Name: Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Découvrez une méthode bioinformatique pour inférer le tropisme du VIH-1 en séquençant la région V3 de l'enveloppe virale. Cette approche utilise RT-PCR imbriquée et l'algorithme geno2pheno pour classifier les virus R5 ou non-R5.

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Le développement de ce test a été soutenue par ViiV Healthcare et les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC) et par le biais d&#39;une chaire de GlaxoSmithKline / IRSC sur la virologie clinique pour le Dr Harrigan. Le soutien fourni par Pfizer et ViiV Healthcare.

<ol><li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+cofactor%3A+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane%2C+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li>
<li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+into+CD4%2B+cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li>
<li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+%28UK-427%2C857%29%2C+a+potent%2C+orally+bioavailable%2C+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li>
<li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li>
<li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+versus+efavirenz%2C+both+in+combination+with+zidovudine%2Flamivudine%2C+for+the+treatment+of+antiretroviral-na%C3%ADve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li>
<li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Med.+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li>
<li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Ther%22%5BJournal%5D)">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li>
<li>Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).</li>
<li>Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).</li>
<li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping%3A+Application+of+Population-based+and+%27Deep%27+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li>
</ol>

P. Richard Harrigan a des conflits d&#39;intérêt avec ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott, et Quest. Cette vidéo-article est sponsorisé par ViiV Healthcare.

La méthode présentée ici est une méthode de séquençage norme appliquée à des tests de tropisme. L&#39;application clinique de la boucle V3 du VIH enveloppe séquençage de prédire tropisme viral a été limitée jusqu&#39;à la fin. Cette méthode a été montré, dans des analyses rétrospectives de l&#39;maraviroc (ViiV Healthcare) les essais cliniques, pour être au minimum égale mesure de prédire le tropisme viral en comparaison à d&#39;autres essais validés utilisés en clinique. Il ya plusieurs avantages à effectuer une analyse génotypique de la boucle V3 pour la prédiction de tropisme. Tout d&#39;abord, cette procédure peut être effectuée à toute installation d&#39;équipements opérationnels séquençage, augmentant considérablement l&#39;accessibilité et de réduire les délais d&#39;exécution des tests de tropisme. En comparaison, le dosage phénotypique Enhanced Trofile Sensibilité (ESTA) (Monogram Biosciences), qui a servi comme l&#39;étalon-or pour le test de tropisme, est effectué à un centre en Californie du Sud. Les autres avantages incluent l&#39;exigence d&#39;une matière première moins et une charge virale plasmatique minimale requise des 500copies/mL. En outre, les coûts opérationnels de fonctionnement de l&#39;analyse génotypique sont relativement faibles en comparaison à celles d&#39;un test phénotypique. L&#39;utilisation du logiciel souviens en particulier d&#39;éliminer l&#39;exigence d&#39;examen séquence manuelle, ce qui tend à être une partie du travail intensif des analyses génotype. La méthode présentée ici est assez simple, sans aucune étape particulière emportant une autre importance. Nous ne vous suggérons de lancer PCR et séquençage en trois exemplaires à augmenter les chances de capturer des espèces minoritaires au sein de la population virale d&#39;un échantillon. Réplique de plus de trois peut être effectuée, cependant nous avons trouvé trois exemplaires à la fois efficace et fiable. Nous suggérons également d&#39;utiliser le One-Step Reverse Transcriptase PCR Kit (Qiagen) qui effectue à la fois par RT-PCR et PCR au premier tour dans la même réaction tout en conservant une sensibilité et une spécificité élevées.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Extraction d'ARN à l'aide de NucliSens easyMAG version 1.0&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Silice Magnétique</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280133</td><td>(48 x 0,6 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Tampon de Lysis</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280134</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Tampon d'Extraction 1</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280130</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Tampon d'Extraction 2</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280131</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Tampon d'Extraction 3</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280132</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG version 1.0 </td><td>bioMerieux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hotte de sécurité biologique de classe II A2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PCR en une étape avec transcriptase inverse et PCR de deuxième tour&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau traitée au DEPC</td><td>Ambion</td><td>cat. # 9922</td><td></td></tr><tr><td>Système SuperScript III One-Step RT-PCR avec Platinum Taq Haute Fidélité</td><td>Invitrogen</td><td>cat#12574-035</td><td>Composants du kit utilisés :&lt;br/&gt;- Mélange enzymatique SuperScript III RT/Platinum Taq Haute Fidélité&lt;br/&gt;- Mélange de réaction 2X (tampon contenant 0,4 mM de chaque dNTP, 2,4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>Système PCR Expand Haute Fidélité</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 1 759 078</td><td>Composants du kit utilisés : - Tampon Expand Haute Fidélité 10X concentré avec 15 mM MgCl2 (couvercles marqués 2) - Mélange enzymatique Expand HF PCR (3,5 U/&amp;#x03BC;l) - Solution mère de MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25 mM) (couvercles marqués 4)</td></tr><tr><td>dNTP : dATP, dGTP, dCTP, dTTP</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 11969064001</td><td>(100 mM)</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bromophénol bleu, sel sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# B5525</td><td></td></tr><tr><td>Rouge de crésol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# 114472-5G</td><td>qualité indicateur</td></tr><tr><td>Thermocycleur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Électrophorèse sur gel&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon TAE 50X</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 24710030</td><td>(1000 ml) </td></tr><tr><td>Colorant SYBR Safe pour gel d'ADN</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (ultrapure)</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur d'ADN quantitatif E-Gel Low Range</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 12373-031</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité réactif, type II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil d'électrophorèse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Séquençage&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de séquençage cycle ABI PRISM BigDye Terminator</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4337458</td><td>(25 000 réactions)</td></tr><tr><td>Formamide Hi-Di</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4311320</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S-2889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# 03690-100ML</td><td>0,5 M, pH = 8,0</td></tr><tr><td>Solution tampon TRIZMA Chlorhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # T-2819</td><td>1 M, pH 9,0</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # M-1028</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Éthanol 95 %</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de migration (10X) avec EDTA</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 4335613</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Polymère Pop-7 (25 mL) ou Polymère Pop-7 (10 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 44363929 ou cat. # 4352759</td><td></td></tr><tr><td>Kit standard de séquençage BigDye Terminator v3.1 3700/3730</td><td>Applied Biosciences</td><td>Cat# 4336943</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse avec supports de plaques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyseur d'ADN 3730xl</td><td>Applied Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inférence génotypique de tropisme du vih-1 en utilisant la population basée séquençage du v3

