’est retirer presque tous les supports SOC, il suffit de laisser 50 microlitres et ensuite nous pouvons mettre en plaque ces 50 microlitres de bactéries concentrées. Donc, je paie payé environ 450 microlitres.

Je laisse juste ça. Alors maintenant, je vais suspendre la palette dans les 50 microlitres restants du média SOC. Et après cela, je peux plaquer ces 50 microlitres dessus, sur une autre assiette.

Alors je résiste à chaque palette, puis je la marionnette et je la plaque. Il y aura donc à la fin deux plaques par échantillon. Nous devons maintenant répartir les bactéries sur la plaque LB.

Je vais donc utiliser des billes de verre autoclave, mais vous pouvez également utiliser un tuyau au-delà duquel vous façonnez en épandeur comme ça. Je vais donc mettre quelques perles sur la boîte de Pétri. J’aime ça.

Eh bien, 10 15. Donc, après avoir ajouté les billes, vous mettez toutes vos assiettes dans un tas comme ça et vous les secouez doucement pour que les perles répartissent uniformément les bactéries partout sur les plaques. Donc, lorsque je déplace les plaques jusqu’à ce qu’elles soient sèches.

Ainsi, ce qui signifie que vous ne devriez pas voir de grandes traînées de liquide lorsque vous vous déplacez avec les billes. Par exemple, dans cette plaque, les perles ont tendance à s’effondrer ensemble et à voir beaucoup de traînées. C’est la sueur que l’on fait, les perles bougent librement, que l’on est sec.

Alors maintenant, les plaques sont sèches afin que nous puissions jeter les perles. Donc, je vais juste le tirer comme ça pour que vous puissiez les recycler. Alors maintenant, nous allons mettre la plaque dans l’incubateur à 37 pendant la nuit, et vous mettez les plaques à l’envers après 12 heures d’incubation à 37, nous sortons la plaque de l’incubateur.

Et comme on peut le voir, on a moins de colonies dans la plaque où je le plaque 50 microlitres que dans la plaque où j’ai plaqué le reste. Ce qui est important lorsque vous transformez des bactéries, c’est d’avoir la bonne quantité de colonies dans votre assiette, la bonne densité. Donc, à cet endroit, vous avez très peu de colonies, mais si vous voulez plus de colonies, vous pouvez avoir le bon exemple dans cette plaque où c’est exactement la bonne densité, environ 100 colonies par plaque.

Cette plaque est un mauvais exemple car il y a trop de colonies et vous ne pouvez pas choisir des colonies individuelles. Je viens donc de vous montrer comment transformer e coli à chaque transformation. Donc l’aspect très important de cette technique est de tout garder froid ou glacé avant le choc.

Puis 45 secondes normales, plus à 42 degrés dans la glace. Et puis tout le reste doit être à une température chaude ou à 37 degrés. Alors maintenant, je vais dépister mes colonies par dépistage PCR.

Donc, l’un des points aussi est d’avoir deux plaques. Donc, premièrement, nous nous attendons à avoir beaucoup de colonies et celles-ci en moins. Et ce qui est important, c’est d’avoir vos assiettes bien sèches à l’aide de perles ou du passage du tuyau.

Merci d’avoir regardé et bonne chance pour votre confirmation.