Name: Ladministration passive danticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez l'administration d'anticorps monoclonaux pour lutter contre l'histoplasmose chez la souris C57BL/6. Cette méthode évalue l'efficacité protectrice et le rôle de l'immunité humorale contre Histoplasma capsulatum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. La croissance de H. Capsulatum <ol><li> Préparer une enceinte de sécurité biologique pour le travail avec le champignon par le nettoyage de l'armoire avec l'eau de Javel à 10% puis 20 min d'irradiation UV. H. capsulatum dans la phase de la levure nécessite du niveau de biosécurité (BSL) pratiques II, tandis que la forme du moule nécessite BSLIII. Utilisez la forme levure dans les étapes suivantes. </li><li> Suivant préparer un tube de 15 ml conique avec 5 ml de PBS. Récolte d'une colonie de H. capsulatum (Hc souche ATCC G217B) à partir d'une plaque de BHI agar au sang [de glucose à 10 g / L, la cystéine 0,1 g / L, la pénicilline-streptomycine 1% et les moutons des globules rouges à 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, USA) ] cultivées à 37 ° C ou prélever une aliquote de stock levures congelés à -80 ° C et l'ajouter à la PBS. Vortex les cellules vigoureusement et centrifugeuse pour 1100 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer délicatement le surnageant sans perturber le culot et ajouter 10 ml d'PBS frais. Répétez cette procédure trois fois. Suspendre les cellules dans 5 ml de PBS et de transférer à un tube conique de 50 ml. </li><li> Pour perturber les cellules agrégées, passer la suspension de cellules de levure dans un G1 26 / 2 u aiguille chanter une seringue de 10 ml 5 fois dans une enceinte de sécurité biologique (utilisant la protection du visage). Pour isoler les petits, la levure uniforme de taille, centrifuger les cellules à 55 g pendant 1 min à température ambiante, puis enlever le haut de 1 ml. </li><li> Ajouter la suspension cellulaire dans un erlenmeyer stérile contenant 100 ml de milieu HAM F12 (Gibco) supplémenté avec 16 g / L de glucose, 1g / L d'acide glutamique, 8.4mg / L cystine, 6g / l d'acide glutamique et ensuite pousser les cellules à 37 ° C pendant 48 h dans un incubateur à 150rpm secouant. </li></ol> 2. Croissance hybridome et purification d'anticorps monoclonaux <ol><li> Transfert des hybridomes sélectionnés pour un milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal, NCTC 10%, 1% de non-acides aminés essentiels et 1% de pénicilline-streptomycine. Cultiver les cellules dans un flacon de culture cellulaire (Becton Dickinson) pendant 5-7 jours à 37 ° C CO / 5% 2. </li><li> Puis centrifuger le milieu à 1100 xg pendant 10 min à température ambiante et de recueillir toutes le surnageant sans perturber les pastilles. </li><li> Ensuite, purifie le surnageant cellulaire gratuitement en utilisant une protéine Une résine / G par FPLC. </li><li> La concentration du MAB peut alors être calculée par une capture (1) ELISA utilisant un contrôle isotype IgG en standard (figure 1B). </li></ol> 3. Préparation Histoplasma capsulatum inoculum <ol><li> Prenez un 48 h Histoplasma capsulatum (Hc souche ATCC G217B) culture en phase de levures cultivées en HAM F-12 à moyen terme. </li><li> Centrifuger les cellules à 1100 xg pendant 10 min. Jeter le surnageant et ajouter du PBS frais. </li><li> Répétez la procédure 3.2 à 3 reprises. </li><li> Passez à la suspension de cellules de levure 5 fois par une aiguille 26G1 / 2 à l'aide d'une seringue. </li><li> Centrifuger la suspension à 55 g pendant 1 min à grappes culot cellulaire résiduel. Transférer le surnageant contenant la suspension cellule unique à un nouveau tube. </li><li> Énumérer la suspension cellulaire unique en utilisant un hématocytomètre. </li><li> Ajuster la concentration de cellules afin de parvenir à 1,25 x 10 7 levures (de survie) ou 5,0 x 10 6 (UFC, de cytokines et de l'histologie) dans une suspention de &lt;50 ul (figure 2). </li></ol> 4. L'administration intrapéritonéale des anticorps monoclonaux <ol><li> Ramassez la souris par la queue et la peau du cou (figure 3A). Immobiliser la souris par la peau du cou aussi près que possible theears (assurez-vous de prendre assez de peau pour que la souris cannotturn sa tête pour mordre la personne qui le manipule; figure 3B et 3C). </li><li> Stabiliser le doigt withthe petite queue délicatement pressé contre la paume de la main (figure 3D). </li><li> Nettoyer la zone d'injection d'éthanol à 70% avant de placer l'aiguille et aspirer à regarder de sang avant l'injection. </li><li> Utilisez le 26G1 / 2 à piercethe peau et abdominalmuscles pour injecter la solution contenant 500μg mAb (PBS, l'anticorps isotype contrôle ou de l'anticorps monoclonal à tester, dilué dans 1 ml de PBS) en gauche thelower ou quadrant inférieur droit abdominale (cavité péritonéale), avec l'animal dans la position tête en bas, en prenant soin d'éviter les organes andother membrane interne (figure 3F). </li><li> Attendez un peu avant de retirer l'needleto réduire la probabilité de fuite. </li><li> Attendre un minimum de deux heures avant de passer à l'étape suivante. </li></ol> 5. L'anesthésie de la souris et les infections par voie intranasale <ol><li> Préparer l'anesthésie avec kétamine et de xylazine à 100 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement. Effectuer l'administration intrapéritonéale de PBS, l'anticorps isotype contrôle, ou d'anticorps expérimentaux tels que décrits dans le protocole d'accompagnement écrite. Attendre deux heures après l'injection mAb avant anesthésier la souris et de procéder à l'infection intranasale. Préparer la kétamine et de xylazine l'anesthésie à l'aide à 100 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement (7). </li><li> Pendant la période de 2h d'attente, préparer l'inoculum capsulum Histoplasma comme décrit dans le protocole d'accompagnement écrite. </li><li> Procéder selon les Articles 5.1 à 5.5. Toe pincer les animaux avec une pincette et de vérifier l'absence de réflexe et de confirmer que l'anesthésie a travaillé. Après anesthésie, doucement