Name: Expansion, purification et dévaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Apprenez à développer et purifier des cellules NK humaines à partir de sang périphérique pour l'immunothérapie anticancéreuse. Cette méthode permet une expansion de 21 000 fois en 21 jours avec haute cytotoxicité tumorale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier Laurence Cooper, Harjeet Singh, et Lenka Hurton pour leur travail dans la création des premières K562 AAPC et mIL21 vecteurs de fusion. Le financement de ce travail a été fourni par le Programme UT MD Anderson Physician scientifique, la Fondation Saint-Baldrick, et les légendes de Friendswood.

1. Isolation des PBMC de Buffy Coat Cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont obtenues par centrifugation sur la densité de flottaison Ficoll-Paque d'échantillons de donneurs sains couche leuco-dérivé par cytaphérèse. <ol><li> La centrifugation Ficoll-Paque est faite selon le protocole du fabricant avec des modifications mineures. </li><li> Ajouter PBS pour un donneur normal-banque de sang buffy coat à un volume final de 140 ml (typique du volume buffy coat est de 40-70 ml). </li><li> Couche 35 ml d'échantillon sur la couche leuco-15 ml de Ficoll-Paque (4 tubes). </li><li> Centrifuger à 400g pendant 20 minutes sans frein. </li><li> Récupérer les PBMC du Ficoll-Paque: interface plasma, ne jetez pas les globules rouges au bas de l'Ficoll-Paque. </li><li> Lavez PBMC trois fois avec PBS, centrifugation à chaque fois à 400g pendant 10 minutes. </li><li> PBMC peuvent être utilisés directement pour l'expansion des cellules NK à ce stade ou les cellules NK peuvent être isolées par RosetteSep (section 4) </li><li> PBMC restantes peuvent être congelés dans FBS contenant 10% de DMSO dans l'azote liquide. </li><li> Aspirer le Ficoll et de recueillir les globules rouges de l'étape 5 en deux 50 ml tube de centrifugeuse, laver trois fois avec du PBS (ajouté à 50 ml marque), chaque fois aspirer le surnageant écrémage au sommet de la couche de RBC pour enlever les granulocytes. </li><li> Les globules rouges peuvent être utilisées immédiatement pour RosetteSep  purification des cellules NK (se référer à la section 4) ou stockées dans un volume égal de solution d'Alsever à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (Les globules rouges peuvent être enregistrer pour un maximum de 4 semaines). </li></ol> 2. L'expansion des cellules NK L'expansion des cellules NK peuvent être initiées en utilisant PBMC ou cellules NK purifiées. Le montant des PBMC utilisé pour l'expansion peut être modifiée en fonction de la quantité de cellules NK souhaité à la fin d'une expansion de trois semaines, se référer à des résultats représentatifs pour les détails. (Voir Note 1) STIMULATION 1 Jour 0 <ol><li> Pour chaque 6 5x10 PBMC d'être élargi, de comptage et d'irradier 10x10 6 K562 CL9 mIL21 l'aide d'un irradiateur gamma à 100 Gy. </li><li> Post-irradiation, laver les cellules avec du PBS et remettre en suspension dans l'expansion des cellules NK médias (Nkem). </li><li> Graine 5x10 6 PBMC par 10x10 6 irradiés K562 CL9 mIL21 (1:2) dans 40 ml de Nkem dans un flacon T75 et le placer en position verticale dans une étuve à 37 ° C et CO 2 5%. </li></ol> Jours 3 et 5 <ol start="4"><li> Récupérer les cellules par centrifugation à 400g pendant 5 minutes et remplacer la moitié des médias avec Nkem frais (ajouter IL2 frais pour l'ensemble du volume des médias) et continuer la culture. </li></ol> STIMULATION 2 Jour 7 <ol><li> Comptez le nombre de cellules en culture, à la fin d'une semaine. </li><li> Mettez de côté 5x10 5 cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux (voir note 2) </li><li> Pour chaque 6 5x10 cellules pour être restimulées, compter et irradient 5x10 6 K562 CL9 mIL21 l'aide d'un irradiateur gamma à 100 Gy. </li><li> Ajouter un nombre égal de irradié K562 CL9 mIL21 (1:1) et remettre en suspension dans Nkem au 2.5x10 5 cellules totales / ml (voir note 3). </li><li> Semences dans les cellules flacons T75 (maximum 50 ml par flacon). </li></ol> Jours 10 et 12 <ol start="6"><li> Comptez le nombre de cellules. </li><li> Changer ensemble des médias avec les Nkem frais basé sur le nombre de cellules (voir note 3). </li></ol> Jour 14 <ol start="8"><li> A la fin de deux semaines de l'expansion de compter le nombre de cellules en culture. </li><li> Mettez de côté 5x10 5 cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux (voir note 2) </li><li> Si l'expansion a commencé à partir de PBMC les cellules NK peuvent être purifiées à ce stade de l'expansion en utilisant le protocole de purification RosetteSep (se référer à la section IV). Si l'expansion a commencé à partir de cellules NK purifiées procéder