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Contexte: Avant de recevoir un médicament à partir du CCR5 antagoniste classe dans le traitement du VIH, le patient doit subir un test de tropisme du VIH pour confirmer que la population de son virale utilise le corécepteur CCR5 pour entrer cellulaire, et non pas un corécepteur alternatif. Une approche de test de tropisme est d&#39;examiner la séquence de la région V3 de l&#39;enveloppe du VIH, qui interagit avec le corécepteur. Méthodes: ARN viral est extrait du plasma sanguin. La région V3 est amplifié en triple avec imbriquées de la transcriptase inverse-PCR. Les amplifications sont ensuite séquencé et analysé en utilisant le logiciel, RE_Call. Les séquences sont ensuite soumises à un algorithme de bioinformatiques tels que geno2pheno d&#39;inférer tropisme viral à partir de la région V3. Les séquences sont présumées être non-R5 si leur geno2pheno taux de faux positifs est inférieur à 5,75%. Si l&#39;un des trois séquences à partir d&#39;un échantillon est déduite d&#39;être non-R5, le patient est peu probable pour répondre à une CCR5 antagoniste.

VIH tropisme peut être déduite de la région V3 de l&#39;enveloppe virale. V3 est amplifié par PCR en triple en utilisant RT-PCR nichée, séquencé, et interprétées en utilisant un logiciel de bioinformatique. Les échantillons ayant des séquences 1 ou plusieurs (s) avec des scores faibles G2P sont classés comme non-virus R5.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Contexte : Avant de recevoir un médicament de la classe des antagonistes du CCR5 dans le cadre d'un traitement contre le VIH, un patient doit subir un test de tropisme du VIH afin de confirmer que son...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer le tropisme viral chez un patient infecté par le VIH en séquençant la région V3 du gène de l'enveloppe virale afin de commencer par extraire l'ARN du VIH à partir du plasma sanguin du patient. Ensuite, amplifier la région V3 de la GP120 du VIH à l'aide d'une RT-PCR imbriquée. Puis détecter la présence du produit par électrophorèse sur gel, suivie d'un séquençage fondé sur la population des produits V3 amplifiés.Enfin, analyser les séquences à l'aide d'un logiciel d'appel de bases et déduire l'utilisation du co-récepteur en utilisant l'algorithme de prédiction du génotype vers le phénotype. En définitive, ces résultats permettent de déterminer si la souche virale d'un patient est R5 ou non-R5 par séquençage populationnel de la boucle V3 du VIH. Ainsi, l'avantage principal de ce test de souche par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests phénotypiques cellulaires, réside dans sa possibilité d'être réalisé dans tout laboratoire disposant d'un équipement de séquençage, à moindre coût, en moins de temps et avec une quantité réduite de matériel initial.Cette technique est pertinente pour le traitement par thérapie antirétrovirale, car elle permet de déterminer si la population virale d'un patient est susceptible de répondre à un antagoniste du CCR5. À partir de 500 microlitres de plasma, utilisez un extracteur automatisé Easy Mag pour extraire l'ARN du VIH. Passez ensuite dans une salle propre pour PCR afin de préparer la RT-PCR, afin de garantir un échantillonnage adéquat de la population virale.Prévoir d'effectuer chaque réaction de transcription inverse en triple exemplaire dans cette réaction en une étape. Utiliser l'ARN viral pour synthétiser l'ADNc, en amplifiant spécifiquement la région HIVV trois avec les amorces SQV trois F1 et CO 6 0 2 prime repair. Selon les composants par réaction.Préparez une solution mère suffisante pour le nombre d'échantillons à amplifier en utilisant une pipette répétitive. Ajoutez 36 microlitres de mélange d'échantillon dans chaque puits de la plaque PCR. Passez ensuite à une pipette multicanal pour transférer des microlitres d'extrait d'ARN dans chacun des puits désignés. Veillez à changer les embouts entre chaque ajout.Une fois le transfert terminé, couvrez