Expansion, purification et d'évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une expansion rapide d'un grand nombre de cellules NK humaines. Ex vivo, commencez par isoler les p BMCs ou les cellules NK à partir d'un échantillon de culot globulaire ou de sang total. Ensuite, effectuez une co-culture des pbmc avec des cellules présentatrices d'antigènes artificielles dans le cadre de l'expansion des cellules NK.

Le milieu supplémenté en IL-2 permet de maintenir la culture de cellules NK pendant trois semaines, avec des stimulations hebdomadaires à l’aide de cellules APC, en veillant à conserver le nombre de cellules NK inférieur à 1 × 10⁶ par millilitre de milieu. Enfin, on valide l’efficacité fonctionnelle des cellules NK amplifiées à l’aide d’un test de cytotoxicité non radioactif. Un rendement typique de cellules NK obtenu selon ce protocole d’expansion aboutit à une amplification médiane de 21 000 fois au bout de 21 jours, les cellules ainsi obtenues présentant une forte cytotoxicité contre diverses tumeurs, comme déterminé par un test de libération calcique.

Ce protocole peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la biologie des cellules NK, car l'obtention de grands nombres de cellules NK a toujours été très difficile. Cette technique a des implications pour l'immunothérapie du cancer humain, puisqu'il a toujours été très difficile de produire un nombre suffisant de cellules NK pour ce type de traitement. La démonstration de cette technique sera assurée par Cecily, l'assistante de recherche principale de mon laboratoire, afin d'obtenir des PBMC à partir de sang de donneurs sains.

On utilise généralement le buffy coat de banque de sang comme source. Tout d'abord, ajouter du PBS pour ajuster le volume du buffy coat à 140 millilitres. Ensuite, déposer 35 millilitres d'échantillon sur 15 millilitres de fial PA pour la centrifugation de séparation par gradient à 400 G pendant 20 minutes.

Sans interruption. Récupérez soigneusement les BMC-P à l'interface plasma Fial PA et mettez de côté le tube des hématies pour une utilisation ultérieure. Lavez les BMC-P trois fois avec du PBS en centrifugeant chaque fois à 400 ×g pendant 10 minutes.

Utilisez cette fraction de P BMCs pour l'expansion des cellules NK. Revenez maintenant au tube de gradient. Aspirez le fi.

Appeler et transférer les globules rouges dans deux tubes de centrifugation de 50 millilitres, puis les laver avec du PBS ajouté jusqu’au trait de 50 millilitres. Après la centrifugation, aspirer le surnageant en raclant la surface de la couche de globules rouges. Pour éliminer les granulocytes.

Effectuez trois lavages, puis resuspendez les globules rouges dans un volume égal de solution else's et conservez à quatre degrés Celsius pendant un mois au maximum. Cette fraction de globules rouges peut être utilisée pour la purification par roséettes SEP des cellules NK à la fin de deux semaines d'expansion. Pour amplifier efficacement des cellules NK fonctionnelles ex vivo, utilisez les cellules de la souche K 5 62 clone nine exprimant l'IL-21 liée à la membrane, désignées ci-après comme K 5 62.

Neuf clones de cellules IL-21 sont utilisés comme cellules présentatrices d'antigène artificielles. Comptez d'abord les PBMC et calculez le volume nécessaire pour déposer cinq fois 10 à la puissance 6 cellules destinées à l'expansion des cellules NK, pour chaque compte de cinq fois 10 à la puissance 6 PBMC. Irradiez ensuite 10 fois 10 à la puissance 6 cellules K562 clone 9 IL-21 à l'aide d'un irradiateur gamma à 100 Gy. Les cellules irradiées peuvent également être congelées pour une utilisation ultérieure. Lavez maintenant les cellules préalablement irradiées avec du PBS et remettez-les en suspension dans le milieu d'expansion des cellules NK.

Observe maintenant un rapport de deux à un entre les cellules irradiées et les PBMC dans 40 millilitres de milieu de culture pour l'expansion des cellules NK, puis placez le flacon T75 verticalement dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone au jour trois. Récupérez les cellules stimulées par centrifugation à 400 ×g pendant cinq minutes, remplacez la moitié du milieu par du NKEM frais et poursuivez la culture. Répétez un changement de milieu au jour cinq. À la fin d'une semaine, comptez le nombre de cellules, mettez de côté cinq fois 10 à la puissance cinq cellules pour le phénotypage par cytométrie en flux, puis pour la deuxième stimulation, comptez et irradiez un rapport de un à un de K562.