suspendre la souris par ses dents de devant d'une chaîne de nylon ou de coton. Utilisez 2 stands colonne pour attacher les ficelles dans l'ordre de suspendre les animaux. </li><li> Lentement administrent environ 50 ul d'inoculum dans un nare aide d'une micropipette tout en surveillant étroitement le taux de respiration de la souris. Laissez la souris pour se reposer dans cette position pendant 2-5 min après l'infection intranasale pour faciliter le dépôt de la levure dans les poumons de l'animal (figure 3F). </li><li> Après la souris a été infectée, maintenir la souris dans un suivi, de l'environnement chaud (température entre 25 et 37 ° C), soigneusement en utilisant une lampe chauffante si nécessaire, jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie. Quand le réveil de la souris, c'est revenir à une cage propre avec un accès ad libitum à la nourriture et l'eau. Les cages sont retournés à notre animalerie et gardé dans une pièce les animaux purs (BLSI). </li></ol> 6. Études de survie <ol><li> Évaluer les animaux infectés et infectés cliniquement maquette de la tachypnée, léthargie, obnubilation et perte de poids. Les animaux doivent être vérifiées deux fois par jour par les membres de laboratoire et quotidiennement par les animaliers. </li><li> Avec l'histoplasmose murin, jusqu'à la fermeture à la fin de vie, il ya généralement aucun signe apparent de l'infection autre qu'une légère augmentation de la fréquence respiratoire. Avec la maladie est avancée, ce qui arrive habituellement de 10-11 jours, les souris deviennent significativement tachypnéique et ont une activité réduite. Typiquement, ils deviennent rapidement moribond et expirer. </li><li> Animaux en détresse doivent être euthanasiés de manière appropriée avec le CO 2 dans une chambre dédiée, les animaux décédés doivent être dénombrées quotidienne. </li></ol> 7. Études UFC, histologie et de cytokines <ol><li> Préparer 15 ml tubes coniques de 10 ml avec du PBS pour chaque organe à être collectées. </li><li> Euthanasier les animaux 7 et 14 jours après l'infection avec un inuculum sublétaux (5,0 x 10 6) comme montré précédemment et retirez les poumons, la rate et le foie immédiatement. </li><li> Supprimer un morceau de l'organe à être évalués et d'effectuer la fixation dans le formol durant la nuit. Les sections seront examinés au microscope pour l'évaluation pathologique. </li><li> Préparer des tubes de 50 ml conique avec 5mL de PBS complété avec 70 filtres de cellules um pour chaque organe à être homogénéisé. Laisser macérer chaque portion restante des organes séparément dans le tubes de 50 ml à l'aide pistons de la seringue stérile de 5 ml. </li><li> Ensuite, diluer en série homogénats d'organes (1:100, 1:1000 et 1:5000) et 100 ul de chaque dilution de la plaque sur gélose BHI-sang (2). </li><li> Ajouter comprimés inhibiteur de protéase à l'homogénats conformément aux instructions du fabricant (Roche, Allemagne). </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C pour un maximum de 14 jours et UFC énumérer. </li><li> Centrifuger les homogénats d'organes au 4000xg pendant 10 min et retirez surnageants orgue, whish sera utilisé dans utilisées dans les tests effectués cytokines par des méthodes standard selon le constructeur. </li></ol> 8. Protection anticorps monoclonal contre H. Capsulatum est dépendant de la spécificité des anticorps et Isotype <ol><li> MAb isotype est crucial dans la protection contre H. capsulatum, comme les souris traitées avec IgG1 ou d'anticorps monoclonaux IgG2a Hsp60 ont survie significativement prolongée par rapport aux souris témoins recevant un mAb IgG2b d'Hsp60 ou soit un isotype contrôle mAb ou PBS (figure 4). </li><li> En outre, chez les souris qui ont reçu des Acm de protection, il y avait une réduction significative du nombre de CFU pulmonaires et spléniques au jour 7 et diminue de 2 et 2,5 unités log de numéros de levure dans les poumons au jour 14 (figure 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Croissance de H. capsulatum et hybridomes. (A) la préparation liquide HAM F-12 de la culture d'une seule colonie obtenus à partir de H. capsulatum cultivé sur une gélose BHI-sang. (B) la croissance des hybridomes dans des flacons de culture cellulaire et de purification mAb par la protéine A la chromatographie en résine / G affinité en utilisant. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: H. préparation de l'inoculum capsulatum d'infection intranasale. Suspension cellulaire obtenue après H. capsulatum perturbations agrégats par seringue et de centrifugation est énuméré par comptage dans un hématimètre. La concentration cellulaire est ajustée à 1,25 x 10 7 (expériences de survie) ou 5 x 10 6 (UFC, de cytokines et de l'histologie) dans &lt;50 ul. upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Figure 3 "/&gt; Figure 3: la manipulation de la souris lors de mAb administration. (A) La souris est capté par la queue et (B et C) immobilisé par la tenue de la peau du cou aussi proche de theears. (D) La queue est tenue entre le petit doigt et de palme. (E) La solution est injectée mAb aide d'une aiguille 26G1 / 2. (F) Le H. capsulatum inoculum est administré par voie intranasale par un léger pipetage la suspension cellulaire dans un nare. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: MAbs d'Hsp60 peuvent altérer la pathogenèse de l'histoplasmose. injections ip avec 500 ug d'IgG1, IgG2a ou mAb 2 h avant l'infection à la survie significativement prolongée (p &lt;0,05, par rapport aux témoins), mais un mAb IgG2b. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5: UFC déterminations dans les poumons à 7 et 14 jours après un défi sublétaux intranasale avec des levures Hc 5x10 6 de souris traitées avec ip mAb choisi pour Hsp60 ou non pertinentes mAb a montré une réduction du fardeau fongique pour IgG1 et IgG2a mAbs animaux traités. Barres noires représentent UFC au jour 7 et barres blanches 14 jours post-infection (* p &lt;0,001 à 7 jours et ** p &lt;0,001 à 14 jours post-infection).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