les puits avec des capuchons de bande pour PCR. Ensuite, placez la plaque PCR dans un thermocycleur programmé pour une PCR en une étape avec transcription inverse de la région trois de HIVV. Pour la PCR imbriquée, utilisez la réparation des amorces SQV trois F deux et CD quatre R.Calculez la quantité de réactif nécessaire au nombre d'échantillons à amplifier dans une salle propre pour PCR. Préparez le mélange de PCR imbriquée, puis utilisez une pipette répétitive pour aliquoter 19 microlitres par puits d'une plaque PCR propre. À l'issue de la R-T-P-C-R, déplacez-vous vers une salle post-amplification.Utilisez une pipette multipipette à huit canaux pour transférer un microlitre du modèle d'RT-PCR dans le mélange de PCR nichée. Changez les embouts entre chaque ajout. Couvrez les puits avec des capuchons de bande PCR et transférez la plaque dans un thermocycleur pour l'amplification.Retirer la plaque du thermocycleur une fois que la température est revenue à 25 degrés Celsius. Afin de confirmer que la région V trois a été correctement amplifiée, analyser d'abord les produits par électrophorèse sur gel. Préparer un gel d'AROS à 1,6 % avec un colorant pour gel de type cyber safe.À l’aide d’une pipette multipuits de 10 microlitres, transférez huit microlitres d’échantillons PCR dans les puits respectifs. Chargez également une échelle d’ADN dans au moins un puit par ligne.Faites migrer le gel à environ 100 volts pendant 10 minutes. Visualisez les bandes par fluorescence ultraviolette et documentez l'image par photographie. Notez les échantillons pour lesquels toutes les amplifications en triple ont été réussies.Si nécessaire, répétez la RT-PCR pour les échantillons présentant moins de trois amplifications du produit. Les échantillons d'ADNc viral amplifiés sont ensuite vérifiés par des réactions de séquençage de l'ADN qui seront réalisées à l'aide des amorces V 3 0 2 F et S QV trois R un. Retirez le grand réactif du congélateur et laissez-le décongeler à température ambiante.Calculez et préparez les réactifs nécessaires au nombre d'échantillons à analyser. Répartissez cinq microlitres de mélange de réaction de séquençage dans les puits appropriés de la plaque à l’aide d’une pipette multicanal. Recouvrez la plaque avec un essuie-tout Kim et mettez-la de côté.Entre-temps, préparez une dilution au 1/15 du produit PCR amplifié en ajoutant 180 microlitres d'eau stérile au produit PCR restant. Pipetez un microlitre de l'échantillon dilué au fond du puits approprié. Changez toujours d'embout entre les échantillons dès que le transfert de l'échantillon est terminé.Scellez la plaque avec des capuchons en bande et vortexez pendant une seconde. Pour centrifuger la plaque, réglez la vitesse à 140 5G. Lorsque la vitesse de rotation atteint 140 5G, arrêtez la rotation.Placer la plaque dans un thermocycleur pour permettre la réaction. Dans chaque puits, précipiter l'ADN avec quatre microlitres d'acétate de sodium trois molaire et 40 microlitres d'éthanol glacé à 95 %, puis refermer les bouchons. Vortexer la plaque pendant 10 secondes et taper doucement sur la plaque pour déloger les bulles d'air éventuelles.Placer les plaques à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes à deux heures. Récupérer l'ADN par centrifugation à 2000 ×g pendant 20 minutes. Retirer et jeter les bouchons en bande. Retournez la plaque au-dessus du récipient de déchets et versez le surnageant. Éliminez tout surnageant résiduel en tamponnant les plaques retournées sur une serviette en papier.Pliez deux feuilles de papier essuie-tout pour glisser la plaque entre elles. Placez la plaque face contre le fond de la centrifugeuse et centrifugez à 140 5G. Arrêtez la centrifugation dès que 140 5G est atteint.Ensuite, laver avec 155 microlitres d'éthanol à 95 % et décantation. Répéter ensuite la centrifugation. Laisser reposer la plaque de deux à cinq minutes pour permettre à tout éthanol résiduel de s'évaporer.Afin de dénaturer les échantillons d'ADN, utilisez une