Name: Une façon simple de mesurer la sensibilité déthanol dans les mouches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Découvrez une méthode simple pour mesurer la sensibilité à l'éthanol chez Drosophila melanogaster en utilisant le test de perte du réflexe de redressement. Cette technique permet d'évaluer les différences de sensibilité entre souches.

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Nous remercions Aylin Rodan pour la lecture critique du manuscrit, et des membres du laboratoire de discussion utile. Cette recherche est soutenue par le NIH, R01AA019526.

1. Créer la chambre d'exposition <ol><li> Couper un bouchon de flacon de moitié l'aide d'une lame de rasoir. Sinon, utiliser des balles de coton. </li><li> Poussez la moitié prise flacon ou la boule de coton, au fond d'un flacon de nourriture pour faire une surface lisse qui vole sera pas coincé po </li><li> Si vous faites des chambres d'exposition multiple, assurez-vous que la fiche du flacon et de la nourriture prennent le même volume dans chaque chambre. Une marque sur le côté du flacon peut faciliter ce processus. </li></ol> 2. Exposer les mouches <ol><li> Collecter 8 mouches d'un sexe, d'âge 1-5 jours, la veille de l'exposition dans des flacons nourriture régulière, sans levure. </li><li> Les étiqueter dans le code, tels que l'expérimentateur est aveuglé au génotype réel / souche utilisée. </li><li> Transfert des huit mouches dans les chambres de l'exposition en appuyant sur. Ne pas anesthésier. </li><li> Ajouter une petite quantité de colorant alimentaire, par exemple l'acide bleu 9, à 200 d'éthanol la preuve pour le rendre facilement visible. </li><li> Napper le fond d'un plug flacon, ou boule de coton, avec 0,5 ml d'éthanol. </li><li> Insérez la fiche d'éthanol dans le flacon de l'exposition. Assurez-vous que l'alcool est confronté dans le flacon, et non pas vers la paroi du flacon. </li><li> Démarrer un compte à rebours jusqu'à. </li></ol> 3. Enregistrement d'éthanol-intoxication <ol><li> Chaque minute après le chronomètre est lancé, appuyez sur la chambre d'exposition sur le banc pour faire sursauter les mouches et les observer pendant dix secondes. </li><li> Notez le nombre de mouches stationnaires pour chaque minute. Les mouches sont stationnaires si elles ne peuvent pas sortir leur dos, rester dans un endroit, ou rapidement vibrer leurs ailes à travers l'ensemble de dix secondes d'observation période. Les mouches derniers sont considérés comme stationnaires car la grande majorité de ces mouches sont stationnaires entre les périodes de mouvement d'ailes rapides. Les mouches ne sont pas stationnaires si elles peuvent obtenir sur leur dos et de pied et / ou sur le mur du flacon. </li><li> Un essai d'exposition est terminée lorsque 4 ou plus de mouches sont enregistrés comme stationnaire. </li><li> Jeter les mouches et laissez l'air chambre d'exposition à pour une réutilisation ultérieure. </li></ol> 4. Déterminer le temps de la sédation de 50% Le temps d'une sédation de 50% (ST50) est le temps après le début de l'exposition à l'éthanol, alors que quatre des huit mouches restent stationnaires. Ceci est déterminé comme suit: Soit: la minute la première mesure où exactement quatre mouches sont stationnaires. Ou: si moins de quatre mouches (Y1) sont stationnaires à un moment donné du temps (minute X), et plus de quatre (Y2) au point de mesure du temps suivant (minute X +1), puis interpoler linéairement du ST50 en utilisant la formule: ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X 5. Répétez l'exposition afin de déterminer la tolérance Exposer les mouches <ol><li> Déterminer le ST50 (en poids) pour la souche contrôle sauvage utilisé dans votre expérience. </li><li> Exposer les groupes expérimentaux de mouches à l'éthanol comme décrit ci-dessus. </li><li> Mesurer leur ST50 (1), mais continuer à exposer jusqu'à l'époque 2x ST50 (en poids). </li><li> Transférer les mouches de nouveau dans une fiole de nourriture vides, et tenir pendant 4 heures. </li><li> Re-exposer les mouches, et de déterminer le ST50 (2) de l'exposition 2. </li></ol> Déterminer la tolérance Calculer la tolérance en% en (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100. 6. Les résultats représentatifs: Montré ici, quelques résultats représentatifs, nous avons obtenu avec 6-8 flacons de mouches par le génotype et la dose. Si votre erreur standard est sensiblement plus grand, puis un problème systématique s'est probablement produite. Assurez-vous que l'éthanol visages dans les chambres de l'exposition, et que les chambres sont au même volume. <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Courbe dose-réponse de type sauvage mouches exposées à des pourcentages croissants d'éthanol. Huit flacons de mouches ont été exposées par dose et le sexe. Mouches mâles et femelles montrent le ST50 même à chaque dose (p&gt; 0,22, 2-way ANOVA), tandis que le ST50 travers doses diminue considérablement avec la dose d'éthanol augmente (p &lt;0,001). Notez que les mouches à partir surpeuplés bouteilles peuvent être sensiblement plus petits que ceux à partir de bouteilles en bonne santé, et cette différence de taille peut affecter le ST50. Semences chaque bouteille avec des femelles de 15 à 20 de pose de 1-2 jours pour obtenir la densité larvaire optimale par bouteille. <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Exposer mouches soit de l'éthanol à 90%, ou 100% reproduit le décrit précédemment éthanol-résistance provoquée par le blanc rabbit1 mutation2 (p &lt;0,001, 2-way ANOVA). <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Répétez l'exposition à l'éthanol 100%, espacées par un intervalle de récupération de 4 heures, provoque une augmentation significative de la ST50 après la seconde exposition (p &lt;0,001, t apparié-Test). Notez que les mouches ont été exposées pendant 24 minutes pendant la première exposition (correspondant à deux fois leur ai na ST50). D'exposition pour un court laps de temps (12 minutes) n'a pas provoqué une augmentation significative du ST50 sur la ré-exposition (données non présentées).