Le protocole présenté ici démontre que MAB à H. capsulatum peut modifier le cours de l&#39;histoplasmose expérimental murin. MAbs d&#39;antigènes de surface cellulaire des pathogènes peuvent modifier la dynamique complexe qui se produisent lors de l&#39;interaction entre un hôte et un agent pathogène. Cette étude établit que mAb intervenir dans la protection dans un modèle murin de l&#39;histoplasmose mortelles lorsqu&#39;elles sont injectées par voie intrapéritonéale, et il suggère protéines candidates pour le...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de la Matière </th><th> Société </th></tr><tr><td> Enceinte de sécurité biologique (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubes coniques </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM F-12 moyennes </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C agitateur </td><td></td></tr><tr><td> Vortex </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubes coniques </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 aiguilles </td><td> BD </td></tr><tr><td> Seringue de 10 ml </td><td> BD </td></tr><tr><td> Flacons de 250 ml </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (Fast chromatographie liquide protéines) du système </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> Lecteur ELISA </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> Anesthésie (kétamine et xylazine) </td><td></td></tr><tr><td> Colonne stands </td><td></td></tr><tr><td> Cordes nylon </td><td></td></tr><tr><td> Lampe chauffante </td><td></td></tr><tr><td> Crépines cellules 70μm </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> Gélose BHI </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