à une stimulation 3. </li><li> Après purification mis de côté 5x10 5 cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux pour vérifier la pureté des cellules NK (comme dans l'étape 8). </li><li> Procéder à la stimulation 3 en utilisant l'ensemble des cellules NK purifiées (voir note 4). </li></ol> STIMULATION 3 <ol><li> Resuspendre les cellules NK avec irradiés K562 CL9 mIL21 (1:1) dans Nkem basée sur le nombre de cellules (voir note 3). </li></ol> Jours 17 et 19 <ol start="2"><li> Comptez le nombre de cellules. </li><li> Changer médias avec Nkem frais se basant sur le nombre de cellules (voir note 3). </li></ol> Jour 21 <ol start="4"><li> Au bout de trois semaines de l'expansion de compter le nombre de cellules en culture. </li><li> Récupérer 1x10 6 cellules pour une analyse de cytométrie en flux pour le panneau de cellules NK pleine d'anticorps phénotypage (voir tableau 1). </li><li> Gel dans les cellules SVF contenant du DMSO 10% à une densité maximum de 5x10 7 cellules par flacon pour une utilisation future. </li></ol> 3. Assay NK cytotoxicité cellulaire <ol><li> Décongelez un flacon de cellules NK et les semences dans Nkem, un jour avant performing test de cytotoxicité pour permettre la récupération. </li><li> Pour chaque test de cytotoxicité des cellules NK en utilisant une ligne seule cible cellulaire, 6x10 5 cellules NK et 3x10 5 cellules cibles sont nécessaires (voir note 5). </li><li> Préparer CAM-Media en diluant calcéine-AM (stock 1 mg / ml dans le DMSO) dans Nkem (voir note 6). </li><li> Resuspendre 10 6 cellules cibles dans 1 ml de CAM-médias (voir note 7). </li><li> Incuber pendant 1 h à 37 ° C, avec agitation occasionnelle. </li><li> Resuspendre les cellules NK au 1x10 6 cellules / ml et ajouter 200uL de suspension de cellules NK à chacun des 3 puits d'un U-96 puits à fond plat à 10 correspondants: 1 rapport E: T de la figure 1. (Voir note 8) </li><li> Ajouter 100 ul de milieu complet à tous les puits restants à l'exception des "maximum". </li><li> Ajouter 100 ul de 2% de Triton X-100 à "maximum". </li><li> Effectuer des dilutions en série des cellules NK pour le E 5 ultérieurs: les ratios T en transférant 100 ul de cellules à chaque fois, bien mélanger. Jeter 100ul du dernier puits (rapport E: T de 0.3125:1). </li><li> Après 1 heure de chargement calcéine, laver les cellules cibles dans Nkem deux fois, la centrifugation pendant 5 min à 1200 rpm. (Voir note 9) </li><li> Re-compter les cellules cibles et remettre à 1x10 5 cellules / ml. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules cibles dans chaque puits (1x10 4 / puits). Centrifuger 1 min à 100g à initier un contact cellulaire. </li><li> Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 4 heures. </li><li> Mélanger délicatement la culture par pipetage avec un pipetteur 100 pL afin d'uniforme suspendre la calcéine libérée, ralentit plaque à 100g pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules et transférer 100 ul du surnageant d'une nouvelle plaque en prenant soin d'éviter les bulles. Pop les bulles qui peuvent se former en utilisant une aiguille fine. </li><li> Lire la plaque à l'aide d'un lecteur de plaque fluorescente (filtre d'excitation 485 nm, filtre d'émission 530 nm). Lire Bas est recommandée. </li><li> Calculer pourcentage de lyse spécifique en fonction de la formule [(version version-test de spontanée) / (libération maximale - libération spontanée)] x 100. </li></ol> 4. Purification des cellules NK par RosetteSep <ol><li> Prenez 100 fois plus de globules rouges à celui des PBMC ou des cellules élargi, dans un tube de 50 ml (100:1 RBC: PBMC). </li><li> Si vous utilisez les globules rouges fraîches procéder directement à l'étape suivante ou si les globules rouges ont été entreposés dans une solution d'Alsever s, compter le nombre de globules rouges et de lavage approprié (100 excès de pli) quantité de globules rouges avec du PBS supplémenté avec 2% de FBS à trois reprises, la centrifugation à 1200 rpm pendant 10 minutes chaque fois. </li><li> Combinez les globules rouges avec des PBMC de l'étape 1.7 ou cellules élargi de l'étape 2.10 en PBS + 2% de FBS à un volume final de 1 mL par 5x10 7 cellules de PBMC ou élargi. </li><li> Ajouter 1 microlitre d'RosetteSep  Cocktail homme NK enrichissement cellulaire par 1x10 6 cellules de PBMC ou élargi. </li><li> Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 20 minutes avec mélange en douceur toutes les 5 minutes. </li><li> Ajouter un volume égal de PBS + 2% SVF mélangez délicatement et la couche sur le dessus du Ficoll-Paque. </li><li> Répétez les étapes de centrifugation sur Ficoll-Paque décrit pour l'isolement des PBMC (Section I). </li><li> Compter les cellules NK récupéré après