Méthodes de transfert rapide et la localisation des agents pathogènes dans l'intestin de Lyme Tick

L’objectif global de cette procédure est de micro-injecter et de localiser les cellules de borrelia berg de ferry dans l’intestin de la tique. Pour ce faire, il suffit de préparer d’abord les aiguilles capillaires en verre et de les remplir de cellules de Beberg de Ferry. Ensuite, les cellules de Beberg defer sont transférées dans l’intestin de la tique par micro-injection.

La tique est ensuite disséquée et les tissus intestinaux sont retirés. Enfin, un marquage par immunofluorescence du beberg defer dans l’intestin de la tique est effectué. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui démontrent la localisation de Beberg pour transporter dans l’intestin de la tique à l’aide de la microscopie confocale.

Bonjour, je suis le Dr Ruth Paul Paul, professeure adjointe à l’Université du Maryland au Département de médecine vétérinaire. Aujourd’hui, deux membres de mon laboratoire, Toro Cairo, un boursier postdoctoral, et Adam Coleman, un étudiant diplômé, vous montreront la procédure d’infection artificielle des tiques par micro-injection que nous effectuons régulièrement en laboratoire. Après la micro-injection, nous disséquerons la tique et imagerons les bactéries dans l’intestin de la tique à l’aide d’un microscope CE confocal.

Le principal avantage de la micro-injection de tiques d’une génération de tiques infectées naturelles est la durée de la procédure. La micro-injection raccourcit l’ensemble de la procédure de plusieurs semaines, car environ cinq semaines sont nécessaires pour générer des tiques infectées par le processus d’alimentation naturel. Cette technique peut également être adaptée pour injecter d’autres réactifs utiles tels que l’ARN double brin pour l’ARNi ou l’antisérum pour l’interférence d’anticorps spécifiques à l’intérieur de la tique.

Pour commencer, fabriquez plusieurs aiguilles de micro-injection en chauffant et en tirant des tubes capillaires en verre d’un millimètre dans un dispositif de traction à micropipette en verre. Retirez avec précaution les fragiles tubes capillaires. Rangez les aiguilles regroupées avec la pointe vers le haut sur du ruban adhésif dans une boîte de Pétri.

Ensuite, cultivez b berg de ferry dans la culture BSK. Moyenne à une concentration d’environ 10 à sept cellules par millilitre de granulé b berg de ferry par centrifugation à 3000 fois G pendant 10 minutes. À température ambiante, retirez le filet et remettez complètement la pastille en suspension dans le milieu BSK en passant doucement à travers une micropointe stérile de 200 microlitres jusqu’à une concentration finale de 10 à neuf cellules par millilitre.

Étant donné que les cellules sont remises en suspension à haute densité cellulaire et pourraient s’agglutiner, la suspension cellulaire doit être utilisée immédiatement pour la micro-injection afin de préparer les tiques, placez du ruban adhésif transparent double face sur une lame de verre en travaillant sur un tapis collant, retirez soigneusement les tiques du récipient À l’aide d’une petite brosse, placez le nombre requis de tiques à injecter sur le ruban adhésif, côté ventral vers le haut, dans la même direction. Chargez cinq microlitres de la culture Beberg de Ferry dans l’aiguille capillaire basculée. À l’aide d’une microcharge de 20 microlitres de pointe de pipette, inspectez l’aiguille à la recherche de bulles d’air emprisonnées et rechargez l’aiguille avec une culture bactérienne.

Si nécessaire, observez la tique à l’aide du microscope binoculaire de dissection et concentrez-vous sur la zone de l’ouverture anale de la tique. Touchez doucement l’extrémité de l’aiguille capillaire afin de briser le tube dont le diamètre est légèrement inférieur à celui de l’ouverture anale de la tique formant l’aiguille de micro-injection. Cette étape est cruciale, car toute tentative d’injecter des tiques avec des pointes d’aiguille non appropriées cause des blessures et peut-être la mort.

À la tique injectée. Placez les tiques immobilisées sous le microscope binoculaire de dissection et concentrez-vous sur l’ouverture anale, qui est recouverte par deux plaques anales mobiles. À l’aide d’une pince fine, touchez doucement et appliquez une pression très douce sur n’importe quelle zone proche de l’ouverture anale.

Cela permettra la séparation des plaques anales et l’ouverture du pore anal qui se connecte à l’intestin. Insérez soigneusement la pointe de l’aiguille légèrement dans l’ouverture anale à travers l’ouverture forcée des plaques anales. L’insertion de l’aiguille doit être réduite au minimum, car la pointe en verre pourrait endommager l’intestin postérieur semi-transparent qui se connecte au rectum.

À l’aide d’un micro-injecteur équipé d’une pédale de commande automatisée, injectez la solution beberg de ferry en utilisant les paramètres suivants : 1000 pression d’injection Hector Pascals, temps d’injection de 0,2 seconde, et huit pression de compensation Hector Pascal. Chaque tique reçoit une seule injection suite à une micro-injection.