l&#39;administration passive d&#39;anticorps monoclonaux contre h. capsulatum et autres pathogènes fongiques

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Le but de l&#39;utilisation de cette méthodologie est 1) pour faire progresser notre capacité de protéger les individus avec un anticorps ou un vaccin pour prévenir ou traiter l&#39;histoplasmose causée par le champignon Histoplasma capsulatum et 2) d&#39;examiner le rôle des facteurs de virulence comme cible pour la thérapie. Pour générer des AcM, les souris sont immunisées, les réponses immunitaires sont évalués en utilisant une phase solide système ELISA développée dans notre laboratoire, et la meilleure souris répondeur sont sélectionnés pour l&#39;isolement de splénocytes pour la fusion avec des cellules d&#39;hybridome. Souris C57BL / 6 ont été largement utilisées pour étudier H. pathogenèse capsulatum et de fournir le meilleur modèle pour obtenir les données requises. Afin d&#39;évaluer le rôle des anticorps monoclonaux dans l&#39;infection des souris par voie intrapéritonéale sont administrés avec soit mAb à H. capsulatum ou isotype témoin apparié mAb puis infectées soit par voie intraveineuse (iv), intrapéritonéale (ip) ou intranasale (in) itinéraires. Dans la littérature scientifique, l&#39;efficacité des anticorps monoclonaux pour des infections fongiques chez la souris repose sur la mortalité comme un point final, en collaboration avec les unités formin colonie (UFC) des évaluations à des moments plus tôt. Survie (le temps de la mort) des études sont nécessaires car ils représentent le mieux la maladie humaine. Ainsi, l&#39;efficacité de notre intervention ne serait pas suffisamment établie sans courbes de survie. Cela est également vrai pour établir l&#39;efficacité du vaccin ou des tests de mutants de virulence. Avec l&#39;histoplasmose, les souris vont souvent d&#39;être énergique pour morte pendant plusieurs heures. La capacité d&#39;une intervention telle que l&#39;administration d&#39;un anticorps monoclonal peut d&#39;abord protéger un animal de la maladie, mais la maladie peut rechutes qui ne serait pas réalisé dans les expériences de courte UFC. En plus de la survie et des dosages charge fongique, nous examinons les réponses inflammatoires à l&#39;infection (histologie, le recrutement cellulaire, les cytokines). Pour la survie / heure aux expériences de mort, les souris sont infectées et surveillées au moins deux fois par jour pour des signes de morbidité. Afin d&#39;évaluer la charge fongique, l&#39;histopathologie, et les réponses des cytokines, les souris sont euthanasiées à divers moments après l&#39;infection. Les expérimentations animales sont réalisées selon les directives de l&#39;Institut d&#39;études des animaux de l&#39;Albert Einstein College of Medicine.

Souris C57BL / 6 ont été utilisés pour étudier la pathogenèse Hc et de fournir le meilleur modèle. Nous explorons les avantages potentiels de l&#39;immunité humorale contre ce champignon et a généré plusieurs anticorps monoclonaux [à histone H2B et une protéine de choc thermique 60kDa] que nous avons testés pour leur efficacité protectrice après l&#39;administration par voie intrapéritonéale.

L&#39;administration passive d&#39;anticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques

L'objectif de l'utilisation de cette méthodologie est 1) d'améliorer notre capacité à protéger les individus grâce à des anticorps ou des vaccins pour prévenir ou traiter...