purification et mis de côté 5x105 cellules pour phenotpying par cytométrie en flux pour la pureté des cellules NK (étape 8). </li></ol> 5. Remarques NOTE 1. Cellules NK peut être étendu directement à partir de PBMC, ou à partir de cellules RosetteSep  NK purifiées. Nous avons noté l'efficacité expansion similaire, mais certains donateurs peuvent avoir très faible nombre de cellules NK dans la purification résultant difficulté par RosetteSep avant l'expansion. NOTE 2. Nous utilisons régulièrement CD56-FITC, CD16-PE, et CD3-PE-Cy5 pour le phénotypage pendant l'expansion, énumérant les cellules NK comme ceux qui sont CD3-CD16-négatives et ou CD56-positives. NOTE 3. A chaque changement de support ou de stimulation, remettre les cellules à 2,5 x 10 5 / ml pour maintenir le nombre de cellules PBMC / NK à ou moins de 2 millions par ml à des stades de pointe de l'expansion. Cela permettra d'éviter l'épuisement des nutriments et aider à réaliser l'expansion maximale et de survie. NOTE 4. Le taux d'expansion NK est dépendante des donateurs et à la fin des stimulations 1 ou 2 une partie des cellules peuvent être congelées et une partie encore élargi en fonction de la nécessité d'expérimentation. Nous avons eu un bon succès dans l'utilisation des cellules congelées pour des extensions à une date ultérieure. NOTE 5. Afin de permettre à l'erreur, nous vous recommandons d'utiliser un minimum de 7x10 5 cellules NK remis en suspension dans 700 ULS du Nkem et 4x10 5 calcéine-AM cellules cibles teinté remis en suspension dans 4 ml de Nkem de mise en place du test de cytotoxicité. Si vous utilisez pipette multicanaux pour l'ensemencement des cellules cibles des volumes plus élevés de cellules (jusqu'à 6x10 5 à 6 ml) peuvent être nécessaires en fonction de la taille du bassin de média utilisé. Aussi le nombre des cellules NK sont recommandées spécifiquement pour le E: T ratios montrent dans le protocole, pour l'utilisation de plus E: T ratios augmententle nombre des cellules NK par mL en conséquence (par exemple pour un e 40:1: 4x10 T utilisent ratio de 6 cellules / ml) NOTE 6. Nous vous recommandons d'effectuer au préalable calcéine-AM de chargement de titrage pour la lignée cellulaire cible de choix, en utilisant les dilutions suivantes de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 et 1:100 pour obtenir la différence entre la libération optimale maximale et spontanée. NOTE 7. Lorsque vous utilisez une ligne de cellules adhérentes comme cible, d'abord préparer la suspension cellulaire unique à l'aide non-enzymatique des cellules tampon de dissociation. Si vous effectuez l'ADCC, de préparer un tube double de cellules cibles dans CAM-médias. NOTE 8 Si vous effectuez l'ADCC, ajouter mêmes cellules NK à 3 puits correspondant à 10h01 E:. T pour l'ADCC. Répétez l'opération pour les bailleurs de fonds supplémentaires. Répétez l'opération pour les cellules cibles supplémentaires. NOTE 9. Si vous effectuez une expérience ADCC, après 45 minutes de chargement calcéine, ajouter 10ug d'anticorps spécifiques pour induire l'ADCC contre les cellules cibles. Après 15 minutes de plus, se laver les cellules cibles dans un milieu complet à deux reprises, la centrifugation pendant 5 min à 1200 rpm. Resuspendre les cellules à 1x10 5 cellules / ml et procéder à l'étape suivante dans le protocole. 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Lorsque l'expansion est réalisée selon le schéma décrit ci-dessus, en utilisant 5x106 PBMC comme matériau de départ, typiques des cellules NK large rendements de 1x10 9 au 10 oct cellules (variabilité dépendante des donateurs). La figure montre l'expansion des cellules NK fois (n = 19) par rapport aux cellules NK présentes dans le produit original (médiane + / - quartile). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Les cellules NK expriment élargi différents récepteurs des cellules NK qui sont comparables à la non expansées primaires des cellules NK à quelques exceptions près (CD11b, CD160 et CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Récupération PBMC de Buffy manteau est dépendante des donateurs et peut aller de 6 à 300x10 800x10 6. Les cellules NK peuvent comporter de 2% - 18% des PBMC. Pour la purification des cellules RosetteSep élargi, la récupération des cellules NK pures au jour 14 varie de 40-70%. En suivant le protocole recommandé d'expansion et de la purification, la pureté des cellules NK de 99% peut être attendue. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Élargi les cellules NK ont démontré une cytotoxicité contre une gamme de lignées cellulaires tumorales, y compris le neuroblastome, le LAM, l'ostéosarcome et le mélanome (représentant AML tuant montré que la lyse pour cent spécifiques).

