Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

L’objectif global de cette procédure est d’inférer le tropisme viral chez un patient infecté par le VIH en séquençant la région V trois du gène de l’enveloppe virale pour commencer à extraire H-I-V-R-N-A du plasma sanguin du patient. Ensuite, amplifiez la région V trois du VIH GP un 20 à l’aide de R-T-P-C-R imbriqués. Ensuite, identifiez la présence du produit à l’aide de l’électrophorèse sur gel, suivie d’un séquençage basé sur la population des produits V trois amplifiés.

Enfin, analysez les séquences à l’aide d’un logiciel d’appel de base et déduisez l’utilisation des corécepteurs à l’aide de l’algorithme genome-topheno. En fin de compte, ces résultats peuvent montrer si la troupe virale d’un patient est R cinq ou non R cinq grâce au séquençage basé sur la population de la boucle trois du VIHV. Ainsi, le principal avantage de cette technique est un test de troupes par rapport aux méthodes existantes telles que les tests phénotypiques basés sur des cellules, c’est qu’elle peut être réalisée dans n’importe quel laboratoire équipé d’un appareil de séquençage pour un coût réduit en moins de temps avec moins de matériel de départ.

Cette technique est pertinente pour le traitement par traitement antirétroviral car elle permet d’identifier si la population virale d’un patient est susceptible de répondre à un antagoniste du CCR cinq à partir de 500 microlitres de plasma. Utilisez un extracteur automatisé easy mag pour extraire H-I-V-R-N-A. Passez maintenant à une salle blanche de PCR pour mettre en place le R-T-P-C-R afin d’assurer un échantillonnage adéquat de la population virale.

Prévoyez d’effectuer chaque réaction de transcription inverse en trois exemplaires dans cette réaction en une étape. Utiliser l’ARN viral pour synthétiser l’ADNC, en amplifiant spécifiquement la région trois du VIHV avec la réparation principale SQV trois F1 et CO 6 0 2. Basé sur les composants par réaction.

Préparez une solution mère suffisante pour le nombre d’échantillons à amplifier à l’aide d’une pipette à répéteur Ajoutez 36 microlitres de mélange d’échantillons dans chaque puits de la plaque de PCR. Passez maintenant à une pipette multicanaux pour transformer des microlitres d’extrait d’échantillon d’ARN dans chacun des puits désignés. Prenez soin de changer les pourboires entre chaque ajout.

Une fois le transfert terminé, couvrez les puits avec des capuchons de bande PCR. Placez ensuite la plaque de PCR dans un thermocycleur programmé pour un R-T-P-C-R en une étape de la région trois du VIHV. Pour la PCR imbriquée, utilisez l’amorce de réparation SQV trois F deux et CD quatre R.

Calculez la quantité de réactif nécessaire pour le nombre d’échantillons à amplifier dans une salle blanche PCR. Générez le mélange PCR imbriqué, puis utilisez une pipette à répéteur pour aliquoter 19 microlitres par puits d’une plaque PCR propre. Une fois le R-T-P-C-R terminé, passez à une salle de post-amplification.

À l’aide d’une pipette multicanaux à huit canaux, transférez un microlitre de la matrice R-T-P-C-R dans le mélange PCR imbriqué. Changez les pourboires entre chaque ajout. Couvrez les puits avec des capuchons de bande PCR et transférez la plaque dans un thermocycleur pour l’amplification.

Retirez la plaque du thermocycleur une fois que la température est revenue à 25 degrés Celsius. Afin de confirmer que la région V trois a été amplifiée avec succès, analysez d’abord les produits par électrophorèse sur gel. Préparez un gel AROS à 1,6 % avec une teinture de gel cyber safe.

À l’aide d’une pipette multicanaux de 10 microlitres. Transférez huit échantillons PCR d’un microlitre dans les puits respectifs. Chargez également une échelle d’ADN dans au moins un puits par rangée.

Faites fonctionner le gel à environ 100 volts pendant 10 minutes. Visualisez les bandes par fluorescence ultraviolette et documentez l’image par la photographie. Notez les échantillons où toutes les amplifications triples ont été couronnées de succès.

Si nécessaire, répétez R-T-P-C-R pour les échantillons avec moins de trois amplifications de produit. Les échantillons d’ADNC viral amplifiés sont vérifiés par séquençage de l’ADN : des réactions seront effectuées à l’aide des amorces V 3, 0, 2, F et S, QV, trois R, un. Sortez le réactif big di du congélateur et décongelez-le à température ambiante.

Calculer et préparer les réactifs nécessaires pour le nombre d’échantillons à analyser. Aliquote cinq microlitres de réaction de séquençage dans les puits de plaque appropriés à l’aide d’une pipette multicanaux. Couvrez l’assiette avec une lingette Kim et mettez-la de côté.

Pendant ce temps, préparez une dilution de un à 15 du produit PCR amplifié en ajoutant 180 microlitres d’eau stérile au produit PCR restant. Pipeter un microlitre de l’échantillon dilué au fond de la plaque appropriée. Les puits changent toujours les pointes entre les échantillons lorsque le transfert d’échantillon est terminé.