L'objectif général de cette procédure est d'améliorer notre capacité à protéger les individus à l'aide d'anticorps ou de vaccins afin de prévenir ou de traiter l'histoplasmose, et d'examiner le rôle des facteurs de virulence dans la pathogenèse de la maladie. Cela est réalisé en premier lieu en isolant et en caractérisant des anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes ciblés. La deuxième étape de la procédure consiste à administrer les anticorps monoclonaux sélectionnés par voie intrapéritonéale deux heures avant l'infection intranasale.Pour permettre à ces molécules de se répartir dans l'organisme, la troisième étape de la procédure consiste à anesthésier les souris et à les infecter par voie intranasale avec l'inoculum souhaité. La dernière étape de la procédure consiste à surveiller l'état de santé des animaux. Les animaux sont soit euthanasiés à différents intervalles pour déterminer la charge fongique et évaluer les réponses inflammatoires, soit suivis quant à leur survie.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant une prolongation de la survie et une modification des réponses pathologiques dans les organes affectés de souris infectées de manière létale. La procédure sera démontrée par Ally Emer, une étudiante postdoctorale possédant une vaste expérience en pathogénèse fongique et en modèles d'infection animale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les médicaments antifongiques, est que les anticorps monoclonaux sont des molécules dotées de propriétés thérapeutiques qui agissent en ciblant le facteur potentiel de l'hôte. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.L'administration d'anticorps monoclonaux et les étapes d'infection intranasale sont difficiles à apprendre car elles exigent une expertise dans la manipulation des animaux. Préparez une cabine de sécurité biologique de niveau deux pour travailler avec le champignon sous forme de levure en nettoyant la cabine avec de l'eau de Javel, suivie d'une irradiation UV. Préparez un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de PBS.Prélèvez une colonie de H caps AUM à partir d'un aliquot de stock congelé à moins 80 degrés Celsius, puis ajoutez-la au vortex de PBS. Homogénéisez vigoureusement les cellules et centrifugez à 1100 ×g pendant 10 minutes. À température ambiante, retirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot, puis ajoutez au moins 10 millilitres de PBS frais.Répétez cette procédure trois fois après le dernier lavage. Resuspendre les cellules dans cinq millilitres de PBS. Tous les lavages doivent être effectués à température ambiante. Pour rompre les agrégats cellulaires, faire passer les cellules de levure à travers une aiguille de calibre 26 et demi en utilisant une seringue de 10 millilitres, cinq fois, en recueillant les cellules de levure dans un tube conique de 50 millilitres.Pour isoler des levures de petite taille et de taille uniforme, centrifuger les cellules à 55 ×g pendant une minute, puis éliminer le millilitre supérieur. Ajouter la suspension cellulaire à un flacon Erlenmeyer en verre stérile de 250 millilitres contenant 100 millilitres de milieu Ham F12, puis faire croître les cellules à 37 °C pendant 48 heures dans un incubateur sous agitation à la concentration ambiante en dioxyde de carbone. Cette culture servira à préparer l'inoculum, et l'efficacité des anticorps monoclonaux générés à l'étape suivante sera évaluée.Faire croître les hybridomes sélectionnés dans du DMEM après cinq à sept jours. Après incubation, récolter les anticorps en prélevant tout le milieu du flacon de culture cellulaire, puis centrifuger le milieu à 1100 × g pendant 10 minutes. Comme pour les cellules de levure, les anticorps peuvent être lavés à température ambiante.Recueillir le surnageant sans perturber les culots. Ensuite, purifier le surnageant acellulaire à l'aide d'une résine protéine AG par capture F-P-L-C-A. Un Eli SA est utilisé pour calculer la concentration en anticorps monoclonal afin de déterminer la quantité d'anticorps purifié à injecter.Réalisez une administration intrapéritonéale d'anticorps contrôle d'isotype PBS ou d'anticorps expérimental par voie intrapéritonéale comme décrit dans le protocole écrit d'accompagnement. Attendez deux heures après l'injection de l'anticorps monoclonal avant d'endormir la souris et de procéder à l'infection intranasale pendant cette période d'attente. Préparez l'inoculum de *Histoplasma capsulatum* comme