<ol><li>McKenna, D. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy%3A+a+six-year+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li>
<li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Klinische+Padiatrie%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li>
<li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li>
<li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li>
<li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56%2B+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li>
<li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li>
<li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets%3A+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li>
<li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li>
<li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A%2C+4-1BB+ligand%2C+and+interleukin-15%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li>
</ol>

L&#39;expansion des cellules NK et des médias d&#39;activation (Nkem) <ul><li> 90% du RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% sérum de veau fœtal (Gibco) </li><li> 1x pénicilline / streptomycine (Cellgro) </li><li> 1x L-glutamine (Gibco) <ul><li> Stériliser par filtration des médias avant l&#39;utilisation. </li></ul></li><li> 50 U / ml d&#39;IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc) <ul><li> - Dilué à partir d&#39;un 200 UI / ul stock. Ajouter IL2 à la quantité désirée de médias juste avant l&#39;utilisation à chaque fois. </li></ul></li></ul> Isolement cellulaire PBMC et NK <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Alsever solution (Sigma) </li><li> RosetteSep homme NK Cocktail enrichissement cellulaire (StemCell Technologies) </li></ul> Assay NK cytotoxicité cellulaire <ul><li> Calcéine-AM (Invitrogen) <ul><li> Solution stock est à 1 mg / ml, magasin de surgelés en 50 aliquotes. Dissoudre dans les médias pour atteindre Nkem dilution voulue pour la coloration des cellules. </li></ul></li></ul> Anticorps La liste des anticorps utilisés pour le phénotypage de cellules NK sont énumérés dans le tableau ci-dessous; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Anticorps </td><td> Volume par test </td><td> Société </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Tube 1 </td><td valign="top"> Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tube 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tube 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tube 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tube 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tube 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules nk humaines périphérique sang