<ol><li>Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).</li>
<li>Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).</li>
<li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
</ol>

Dans cette présentation, nous avons défini une méthode simple pour déterminer l&#39;éthanol intoxication volontaire basée sur des essais antérieurs décrits par Bainton et al. 2000 1, et Rothenfluh et al. 2006 2. Puisque l&#39;alcool sédation induite est corrélé avec la préférence boire de l&#39;alcool 3, ce test est pertinent pour l&#39;étude des troubles liés à l&#39;alcool. Le test décrit est basé sur sursaut induite géotaxie négative, et comment une exposition à l&#39;alcool interfère avec cette réponse innée. Avant de commencer l&#39;exposition, vérifiez que tous vos mouches montrent une réaction normale à un tel sursaut, c&#39;est à dire après avoir appuyé sur le bas les mouches dans le flacon alimentaires, ils devraient tous passer du fond dans un délai de 10 secondes d&#39;observation. Exemples de mouches ayant réduit géotaxie négatifs comprennent la saisie des mutants sensibles bang-5, et la locomotion déficientes mouches causée par la dégénérescence des neurones dopaminergiques 6. Même si le dosage décrit est relativement simple, deux variables méritent le plus d&#39;attention afin d&#39;assurer des résultats reproductibles. D&#39;abord, tous les flacons de l&#39;exposition devrait être le même volume. Cela comprend en s&#39;assurant que le fond du flacon contenant le même volume de nourriture + flacon Plug / coton balle, ainsi que d&#39;insérer la fiche contenant de l&#39;éthanol à la même distance pour chaque flacon. Un flacon complètement vide peut être utilisé pour ce test, mais elle conduit à des valeurs plus ST50, en diminuant le débit de l&#39;essai. Ce test est également approprié pour déterminer la quantité de mouches de tolérance se développer après exposition à l&#39;éthanol répéter. Un certain nombre de variables doivent être considérés lorsque vous faites des expositions répétées. Tout d&#39;abord, l&#39;intervalle entre l&#39;exposition est ici décrit comme 4 heures. Cette variable peut être changé, mais nous recommandons de ne pas être inférieure à 2 heures, pour assurer un dégagement d&#39;éthanol à partir de la première exposition. Voir Scholz et al. 2000 4 pour la cinétique de développement tolérance à l&#39;éthanol et de décadence. La seconde variable à considérer est la durée de la première exposition. Ceci a évidemment être le même pour le contrôle et les mouches expérimental. Toutefois, cela peut ne pas aboutir à la même quantité d&#39;éthanol livré à ces deux souches voler. Mouches Sedated absorber plus d&#39;éthanol que les mouches actif 2, donc une souche qui endort tôt peuvent recevoir une dose supérieure à une souche plus tard, sédatifs, et ainsi développer plus de tolérance en raison d&#39;une dose initiale plus élevée. Nous fermement en garde le lecteur lorsque l&#39;on compare le développement de souches de la tolérance qui montrent des différences dans le ST50 initiale (1). Le test que nous décrivons ici est un outil utile pour facilement et de façon reproductible la détermination des réponses comportementales des mouches à l&#39;alcool.