pipette multicanal pour distribuer 10 microlitres de colorant concentré pour maide dans tous les puits de la plaque, y compris ceux qui sont vides. Scellez la plaque avec une septima et placez-la dans un thermocycleur à 90 degrés Celsius pendant deux minutes. Enfin, placez la plaque d'échantillons dans une plaque de séquençage et insérez-la dans le séquenceur.Un mode acceptable d’analyse des données consiste à utiliser le logiciel Recall afin d’effectuer un appel de bases automatique sans intervention humaine. Recall est un logiciel gratuit d’appel de bases personnalisé : connectez-vous et sélectionnez les fichiers d’échantillons à télécharger à l’aide de l’option de navigation. Localisez le fichier de données de séquençage brut et téléversez jusqu’à 20 mégaoctets.Ensuite, définissez la séquence de référence sur V trois. Cliquez sur traiter les données. Sélectionnez le dossier résultant du côté droit de la page pour afficher la liste des échantillons.Ceux qui sont rouges ont échoué. Ceux qui sont verts ont réussi. En cliquant sur un échantillon spécifique et sur le bouton de visualisation, vous pouvez examiner la séquence, suivre les instructions situées sur le côté droit de la page pour naviguer dans la séquence, et télécharger les fichiers dans un dossier compressé au format zip.Le tropisme viral peut être déduit à partir de séquences générées par séquençage basé sur une population, en utilisant l'algorithme de prédiction du phénotype à partir du génotype pour le co-récepteur. Dans le menu déroulant des paramètres significatifs, sélectionnez l'option optimisée, basée sur l'analyse de données cliniques provenant de motivate à 2 % et 5,75 % de FPR. Choisissez maintenant de téléverser ou de coller une séquence pour analyse.Les fichiers FASTA sont acceptables. Ne pas ajouter d'autres étapes pour obtenir un prédicteur génétique Tono FPRA de la réponse aux antagonistes du CCR cinq. Le rapport G deux P généré fournit la séquence de la boucle V trois en acides aminés et indique les positions pertinentes des mutations associées aux virus non R cinq.En bas du rapport, le taux de faux positifs est indiqué et interprété en termes de réponse à un antagoniste du CCR5. Ce rapport peut être téléchargé sous forme de fichier PDF. Si l'une des trois séquences d'un échantillon est jugée non R5, le patient ne devrait probablement pas répondre à un antagoniste du CCR5. L'électrophorèse sur gel des amplifications RTP CR de la boucle V3 du VIH-1 indique que tous les échantillons cliniques ne produisent pas un produit.Les séquences générées à partir des échantillons amplifiés peuvent être visualisées dans un chromatogramme lu par rappel. On s'attend à une séquence propre, avec peu de mélanges. Parfois, les séquences peuvent être désordonnées et ne pas permettre une attribution précise des bases.Certains patients peuvent être identifiés comme ayant un virus n'utilisant pas CCR5, comme indiqué ici. Ces patients ne devraient probablement pas répondre au traitement par un antagoniste de CCR5. Toutefois, la majorité des patients présentent une population virale composée de virus utilisant CCR5, comme l'indique la case verte au bas du rapport d'analyse G2P.Ainsi, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre jours du début à la fin, c'est-à-dire de l'extraction à l'analyse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de prédire le tropisme viral à l'aide de méthodes de séquençage fondées sur des populations, combinées à l'algorithme bioinformatique genome pheno.Très bien, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Ce manuscrit décrit la procédure expérimentale et l'analyse de logiciel pour un test de site d'intégration bidirectionnelle qui peut analyser simultanément l'ADN de jonction vecteur-hôte en amont et en aval. Les produits de PCR bidirectionnels peuvent être utilisés pour toute plate-forme de séquençage en aval. Les données résultantes sont utiles pour une comparaison quantitative à haut débit des cibles intégrées d'ADN.