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

Natural killer (NK) jouent un rôle important dans la surveillance immunitaire contre une variété de microorganismes infectieux et les tumeurs. La disponibilité limitée des cellules NK et capacité à développer in vitro, a restreint le développement de l&#39;immunothérapie des cellules NK. Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement de grandes quantités de cellules in vivo NK fonctionnelles ex K562 en utilisant des cellules exprimant membranaires IL21, comme une artificielle cellule présentatrice d&#39;antigène (VAMP). Thérapies des cellules NK adoptive à ce jour ont utilisé un produit cellulaire obtenu par l&#39;état stationnaire leucophérèse du donateur suivie par la déplétion des cellules T ou de la sélection positive des cellules NK. Le produit est généralement activé dans IL-2 pendant la nuit et ensuite administré le lendemain 1. En raison de la faible fréquence de cellules NK dans le sang périphérique, un nombre relativement restreint de cellules NK ont été livrés dans les essais cliniques. L&#39;incapacité à se propager dans les cellules NK in vitro a été le facteur limitant pour générer des nombres de cellules suffisant pour les résultats cliniques optimaux. Certains d&#39;expansion des cellules NK (5-10 fois plus 1-2 semaines) a être atteint par de fortes doses d&#39;IL-2 seul 2. L&#39;activation des cellules T autologues peuvent arbitrer l&#39;expansion des cellules NK, probablement aussi par la libération de cytokine local 3. Soutien à stroma mésenchymateux ou des cellules antigènes artificiels présentant (VAMP) peut soutenir l&#39;expansion des cellules NK à la fois du sang périphérique et le sang du cordon 4. Combiné NKp46 et l&#39;activation par des anticorps CD2 billes recouvertes soit actuellement commercialisé pour l&#39;expansion des cellules NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), entraînant une dilatation environ 100 fois en 21 jours. Des essais cliniques utilisant VAMP-expansé ou activées par les cellules NK sont en cours, l&#39;un utilisant la lignée cellulaire leucémique CTV-1 aux cellules NK et d&#39;activer le Premier 5 sans expansion significative. Un deuxième essai utilise EBV LCL pour l&#39;expansion des cellules NK, la réalisation d&#39;une expansion dire 490 fois en 21 jours 6. La troisième utilise une VAMP K562 basé transduites avec 4-1BBL (CD137L) et membranaires de l&#39;IL-15 (mIL-15) 7, qui a réalisé une expansion signifie NK 277 fois en 21 jours. Bien que, les cellules NK étendu en utilisant K562-41BBL-mIL15 VAMP sont hautement cytotoxique in vitro et in vivo par rapport aux non expansées cellules NK, et de participer à l&#39;ADCC, leur prolifération est limitée par la sénescence attribués à 8 raccourcissement des télomères. Plus récemment une expansion de 350 fois des cellules NK a été rapportée en utilisant K562 exprimant MICA, 4-1BBL et IL15 9. Notre méthode de l&#39;expansion des cellules NK décrits aux présentes produit prolifération rapide de cellules NK, sans atteindre la sénescence une expansion médiane 21 000 fois en 21 jours.

Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement et de purifier de grands nombres de cellules NK humaines et d&#39;évaluer leur fonction.