<table><tbody><tr><td>Flacons d'exposition</td><td>www.flystuff.com</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons</td><td>www.flystuff.com</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>Acide bleu 9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861146</td><td></td></tr></tbody></table>

une façon simple de mesurer la sensibilité d&#39;éthanol dans les mouches

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

De faibles doses d&#39;éthanol provoquer des mouches pour devenir hyperactif, tandis que des doses élevées sont sédatifs. La sensibilité à l&#39;éthanol induit une sédation d&#39;une souche donnée volée est corrélée avec la préférence d&#39;éthanol que la souche S, et donc la sédation est une mesure très pertinente pour étudier la génétique des réponses d&#39;alcool et de boire. Nous démontrons un moyen simple d&#39;exposer des mouches à l&#39;éthanol et mesurer ses effets enivrants. Le test que nous décrivons peut déterminer la sensibilité aiguë, ainsi que la tolérance éthanol induite par une exposition répétée. Il ne nécessite pas une configuration technique impliqués, et peuvent donc être appliquées dans n&#39;importe quel laboratoire avec les outils de base de la culture voler.

Un test simple pour mesurer les effets sédatifs de l&#39;éthanol sur<em&gt; Drosophile</em&gt; Mouches, fondée sur la perte du réflexe de redressement, est décrite.

Une façon simple de mesurer la sensibilité d&#39;éthanol dans les mouches

De faibles doses d'éthanol rendent les mouches hyperactives, tandis que des doses élevées ont un effet sédatif. La sensibilité à la sédation induite par l'éthanol d'une souche de mouches donnée...