Scellez la plaque avec des capuchons à bande et vortex pendant une seconde. Pour centrifuger la plaque, réglez la vitesse sur 140 5G. Lorsque la vitesse d’essorage atteint 140 5G, arrêtez l’essorage.

Placez la plaque dans un thermocycleur pour que la réaction se poursuive. Dans chaque puits, précipitez l’ADN avec quatre microlitres d’acétate de sodium à trois molaires et 40 microlitres d’éthanol réfrigéré à 95 %, refermez les bouchons. Cortexez la plaque pendant 10 secondes et tapotez la plaque pour déloger les bulles d’air.

Placez les assiettes à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes à deux heures. Récupérer l’ADN par centrifugation à 2000 G pendant 20 minutes. Retirez et jetez les capuchons de bande.

Retournez la plaque sur le conteneur à déchets et décantez le super natin. Débarrassez-vous de tout super natin restant. En épongeant les plaques inversées sur une serviette en papier.

Pliez deux feuilles d’essuie-tout pour prendre l’assiette en sandwich. Placez la plaque face vers le bas dans la centrifugeuse et essorez-la à 140 5G. Arrêt de la rotation lorsqu’elle atteint 140 5G.

Puis laver avec 155 microlitres d’éthanol à 95 % et décanter. Répétez ensuite la centrifugation. Laissez reposer la plaque pendant deux à cinq minutes pour permettre au dernier éthanol de s’évaporer.

Afin de dénaturer les échantillons d’ADN, utilisez une pipette multicanaux pour distribuer 10 microlitres de colorant élevé pour maide dans tous les puits de la plaque, y compris ceux qui sont vides. Scellez la plaque avec une septima et placez-la dans un thermocycleur à 90 degrés Celsius pendant deux minutes. Enfin, placez la plaque d’échantillon dans une plaque de séquençage et dans le séquenceur.

Une voie acceptable pour l’analyse des données est l’utilisation du rappel logiciel pour effectuer des appels de base automatiques sans intervention humaine. Recall est un logiciel d’appel personnalisé gratuit : connectez-vous et sélectionnez des exemples de fichiers à télécharger avec l’option de navigation. Localisez le fichier de données de séquençage brut et chargez jusqu’à 20 mégaoctets.

Ensuite, réglez la séquence de référence sur V trois. Cliquez sur Traiter les données. Sélectionnez le dossier obtenu sur le côté droit de la page pour afficher la liste des échantillons.

Ceux qui sont rouges ont échoué. Ceux qui sont verts sont passés. En cliquant sur un échantillon spécifique et sur le bouton d’affichage, vous pouvez consulter la séquence, suivre les instructions sur le côté droit de la page pour naviguer dans la séquence, télécharger des fichiers dans un dossier zip.

Le tropisme viral peut être déduit des séquences générées par le séquençage basé sur la population à l’aide de l’algorithme de co-récepteur géno-phéno. Dans le menu déroulant du paramètre significatif, sélectionnez l’optimisé basé sur l’analyse des données cliniques de motivate 2 % et 5.75 % FPR. Choisissez maintenant de télécharger ou de coller une séquence pour l’analyse.

Les fichiers FASTA sont acceptables. Ne pas ajouter d’autres procéder pour obtenir un géno Tono FPRA prédicteur de la réactivité aux antagonistes de la RCC cinq. Le rapport G deux P généré fournit la séquence de boucle V trois dans les acides aminés et indique les positions pertinentes des mutations associées à l’utilisation du virus non R cinq.

Au bas du rapport, le taux de faux positifs est donné et interprété en termes de réponse à un antagoniste du CCR cinq. Ce rapport peut être téléchargé au format PDF. Si l’on déduit que l’une des trois séquences d’un échantillon n’est pas R cinq, il est peu probable que le patient réponde à un antagoniste du CCR cinq, car l’électrophorèse sur gel attendue de RTP CR Les amplifications de la boucle VIH un V trois indiquent que tous les échantillons cliniques ne produisent pas un produit.

Les séquences générées à partir des échantillons amplifiés peuvent être visualisées dans un chromatogramme lu par rappel. Une séquence propre avec peu de mélanges est attendue. À l’occasion, les séquences peuvent être désordonnées et ne pas se prêter à une affectation de base précise.

Certains patients peuvent être identifiés comme ayant un virus non CCR cinq, comme illustré ici. Il est peu probable que ces patients répondent au traitement par un antagoniste du CCR cinq. Cependant, la majorité des patients présentent une population virale composée de CCR cinq utilisant le virus, comme l’indique un encadré vert au bas du rapport d’analyse G deux P.

Ainsi, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre jours du début à la fin. C’est-à-dire de l’extraction à l’analyse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de prédire le tropisme viral à l’aide de méthodes de séquençage basées sur la population en conjonction avec l’algorithme bioinformatique du génome pheno

D’accord, c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.