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Les cellules Natural Killer (NK) jouent un rôle important dans la surveillance immunitaire contre divers micro-organismes infectieux et les tumeurs. La disponibilité limitée de...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une expansion rapide d'un grand nombre de cellules NK humaines. Ex vivo, commencez par isoler les p BMCs ou les cellules NK à partir d'un échantillon de culot globulaire ou de sang total. Ensuite, effectuez une co-culture des pbmc avec des cellules présentatrices d'antigènes artificielles dans le cadre de l'expansion des cellules NK.Le milieu supplémenté en IL-2 permet de maintenir la culture de cellules NK pendant trois semaines, avec des stimulations hebdomadaires à l’aide de cellules APC, en veillant à conserver le nombre de cellules NK inférieur à 1 × 10⁶ par millilitre de milieu. Enfin, on valide l’efficacité fonctionnelle des cellules NK amplifiées à l’aide d’un test de cytotoxicité non radioactif. Un rendement typique de cellules NK obtenu selon ce protocole d’expansion aboutit à une amplification médiane de 21 000 fois au bout de 21 jours, les cellules ainsi obtenues présentant une forte cytotoxicité contre diverses tumeurs, comme déterminé par un test de libération calcique.Ce protocole peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la biologie des cellules NK, car l'obtention de grands nombres de cellules NK a toujours été très difficile. Cette technique a des implications pour l'immunothérapie du cancer humain, puisqu'il a toujours été très difficile de produire un nombre suffisant de cellules NK pour ce type de traitement. La démonstration de cette technique sera assurée par Cecily, l'assistante de recherche principale de mon laboratoire, afin d'obtenir des PBMC à partir de sang de donneurs sains.On utilise généralement le buffy coat de banque de sang comme source. Tout d'abord, ajouter du PBS pour ajuster le volume du buffy coat à 140 millilitres. Ensuite, déposer 35 millilitres d'échantillon sur 15 millilitres de fial PA pour la centrifugation de séparation par gradient à 400 G pendant 20 minutes.Sans interruption. Récupérez soigneusement les BMC-P à l'interface plasma Fial PA et mettez de côté le tube des hématies pour une utilisation ultérieure. Lavez les BMC-P trois fois avec du PBS en centrifugeant chaque fois à 400 ×g pendant 10 minutes.Utilisez cette fraction de P BMCs pour l'expansion des cellules NK. Revenez maintenant au tube de gradient. Aspirez le fi.Appeler et transférer les globules rouges dans deux tubes de centrifugation de 50 millilitres, puis les laver avec du PBS ajouté jusqu’au trait de 50 millilitres. Après la centrifugation, aspirer le surnageant en raclant la surface de la couche de globules rouges. Pour éliminer les granulocytes.Effectuez trois lavages, puis resuspendez les globules rouges dans un volume égal de solution else's et conservez à quatre degrés Celsius pendant un mois au maximum. Cette fraction de globules rouges peut être utilisée pour la purification par roséettes SEP des cellules NK à la fin de deux semaines d'expansion. Pour amplifier efficacement des cellules NK fonctionnelles ex vivo, utilisez les cellules de la souche K 5 62 clone nine exprimant l'IL-21 liée à la membrane, désignées ci-après comme K 5 62.Neuf clones de cellules IL-21 sont utilisés comme cellules présentatrices d'antigène artificielles. Comptez d'abord les PBMC et calculez le volume nécessaire pour déposer cinq fois 10 à la puissance 6 cellules destinées à l'expansion des cellules NK, pour chaque compte de cinq fois 10 à la puissance 6 PBMC. Irradiez ensuite 10 fois 10 à la puissance 6 cellules K562 clone 9 IL-21 à l'aide d'un irradiateur gamma à 100 Gy. Les cellules irradiées peuvent également être congelées pour une utilisation ultérieure. Lavez maintenant les cellules préalablement irradiées avec du PBS et remettez-les en suspension dans le milieu d'expansion des cellules NK.Observe maintenant un rapport de deux à un entre les cellules irradiées et les PBMC dans 40 millilitres de milieu de culture pour l'expansion des cellules NK, puis placez le flacon T75 verticalement dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone au jour trois. Récupérez les cellules stimulées par centrifugation à 400 ×g pendant cinq minutes, remplacez la moitié du milieu par du NKEM frais et poursuivez la culture. Répétez un changement de milieu au jour cinq. À la fin d'une semaine, comptez le nombre de cellules, mettez de côté cinq fois 10 à la puissance cinq cellules pour le phénotypage par cytométrie en flux, puis pour la deuxième stimulation, comptez et irradiez un rapport de un à un de K562.Cloner neuf cellules IL-21 pour amplifier leurs cellules, puis combiner les cellules dans un