Bonjour, je suis Thomas Maples du laboratoire du Dr. Adrian Rothen flu du Département de psychiatrie du centre médical UT Southwestern à Dallas. Aujourd'hui, je vais démontrer une procédure simple permettant de déterminer la sensibilité des mouches à la sédation par l'éthanol. Cet essai repose sur la perte par les mouches du réflexe de redressement et de leur capacité à marcher après une exposition à l'éthanol.Cette mesure peut être utilisée pour déterminer les différences de sensibilité à l'alcool entre différentes souches de drosophiles et mutants. Nous pouvons également utiliser ce test pour induire une tolérance chez les mouches, la tolérance étant une réponse réduite à l'alcool après des expositions répétées. Commençons.Pour cette expérience, vous aurez besoin des flacons suivants. Avec huit mouches à fruits, un échantillon que vous avez collecté un ou deux jours auparavant. Vous pouvez réaliser les expositions avec des mâles ou des femelles.Cependant, chaque flacon ne doit contenir qu'un seul sexe. Un flacon d'aliment vide qui ne contient pas de mouches, un rasoir, deux bouchons de flacon en un matériau semblable au coton. Si vous n'avez pas ce type de bouchons, vous pouvez également utiliser des boules de coton, une micropipette de 1000 microlitres avec des embouts, de l'éthanol à 200 degrés preuve contenant un colorant alimentaire que vous pouvez trouver dans n'importe quel supermarché et un minuteur.La première chose à faire est de créer une chambre d'exposition dans laquelle nous exposerons les mouches à l'éthanol et surveillerons leur mobilité. Pour fabriquer cette chambre, commencez par couper en deux un bouchon de vial à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, insérez une des moitiés au fond d’un vial en recouvrant la nourriture.Cela crée une surface plane et non collante sur laquelle les mouches peuvent marcher. Si vous utilisez une boule de coton, appuyez-la uniformément et tâchez de la rendre aussi peu duveteuse que possible afin que les mouches ne restent pas coincées dans les fils de coton. Si vous préparez plusieurs chambres, veillez à ce que la nourriture et le bouchon du tube occupent le même volume dans chaque chambre.Cela garantit que les mouches dans chaque chambre sont exposées à l'éthanol en même volume. Avec de la pratique, il est facile d'exposer trois flacons de mouches en parallèle. Une fois les chambres d'exposition préparées, nous pouvons maintenant exposer les mouches à l'éthanol.Tout d'abord, transférez un flacon contenant huit mouches dans une chambre d'exposition, en scellant la chambre avec le bouchon du flacon d'origine. Ensuite, pipetez 500 microlitres d'éthanol coloré à la concentration choisie sur une extrémité d'un bouchon de flacon en coton. Puis remplacez le bouchon de la chambre d'exposition par le bouchon enduit d'éthanol, en insérant l'extrémité recouverte d'éthanol à l'intérieur de la chambre.Immédiatement après avoir ajouté le bouchon imprégné d'éthanol dans la chambre d'exposition, déclenchez un chronomètre. Le colorant présent dans l'éthanol permet de s'assurer que l'éthanol est orienté vers l'intérieur de la chambre d'exposition et non vers la paroi du tube. Cela est particulièrement important si vous utilisez des boules de coton plutôt que des bouchons spécifiques, car n'importe quelle face d'une boule de coton peut être tournée vers l'intérieur du tube.Dans cette exposition, nous utilisons de l'alcool à 100 %, qui diffuse maintenant dans la chambre d'exposition où les mouches l'inspirent depuis l'air ambiant. Chaque minute suivant l'ajout de la capsule imprégnée d'éthanol dans la chambre d'exposition, nous comptabilisons combien de mouches sont devenues immobiles, c'est-à-dire incapables de se retourner et de marcher. Plus les mouches restent mobiles, plus elles sont résistantes à chaque intervalle d'une minute.Surprenez les mouches en tapotant la chambre sur la paillasse afin de vous assurer que toutes les mouches capables de bouger soient en mouvement. Observez les mouches pendant 10 secondes après les avoir tapotées, pour leur laisser le temps de commencer à bouger ou de se retourner, à chaque intervalle d'une minute. Notez combien des huit mouches sont immobiles au début de l'expérience.La plupart des mouches remontent rapidement sur le côté du flacon après avoir été effrayées. Après environ six minutes d'exposition à l'éthanol à 100 %, elles commencent à se déplacer lentement et parfois de manière erratique vers la douzième minute. La plupart des mouches deviennent immobiles, incapables de marcher ou de se retourner lorsqu'elles sont couchées sur le dos.Seules les mouches capables de se remettre sur leurs pattes et de marcher doivent être comptées comme mouches mobiles ; celles qui bougent simplement leurs pattes ou leurs ailes sur place doivent être comptées comme mouches immobiles. Les mouches qui restent sur le dos pendant toute la période d’observation doivent