Cloner neuf cellules IL-21 pour amplifier leurs cellules, puis combiner les cellules dans un milieu d'expansion des cellules NK à une concentration de 2,5 × 10⁵ cellules totales par millilitre. Observer maintenant les cellules dans des flacons T75 et poursuivre la culture aux jours 10 et 12 en repiquant les cellules dans un milieu d'expansion des cellules NK à 2,5 × 10⁵ cellules par millilitre au jour 14 de l'expansion. À nouveau, dénombrer les cellules et phénotyper un échantillon par cytométrie en flux.

Purifiez cet élargissement cellulaire dérivé de PBMC en utilisant le protocole de purification par séparation en gradient de rosette SEP et vérifiez la pureté des cellules NK par typage phénotypique en cytométrie en flux. Effectuez une troisième stimulation sur les cellules NK purifiées en utilisant un rapport un pour un de cellules K 5 62 clone neuf exprimant l'IL-21 irradiées. Enfin, au jour 21, analysez les cellules NK amplifiées par cytométrie en flux à l’aide d’un panel complet d’anticorps de typage phénotypique.

Congelez les stocks cellulaires dans du FBS contenant 10 % de DMSO à une densité maximale de cinq fois 10⁷ cellules par flacon. Utilisez des cellules NK fraîches ou congelées pour le test de cytotoxicité. Si vous utilisez des cellules NK congelées, décongelez d'abord le flacon de cellules NK et ensemencez-les dans du NKEM pendant 24 heures afin de permettre la récupération cellulaire le jour du test, resuspendez 10⁶ cellules cibles dans un millilitre de NKEM contenant du calcium am et incubez pendant une heure à 37 °C avec des agitations occasionnelles ; dans une plaque UBO 96 puits, ajoutez par triplicata 200 microlitres de cellules NK resuspendues à raison de 1 × 10⁶ cellules par millilitre et effectuez une dilution sérielle des cellules comme indiqué.

Après une heure de chargement en calcium, laver les cellules cibles dans le milieu d'expansion des cellules NK par deux centrifugations de cinq minutes à 400 ×g. Recompter ensuite les cellules cibles et les resuspendre à une concentration de 1 × 10⁵ cellules par millilitre. Ajouter 100 microlitres de cellules cibles dans chaque puits d'une plaque de 96 puits et centrifuger pendant une minute à 100 ×g pour initier le contact cellulaire, puis incuber à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures.

Afin de suspendre uniformément le calcium libéré, mélanger délicatement la culture en pipetant les cellules en culot à 100 ×g pendant cinq minutes, puis transférer 100 microlitres du surnageant dans une nouvelle plaque 96 puits à fond plat, en prenant soin d'éviter la formation de bulles ; si nécessaire, faire éclater toute bulle éventuelle à l’aide d’une aiguille fine. Lire la plaque à l’aide d’un lecteur de plaques à fluorescence réglé sur un filtre d’excitation de 485 nanomètres et un filtre d’émission de 530 nanomètres.

Calculer le pourcentage de lyse spécifique. Généralement, l'expansion de cinq fois 10 à la puissance 6 de PBMCS isolés à partir d'un buffy coat donne un rendement compris entre un fois 10 à la puissance 9 et 10 à la puissance 10. Les cellules NK, les cellules NK expansées expriment divers récepteurs de cellules NK comparables à ceux des cellules NK primaires non expansées présentes dans le buffy coat.

Les cellules NK peuvent représenter de 2 à 18 % des PBMC au jour 14. La purification par séparation sur rosette SEP des cellules amplifiées permet de récupérer de 40 à 70 % des cellules NK présentes en culture, avec une pureté des cellules NK de 99 %, indiquée par le marqueur CD trois. Les cellules NK amplifiées, négatives pour le CD 56 et positives pour le CD 56, ont démontré une cytotoxicité contre diverses lignées cellulaires tumorales, notamment le neuroblastome, la LAM, l'ostéosarcome et le mélanome.

Ici, la mort cellulaire A ML représentative est indiquée en pourcentage de lyse spécifique. La vidéo BIOT en direct montre la destruction par les cellules NK de la lignée cellulaire de neuroblastome CHP 134 chargée avec de l'amidon de calcium après cette procédure. D'autres méthodes, telles que l'analyse de la production de cytokines par les cellules NK et le transfert adaptatif dans des modèles animaux de tumeur, peuvent être réalisées, comme vous le savez, afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les fonctions des cellules NK.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment amplifier et purifier de grands nombres de cellules NK. Cela peut être réalisé directement à partir de cellules mononucléées du sang périphérique, puis les cellules NK sont purifiées, ou bien l'amplification peut être initiée en utilisant des cellules NK purifiées par la méthode des rosettes. Dès le départ, un culot globulaire typique fournit de 15 à 40 millions de cellules NK, toutes pouvant être utilisées pour amplifier un très grand nombre de cellules NK selon le protocole décrit dans cette méthode.