milieu d'expansion des cellules NK à une concentration de 2,5 × 10⁵ cellules totales par millilitre. Observer maintenant les cellules dans des flacons T75 et poursuivre la culture aux jours 10 et 12 en repiquant les cellules dans un milieu d'expansion des cellules NK à 2,5 × 10⁵ cellules par millilitre au jour 14 de l'expansion. À nouveau, dénombrer les cellules et phénotyper un échantillon par cytométrie en flux.Purifiez cet élargissement cellulaire dérivé de PBMC en utilisant le protocole de purification par séparation en gradient de rosette SEP et vérifiez la pureté des cellules NK par typage phénotypique en cytométrie en flux. Effectuez une troisième stimulation sur les cellules NK purifiées en utilisant un rapport un pour un de cellules K 5 62 clone neuf exprimant l'IL-21 irradiées. Enfin, au jour 21, analysez les cellules NK amplifiées par cytométrie en flux à l’aide d’un panel complet d’anticorps de typage phénotypique.Congelez les stocks cellulaires dans du FBS contenant 10 % de DMSO à une densité maximale de cinq fois 10⁷ cellules par flacon. Utilisez des cellules NK fraîches ou congelées pour le test de cytotoxicité. Si vous utilisez des cellules NK congelées, décongelez d'abord le flacon de cellules NK et ensemencez-les dans du NKEM pendant 24 heures afin de permettre la récupération cellulaire le jour du test, resuspendez 10⁶ cellules cibles dans un millilitre de NKEM contenant du calcium am et incubez pendant une heure à 37 °C avec des agitations occasionnelles ; dans une plaque UBO 96 puits, ajoutez par triplicata 200 microlitres de cellules NK resuspendues à raison de 1 × 10⁶ cellules par millilitre et effectuez une dilution sérielle des cellules comme indiqué.Après une heure de chargement en calcium, laver les cellules cibles dans le milieu d'expansion des cellules NK par deux centrifugations de cinq minutes à 400 ×g. Recompter ensuite les cellules cibles et les resuspendre à une concentration de 1 × 10⁵ cellules par millilitre. Ajouter 100 microlitres de cellules cibles dans chaque puits d'une plaque de 96 puits et centrifuger pendant une minute à 100 ×g pour initier le contact cellulaire, puis incuber à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures.Afin de suspendre uniformément le calcium libéré, mélanger délicatement la culture en pipetant les cellules en culot à 100 ×g pendant cinq minutes, puis transférer 100 microlitres du surnageant dans une nouvelle plaque 96 puits à fond plat, en prenant soin d'éviter la formation de bulles ; si nécessaire, faire éclater toute bulle éventuelle à l’aide d’une aiguille fine. Lire la plaque à l’aide d’un lecteur de plaques à fluorescence réglé sur un filtre d’excitation de 485 nanomètres et un filtre d’émission de 530 nanomètres.Calculer le pourcentage de lyse spécifique. Généralement, l'expansion de cinq fois 10 à la puissance 6 de PBMCS isolés à partir d'un buffy coat donne un rendement compris entre un fois 10 à la puissance 9 et 10 à la puissance 10. Les cellules NK, les cellules NK expansées expriment divers récepteurs de cellules NK comparables à ceux des cellules NK primaires non expansées présentes dans le buffy coat.Les cellules NK peuvent représenter de 2 à 18 % des PBMC au jour 14. La purification par séparation sur rosette SEP des cellules amplifiées permet de récupérer de 40 à 70 % des cellules NK présentes en culture, avec une pureté des cellules NK de 99 %, indiquée par le marqueur CD trois. Les cellules NK amplifiées, négatives pour le CD 56 et positives pour le CD 56, ont démontré une cytotoxicité contre diverses lignées cellulaires tumorales, notamment le neuroblastome, la LAM, l'ostéosarcome et le mélanome.Ici, la mort cellulaire A ML représentative est indiquée en pourcentage de lyse spécifique. La vidéo BIOT en direct montre la destruction par les cellules NK de la lignée cellulaire de neuroblastome CHP 134 chargée avec de l'amidon de calcium après cette procédure. D'autres méthodes, telles que l'analyse de la production de cytokines par les cellules NK et le transfert adaptatif dans des modèles animaux de tumeur, peuvent être réalisées, comme vous le savez, afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les fonctions des cellules NK.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment amplifier et purifier de grands nombres de cellules NK. Cela peut être réalisé directement à partir de cellules mononucléées du sang périphérique, puis les cellules NK sont purifiées, ou bien l'amplification peut être initiée en utilisant des cellules NK purifiées par la méthode des rosettes. Dès le départ, un culot globulaire typique fournit de 15 à 40 millions de cellules NK, toutes pouvant être utilisées pour amplifier un très grand nombre de cellules NK selon le protocole décrit dans cette méthode.