également être considérées comme immobiles, car leur incapacité à se remettre sur leurs pattes est un signe d’ivresse. Les mouches qui agitent vigoureusement leurs ailes pendant toute la durée de l’observation de dix secondes doivent également être comptées comme immobiles, même si elles changent de position. La grande majorité de ces mouches restent immobiles entre les périodes de mouvements rapides des ailes.En résumé, les mouches capables de se retourner et de marcher sont considérées comme mobiles, tandis que celles incapables de se retourner, de bouger leurs pattes et ailes sur place ou de faire vibrer rapidement leurs ailes sont considérées comme stationnaires. Si nous appliquons ces critères, nous observons qu’un nombre croissant de mouches de type sauvage deviennent stationnaires à mesure que la durée d’exposition aux vapeurs d’éthanol augmente. La valeur utilisée par cet essai pour quantifier la sensibilité à l’éthanol est le temps médian de sédation, ou MST.Nous définissons le TSM comme le nombre de minutes d'exposition à l'éthanol nécessaires pour que quatre des huit mouches dans la chambre d'exposition deviennent immobiles. Cette valeur est facilement déterminée si exactement quatre mouches sont immobiles à un moment précis d'observation. Par exemple, si exactement quatre mouches sont immobiles après 11 minutes d'exposition, alors le TSM est de 11.Si exactement quatre mouches sont immobiles après 11 minutes d'exposition et que la même observation est faite au bout de 12 minutes, prendre la première valeur comme étant le moment où les mouches atteignent pour la première fois leur TS. Si quatre mouches ne sont pas immobiles pendant une période d'observation donnée, il est nécessaire d'interpoler linéairement le moment auquel quatre mouches deviennent immobiles. Par exemple, si le nombre de mouches immobiles passe de trois à cinq entre la neuvième et la dixième minute d'exposition, on peut déterminer graphiquement que le TSM est de 9,5. Les données suivantes, recueillies à l'aide de ce test, montrent que ce dispositif expérimental constitue une méthode précise pour mesurer la sensibilité à l'éthanol.Un effectif (N) de six à huit flacons a été utilisé dans les expériences suivantes, comme indiqué à l'intérieur des barres. Le TSM (temps de survie moyen) des mouches mâles de type sauvage exposées à 100 % d'éthanol est d'environ 11 minutes, avec une faible erreur standard. La variabilité d'un jour à l'autre est faible et généralement non significative sur le plan statistique, mais nous vous recommandons tout de même de mesurer vos échantillons expérimentaux et vos témoins en parallèle le même jour.Remarquez également que les mouches exposées le jour A et le jour B ne sont pas les mêmes individus. Il s'agit de mouches soeurs appartenant au même lot génétique. Les mâles et femelles exposés à 100 % Ethanol ne présentent aucune différence de MST. Toutefois, nous recommandons de s'en tenir à un seul sexe.Si nous exposons des mouches mâles et femelles à des doses croissantes d'éthanol, nous obtenons une belle courbe de réponse en fonction de la dose, qui montre une diminution statistiquement significative du MST en fonction de la concentration croissante d'éthanol. Cet essai reproduit également des phénotypes publiés précédemment, mesurés à l'aide d'un dispositif plus complexe de vaporisation d'éthanol : les mouches porteuses de la mutation « right rabbit one » ont présenté une augmentation significative du MST. Cette augmentation a été observée à 100 % ainsi qu'à 90 % d'éthanol.À l’aide de ce test, nous pouvons également induire et mesurer la tolérance à l’éthanol chez les mouches. La tolérance est définie comme une réduction de la réponse à l’alcool après une exposition préalable à l’alcool destinée à induire cette tolérance. Exposez un flacon de mouches à l’éthanol pendant environ deux fois leur MST.Par exemple, nous exposons ces mouches mâles de la souche sauvage de Berlin à de l'éthanol à 100 % pendant 24 minutes. Après cette exposition, tapez doucement les huit mouches dans leur flacon de nourriture, où vous les laisserez se remettre pendant quatre heures. Notez le TSM initial des mouches sur leur flacon après quatre heures de récupération, exposez à nouveau les mêmes mouches à la même dose d'éthanol et enregistrez leur deuxième TSM.Comme vous pouvez le voir sur ce graphique, le TMS de la deuxième exposition à l'éthanol est significativement plus élevé que le TMS de la première exposition, ce qui indique que les mouches ont développé une tolérance aux effets sédatifs de l'éthanol. Un indicateur de tolérance est calculé en divisant le deuxième TMS d'un flacon donné de mouches par le premier TMS des mêmes mouches, puis en soustrayant un ; la valeur est exprimée en pourcentage de tolérance, ce qui, dans notre cas, représente environ 50 %. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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