Transformation d'ADN plasmidique dans E. coli en utilisant la méthode du choc thermique

Bonjour, je suis Alex Hoge. Je travaille au laboratoire de la salle de sport Hall, dans le département de physiologie et de biomécanique à l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment transformer des cellules de e coli électrocompétentes par la méthode de l'électroporation.

Aujourd'hui, j'utilise cette technique pour transformer un coli avec mon produit de ligation, car je m'apprête à réaliser une expérience impliquant une hybridation in situ sur des embryons entiers de poisson-zèbre. Bon, nous allons commencer la transformation. Tout d'abord, vous devez disposer d'un bain d'eau ou d'un bloc chauffant à 42 degrés.

Vous devez placer vos bactéries, que vous venez de sortir du stock principal, sur de la glace. Aujourd'hui, nous utilisons des cellules compétentes électriques provenant d'ities, ainsi que votre ADN sur de la glace. Vous avez également besoin d'un tube de milieu SOC à température ambiante ou à 37 °C, et de vos boîtes de milieu LB contenant un antibiotique.

Je vais maintenant ajouter l'ADN aux bactéries. Je travaille donc près de la flamme pour éviter de contaminer les bactéries. J'ajoute donc la lation aux bactéries.

Il s'agit de 50 microlitres de bactéries, puis remettez immédiatement le tube sur la glace ; vous pouvez légèrement agiter pour mélanger les bactéries et votre ADN, et laissez jusqu'à 15 minutes sur glace. Les 15 minutes étant écoulées, nous sommes prêts à effectuer le choc thermique, qui consiste à placer les bactéries à 42 degrés pendant 45 secondes. Je sors donc les tubes de la glace et les place directement à 42 degrés, déclenche le minuteur à 45 secondes, puis je les remets très rapidement sur la glace, en les passant directement du bain à 42 degrés à la glace.

Ensuite, nous attendons deux minutes. Maintenant, je vais ajouter le milieu SOC aux bactéries et les placer à 37 pendant 30 minutes. J'ajoute donc 500 microlitres du milieu SOC que je mets aux bactéries, puis je les place dans ma petite chambre improvisée.

Donc, si vous utilisez des tubes Eppendorf et une chambre improvisée pour votre incubateur, assurez-vous de placer vos tubes Eppendorf horizontalement, car ils seront ainsi bien mieux agités. Nous sommes maintenant prêts à placer les tubes dans l'agitateurs. C'est pourquoi nous avons cette petite chambre à 37 degrés pendant 30 minutes.

Nous avons donc terminé l'incubation à 37 degrés et nous allons ensemencer les bactéries sur un milieu LB additionné d'antibiotiques. Dans mon cas, il s'agit de chloramphénicol. J'ajoute donc 50 microlitres de chaque échantillon et je les dépose sur la boîte de Petri.

Ainsi, avec les 500 microlitres restants, on les centrifuge brièvement dans une petite centrifugeuse de table, afin d'éliminer le surnageant contenant les débris bactériens. Après cette étape, on obtient un joli culot, et ce que nous allons faire maintenant est d'éliminer presque tout le milieu SOC, en n'en laissant que 50 microlitres, puis nous pouvons étaler ces 50 microlitres de bactéries concentrées. J'ai donc éliminé environ 450 microlitres.

Je laisse juste cela. Maintenant, je vais suspendre le culot dans les 50 microlitres restants de milieu SOC. Ensuite, je peux étaler ces 50 microlitres sur une autre boîte de culture.

Je résiste donc à chaque palette, puis je la manipule et je la mets en culture. Il y aura donc, à la fin, deux plaques par échantillon. Nous devons maintenant étaler les bactéries sur la plaque LB.

Je vais donc utiliser des billes de verre stérilisées au autoclave, mais vous pouvez également utiliser un embout de pipette que vous façonnez en forme d’étendeur comme ceci. Je vais donc déposer quelques billes dans la boîte de Pétri. J’aime bien cela.

Eh bien, 10 à 15. Après avoir ajouté les billes, vous empilez toutes vos plaques de cette manière et vous les agitez doucement pour répartir uniformément les billes et les bactéries sur l'ensemble des plaques. Je déplace donc les plaques jusqu'à ce qu'elles soient sèches.

Donc, cela signifie que vous ne devriez pas voir de grandes traînées de liquide lorsque vous déplacez les billes. Par exemple, sur cette plaque, les billes ont tendance à s'effondrer ensemble et à former de nombreuses traînées. Celle-ci est humide, les billes se déplacent librement ; celle-là est sèche.

Les plaques étant maintenant sèches, nous pouvons jeter les billes. Je fais donc une aspiration comme celle-ci afin que vous puissiez les recycler. Nous allons maintenant placer la plaque dans l'incubateur à 37 °C pendant toute la nuit, en position renversée. Après 12 heures d'incubation à 37 °C, nous sortons la plaque de l'incubateur.

Et comme nous pouvons le constater, nous avons moins de colonies sur la plaque où j'ai ensemencé 50 microlitres que sur celle où j'ai ensemencé le reste. Ce qui est important lorsque vous transformez des bactéries, c'est d'obtenir la quantité adéquate de colonies sur votre plaque, une densité appropriée. Ici, vous avez très peu de colonies, mais si vous souhaitez en obtenir davantage, vous pouvez vous référer à l'exemple idéal sur cette plaque, où la densité est exactement correcte, soit environ 100 colonies par plaque.

Cette plaque est un mauvais exemple car il y a trop de colonies et vous ne pouvez pas sélectionner des colonies individuelles. J'ai donc simplement montré comment transformer E. coli par chaque transformation. L'aspect très important de cette technique consiste à maintenir tous les éléments au froid, sur de la glace, avant le choc.

Ensuite, 45 secondes à la normale, puis davantage à 42 degrés, puis de retour sur glace. Et ensuite, tout le reste doit être à une température chaude ou à 37 degrés. Je vais donc maintenant analyser mes colonies par criblage PCR.

Un autre point important consiste donc à disposer de deux plaques. Sur l'une, on s'attend à observer un grand nombre de colonies, tandis que sur l'autre, le nombre de colonies sera moindre. Ce qu'il importe, c'est que vos plaques soient bien sèches, en utilisant des billes ou la pipette Pasteur.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre confirmation.