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons ici une méthode pour l'activation et l'expansion des cellules NKT de gros populations de cellules T en utilisant des cellules présentant l'antigène artificielles (VAMP). L'utilisation de CD1d basée aAPC offre une méthode normalisée pour générer des nombres élevés de cellules NKT fonctionnelles.

Présentatrice d&#39;antigène artificielle d&#39;activation à médiation cellulaire (AAPC) et l&#39;expansion des cellules T tueuses naturelles

Cette vidéo présente une technique d’expansion de cellules tueuses naturelles (NK) directement à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à l’aide d’une lignée cellulaire nourricière. Les PBMC sont co-cultivées avec des cellules nourricières lymphoblastoïdes génétiquement modifiées exprimant l’interleukine-21 liée à la membrane (mIL-21), et la culture est complétée par les cytokines interleukine-2 (IL-2) et interleukine-15 (IL-15). Ensemble, ce cocktail de ligands conduit à...

Expansion ex vivo de cellules tueuses naturelles à partir de cellules mononucléées du sang périphérique

Ce protocole décrit le développement, l'expansion et l'imagerie in vivo des cellules NK dérivées de CSEh et iPSCs.

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

Nous présentons ici un protocole adapté qui peut être utilisé pour générer un grand nombre de lymphocytes T tueurs naturels invariants murins à partir de la rate de souris. Le protocole décrit une approche par laquelle les cellules spléniques iNKT peuvent être enrichies, isolées et développées in vitro à l’aide d’un nombre limité d’animaux et de réactifs.

Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Un protocole d’étude des événements induits par FcγRIIIa par des anticorps thérapeutiques dans des cellules tueuses naturelles humaines est décrit ici. Cette plate-forme de stimulation artificielle permet d’interroger les fonctions effectrices en aval telles que la dégranulation, la production de chimiokines / cytokines et les voies de signalisation médiées par les parties FcγRIIIa et Fc des anticorps impliqués dans la liaison.

Évaluation des événements des cellules tueuses naturelles humaines provoquées par l’engagement de FcγRIIIa en présence d’anticorps thérapeutiques

Nous décrivons un protocole rapide et robuste pour enrichir les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) de la rate de souris et les étendre in vitro à des nombres appropriés pour des études in vitro et in vivo.

Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo

Ici, nous présentons une méthode pour développer le tueur naturel du sang périphérique (PBNK), les cellules NK des tissus hépatiques et les cellules du récepteur antigénique chimérique (CAR)-NK dérivées de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ou du sang de cordon (CB). Ce protocole démontre l’expansion des cellules NK et CAR-NK à l’aide de cellules nourricières 221-mIL-21 en plus de la pureté optimisée des cellules NK expansées.

TUEUR NATUREL (NK) ET PROCÉDÉ D’EXPANSION CELLULAIRE CAR-NK UTILISANT UNE LIGNÉE CELLULAIRE B MODIFIÉE PAR UNE LIGNÉE CELLULAIRE B LIÉE À LA MEMBRANE

Le présent protocole montre comment différencier les cellules CD3−/CD45+CD56+ présentant une cytotoxicité légère des cellules souches à potentiel élargi humain (CSEPH) dans des conditions de culture 3D et 2D. Cela permet une validation phénotypique de routine sans la destruction du microenvironnement complexe.

Production de cellules tueuses naturelles à partir de cellules souches humaines à potentiel élargi

Apprenez à développer et purifier des cellules NK humaines à partir de sang périphérique pour l'immunothérapie anticancéreuse. Cette méthode permet une expansion de 21 000 fois en 21 jours avec haute cytotoxicité tumorale.

Expansion, purification et d'évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Explorer plus de vidéos