indiqué dans le protocole écrit d'accompagnement, puis montez le dispositif à corde pour l'infection de la souris en attachant fermement une corde en nylon ou en coton entre deux supports verticaux, puis en écartant les supports afin que la corde soit tendue.L'anesthésie au kétaamine à 100 milligrammes par kilogramme et au xylazine à 10 milligrammes par kilogramme. Peut également être préparée à ce moment-là, lorsque les anticorps ont eu suffisamment de temps pour se disperser. Anesthésier la souris et confirmer la sédation par l'absence de réponse au pincement des orteils.Pincer avec une pince. Suspendre délicatement la souris par ses dents antérieures au-dessus du fil. Administrer lentement environ 50 microlitres d'inoculum dans l'air à l'aide d'une micropipette.Tout en surveillant attentivement la fréquence respiratoire de la souris, laissez-la reposer dans cette position pendant deux à cinq minutes après l'infection intranasale afin de faciliter le dépôt de la levure dans les poumons de l'animal une fois infecté. Maintenez la souris dans un environnement chaud et surveillé, en utilisant soigneusement une lampe chauffante si nécessaire, jusqu'à ce qu'elle se rétablisse de l'anesthésie.Lorsque la souris se réveille, la ramener dans une cage propre. Avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau, évaluer cliniquement les animaux infectés et les animaux témoins non infectés. En cas de tachypnée, de léthargie ou de perte de poids, les animaux doivent être examinés deux fois par jour par les membres du laboratoire et une fois par jour par les soigneurs. Avec une histoplasmose murine jusqu'à la fin de la vie, il n'y a généralement aucun signe apparent de l'infection autre qu'une légère augmentation du rythme respiratoire. En cas de maladie avancée, les souris deviennent significativement apathiques et présentent une activité réduite. En général, elles se détériorent rapidement et décèdent.Les animaux en détresse doivent être euthanasiés de manière appropriée au dioxyde de carbone, dans une chambre dédiée. La mort doit être confirmée par l'absence de réponse réflexe à une pression sur les orteils ou à une pincée chez les animaux décédés, et ces décès doivent être dénombrés quotidiennement.Préparez des tubes coniques de 15 millilitres contenant 10 millilitres de PBS pour chaque organe à prélever. Euthanasiez les animaux infectés avec l'inoculum sub-létal de cinq fois 10 à la puissance six. Les cellules levuriennes comme indiqué précédemment, et prélèvez immédiatement les poumons, les rates et les foies ; préparez des tubes coniques de 50 millilitres contenant 5 millilitres de PBS.Montez une boîte de Pétri avec des tamis à cellules de 70 microns pour chaque organe à homogénéiser. Hacher chaque organe séparément à l’aide de pistons de cinq millilitres et transférer dans des tubes de 50 millilitres. Ensuite, diluez sérialement l’homogénat d’organe en trois dilutions : un à 100, un à 1001 à 5 000, et déposez 100 microlitres sur du BHI.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur avec un pourcentage normal de dioxyde de carbone pendant jusqu'à 14 jours et dénombrer les unités formant colonies (UFC) de l'anticorps monoclonal. L'isotype est essentiel pour la protection contre hcaps Lotum, car les souris traitées avec des anticorps monoclonaux IgG1 ou IgG2a dirigés contre HSP60 présentent une survie significativement prolongée par rapport aux souris contrôles recevant un anticorps monoclonal IgG2b dirigé contre HSP60 ou un anticorps monoclonal de contrôle d'isotype ou du PS. De plus, chez les souris ayant reçu des anticorps monoclononaux protecteurs, on observe une réduction significative du nombre d'UFC pulmonaires et spléniques au jour 7, ainsi qu'une diminution de deux et 2,5 unités logarithmiques du nombre de levures dans les poumons au jour 14. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la détermination de la charge en ugal indiquant l'unité formant colonies, l'analyse des cytokines impliquées dans l'infection et l'évaluation de la topologie, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la définition du mécanisme d'action de la modification de la maladie par les anticorps, lors de la mise en œuvre de cette procédure.Il est important de se rappeler de travailler dans des conditions de sécurité biologique lors de la manipulation du knock on et de respecter la réglementation en matière de soins aux animaux pour les infections intranasales.