La tique doit montrer des signes de mouvement ou ramper en réponse à des stimuli similaires à ceux d’avant l’injection. Pour disséquer des tiques pour la microscopie à immunofluorescence, placez d’abord une gouttelette de solution saline tamponnée au phosphate sur une lame de verre propre pour la dissection et une autre sur une lame recouverte de lysine poly L Pour la microscopie, préparez une autre lame de verre avec du ruban adhésif double face. Ensuite, retirez la tique du récipient et placez-la sur du ruban adhésif double face.

À l’aide d’un petit pinceau sous la dissection au microscope, regardez et concentrez-vous sur la tique, placez une lame de rasoir tranchante sur la tique entre la première et la deuxième paire de pattes. Appuyez fermement en coupant la tique en deux morceaux, exposant l’abdomen immédiatement immergé l’abdomen dans une gouttelette de PBS à l’aide de pinces fines. Saisissez l’exosquelette dorsal et ventral autour du site de l’incision.

Tirez délicatement le bouclier dorsal vers le haut et éloignez-le de la tique, exposant le diverticulaire intestinal de couleur brunâtre. Veillez à garder les tiques de dissection sous le PBS à tout moment. Les faisceaux de glandes saliennes semi-translucides sont situés de chaque côté de la région antérieure de l’intestin et peuvent être retirés à ce stade si vous le souhaitez.

En maintenant l’exosquelette restant en place à l’aide d’une pince, retirez délicatement l’intestin de l’abdomen. Nettoyez soigneusement l’intestin en enlevant tous les tissus piégés tels que la trachie. À l’aide de la pointe d’une pince fine, transférez rapidement l’intestin de la tique dans une gouttelette de PBS sur une lame de verre poly L lysine.

Séparez l’intestin en petits morceaux à l’aide de lames fines ou en appuyant doucement avec la pointe d’une pince fine. Aspirez soigneusement l’excès de PBS autour des tissus intestinaux. Laissez les tissus intestinaux sécher à l’air libre à température ambiante.

Réparez l’intestin de la tique en l’immergeant dans de l’acétone pendant 10 minutes. Laissez-le sécher à l’air libre, les lames à température ambiante peuvent être stockées à cette étape pendant des mois à moins 20 degrés Celsius dans un récipient hermétique. Pour le marquage immunofluorescent de l’intestin, tracez un cercle autour de l’intestin fixe de la tique à l’aide d’un stylo Pap ou d’un autre dispositif de revêtement de barrière hydrophobe.

Cela aidera à retenir les solutions de coloration pendant les étapes d’incubation suivantes. Couvrez l’intestin de la tique avec une ou quelques gouttes de tampon de blocage pendant 30 minutes. À température ambiante.

Le sérum utilisé pour le blocage dépend de la source de l’anticorps chez l’animal hôte. Ne laissez pas la diapositive sécher à partir de ce point. Aspirez lentement la mémoire tampon de blocage.

Incuber l’intestin avec des solutions d’anticorps primaires et/ou secondaires appropriées. Nous utilisons de la fluorescéine, de l’isothiocyanate ou du FXI marqué anti B berg. Différer l’anticorps à une dilution de un à 100 dans un tampon de blocage pendant une heure.

À température ambiante, couvrez le récipient d’une feuille d’aluminium pour limiter l’exposition à la lumière. Retirer la solution d’anticorps par aspiration douce. Incuber l’intestin avec un colorant fluorescent pour marquer les tissus des tiques tels que le DPI ou l’iodure de propidium.

Nous utilisons normalement 20 microgrammes par millilitre d’iodure de péridium dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante, lavons trois fois avec 0,05 % entre 20 % dans du PBS pendant cinq minutes. Enfin, montez la lame dans du glycérol tamponné contenant un réactif Antifa et recouvrez soigneusement d’un couvercle en verre. Les lames de glissement peuvent être stockées à cette étape pendant quelques mois à quatre degrés Celsius dans une image de conteneur hermétique et localisées sous un microscope confocal.

Une micro-injection de tiques est montrée ici avec une aiguille remplie de kumasi bleu brillant pour la visibilité. Des pinces fines sont utilisées pour appliquer une légère pression sur le corps, ce qui permet la séparation des plaques anales et l’ouverture du pore anal pour la microinjection. Ici, la région antérieure d’un diverticule intestinal est représentée avec un ferry de Beberg dans l’intestin.

Les noyaux intestinaux et les spirochètes sont marqués respectivement avec de l’iodure de propidium ou de l’anti beberg conjugué fitzy. Une fois maîtrisés, nous avons constaté que 10 tiques peuvent être micro-injectées de puissance avec naturellement cent mille survivants et infectés par le fer. Bien que les tiques puissent être utilisées immédiatement pour d’autres expériences, nous attendons généralement un ou deux jours pour nous assurer que les tiques survivent à la procédure avant de continuer.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des tiques infectées artificielles par micro et des insectes de barrière localisés dans l’intestin des tiques à l’aide de flux immunologiques confocaux. Micro : Travailler avec des tiques et de fines aiguilles de verre remplies d’un agent pathogène humain, comme le brelia brior, peut être dangereux pendant que vous travaillez. Soyez conscient de l’emplacement des tiques et des aiguilles et respectez en tout temps les précautions de niveau de biosécurité deux.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.