Site d&#39;intégration bidirectionnel Retroviral Méthodologie PCR et analyse de données quantitatives Workflow

Décrit est une méthodologie pour quantifier l’expression des 96 gènes et 18 protéines de surface de cellules uniques ex vivo, permettant d’identifier de façon différentielle exprimée des gènes et des protéines dans les cellules infectées par le virus par rapport aux cellules non infectées. Nous appliquons la démarche d’étude CD4 infectés par le SIV+ T cellules isolées de macaques rhésus.

Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien+ T les cellules isolées de macaques rhésus

Pleine longueur séquençage proviral individuel (FLIPS) fournit une méthode efficace et haut débit pour l’amplification et le séquençage d’unique, près de provirus pleine longueur de VIH-1 (intactes ou défectueux) et permettant la détermination de leur potentiel réplication-compétences. FLIPS surmonte les limites des tests précédents conçus pour séquencer le réservoir latent de VIH-1.

Amplification de près de provirus pleine longueur de VIH-1 pour l’ordonnancement de prochaine génération

Nous présentons une approche de séquençage en profondeur qui fournit une détermination impartiale du naissant 3'-termini ainsi que des profils de mutations des molécules d’ADN simple brin. L’application principale est la caractérisation de naissants DNAs rétrovirales complémentaires (ADNc), les intermédiaires générés lors du processus de transcription inverse rétrovirale.

Déterminant des séquences de molécules monocaténaires naissant de l’ADN Viral au cours du VIH-1 et 3'-Termini Reverse Transcription dans les cellules infectées

Découvrez une méthode bioinformatique pour inférer le tropisme du VIH-1 en séquençant la région V3 de l'enveloppe virale. Cette approche utilise RT-PCR imbriquée et l'algorithme geno2pheno pour classifier les virus R5 ou non-R5.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

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