passive-administration-monoclonal-antibodies-against-h-capsulatum

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre le score d'induction et cliniques d'un modèle animal de sclérose en plaques: chronique récurrente encéphalomyélite allergique expérimentale chez des rats DA. La maladie, provoquée par les rats immunisant avec une émulsion contenant la moelle épinière de rats et de toute l'adjuvant complet de Freund, présente des signes cliniques ressemblant à la maladie humaine.

Induction et notation clinique de chronique récurrente encéphalomyélite allergique expérimentale

Certaines souches de souris sont capables de résister à l'induction de l'encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) de myéline de base des protéines. Décrit ici est un protocole de vaccination simple qui renverse l'insensibilité et induit la maladie paralytique dans plusieurs types de souris EAE taches résistantes.

Surmonter Absence de réaction dans encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) souches de souris résistantes par transfert adoptif et une stimulation antigénique

Cette vidéo présente une technique d’homogénéisation efficace pour générer une émulsion antigène-adjuvant afin d’induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) dans un modèle murin. L’émulsion contient un auto-antigène – la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) – dans la phase aqueuse, entourée d’une phase huileuse continue comprenant une bactérie pathogène inactivée. L’émulsion assure une libération prolongée d’antigènes pour une réponse immunitaire prolongée.

PRÉPARATION D’UNE ÉMULSION ADJUVANTE D’ANTIGÈNE POUR INDUIRE UNE ENCÉPHALOMYÉLITE AUTO-IMMUNE

Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal établi de la sclérose en plaques. Souris C57BL / 6 sont immunisées avec la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), entraînant une paralysie flasque ascendante causée par des cellules immunitaires auto-réactifs dans le système nerveux central. Protocoles pour l'induction et la surveillance des maladies seront discutés.

Myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induit encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) dans C57BL / 6

Un protocole optimisé est présenté pour la génération d’anticorps monoclonaux basé sur la technologie des hybridomes. Les souris ont été immunisées avec un immunoconjugué. Les cellules de la rate ont été fusionnées par PEG et une impulsion électrique avec des cellules myélomateuses immortelles. Les cellules d’hybridome productrices d’anticorps ont été sélectionnées par THA et par criblage ELISA spécifique de l’antigène.

La génération d&#39;anticorps monoclonaux murins par Hybridoma Technology

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation et l’évaluation des anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels destinés à divers tests immunologiques. Cette procédure comprend l’immunisation, la fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte positive clone de dépistage, et la préparation de l’hybridome monoclonale. Les spécifications pour la caractérisation d’anticorps à l’aide de MALDI-TOF-MS et analyses ELISA sont également fournies.

Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels

Ce manuscrit présente un protocole pour induire l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale active (EAE) chez les souris. Une méthode pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes infiltrés dans le système nerveux central (SNC) est également présentée pour montrer comment les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune de CNS.

Analyse cytométrique du flux de l’infiltration de lymphocytes dans le système nerveux central pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale

Ce protocole décrit les étapes pour induire une uvéite mycobactérienne amorcée (PMU) chez la souris. Cette méthode décrit les étapes pour aider à produire une inflammation oculaire fiable et robuste dans le système de modèle murin. En utilisant ce protocole, nous avons généré des yeux uvéitiques et des yeux non enflammés à partir d’animaux uniques pour une évaluation plus approfondie avec des tests immunologiques, transcriptomiques et protéomiques.

L’uvéite mycobactérienne amorcée (UMP) comme modèle pour l’uvéite post-infectieuse

Pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose en plaques, les souris sont immunisées avec une émulsion eau dans huile contenant un autoantigène et un adjuvant de Freund complet. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la préparation de ces émulsions, un protocole d’homogénéisation rapide, simple et standardisé pour la préparation de l’émulsion est présenté ici.

Procédé d’homogénéisation rapide, simple et normalisé pour préparer des émulsions antigènes/adjuvants pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Ici, nous présentons un protocole alternatif pour induire activement l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez les souris C57BL / 6, en utilisant l’épitope immunogène myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 en suspension dans l’adjuvant de Freund incomplet contenant la sous-espèce paratuberculose de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.

Activité adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis dans l’amélioration de l’immunogénicité des autoantigènes au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Les souris sont généralement résistantes aux infections par Mycobacterium abscessus, ce qui complique la découverte et le développement d’antibiotiques indispensables contre les infections pulmonaires. Ici, nous décrivons une méthode de préparation d’inoculum et d’infection intratrachéale qui s’est avérée entraîner une infection durable chez les souris immunocompétentes.

Préparation de Mycobacterium abscessus enrobé de perle de gélose pour inoculer des souris immunocompétentes par voie intratrachéale

Découvrez l'administration d'anticorps monoclonaux pour lutter contre l'histoplasmose chez la souris C57BL/6. Cette méthode évalue l'efficacité protectrice et le rôle de l'immunité humorale contre Histoplasma capsulatum.

L'administration passive d'anticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques

Explorer plus de vidéos