Name: Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Apprenez la microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal chez la souris pour étudier la microcirculation vasculaire en temps réel. Cette méthode permet d'évaluer les réponses vasculaires et la fonction endothéliale in vivo.

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Ce travail est financé par les Instituts canadiens de recherche en santé, la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, Université de British Columbia Centre for Blood Research et l&#39;Université du Nord de la Colombie-Britannique.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Réactifs qui seront utilisés tout au long de l'expérience devrait être préparé avant de commencer le protocole chirurgical. Notez que toutes les solutions ont été faites en utilisant une technique stérile. </li><li> Sérum physiologique (PSS) est le mieux préparé en deux composantes: une solution de sel de base et une solution de bicarbonate de sodium. Préparer des solutions à la concentration de 20X et stocker à 4 ° C. Le bicarbonate de sodium à 20X est 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) et une solution de sel de base à 20X la concentration est 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), et 23.4mm MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Les solutions doivent être préparées en DH 2 O et les produits chimiques doivent être ajoutés un à un et agité jusqu'à solution est limpide avant d'ajouter le produit chimique suivante </li><li> Préparer 2L du PSS en diluant des volumes égaux de solution de bicarbonate de sodium et le sel de base et dilue la concentration de 1X (pour deux 2L du PSS diluer 100 ml de chaque solution de bicarbonate de sodium et le sel de base dans dH 2 O </li><li> Fiole jaugée Placez 2L contenant PSS et PSS à 37 ° C bain-marie. Equilibrer la solution avec 5% de CO 2 / azote gazeux équilibre pour 1h avant le début de la procédure chirurgicale. </li><li> Produits chimiques vasoactif (ex. phényléphrine, l'acétylcholine, le nitroprussiate de sodium) sont les mieux préparés à une concentration 1M de dH2O et stockés dans 100 ul aliquotes à -20 ° C. </li></ol> 2. Préparation des animaux <ol><li> Déterminer le poids de la souris et d'administrer la dose initiale de pentobarbital de sodium à 90mg/kg par injection intrapéritonéale. Tout au long de la procédure de la souris est continuellement surveillée pour le plan d'anesthésie par pincement de l'orteil et l'examen minutieux de la fréquence respiratoire. Injections supplémentaires de pentobarbital de sodium doit être administré au besoin, à 20mg/kg de maintenir avion anesthésie. Le plan chirurgical d'anesthésie est entretenu conformément aux règlements fédéraux et institutionnels tel que décrit dans le protocole de soins des animaux approuvée par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation (ACUC) de l'University of Northern BC. </li><li> Enlever les poils de la zone abdominale et le flanc / hanche en rasoir. Retirer restantes cheveux dénoués par tampon imbibé d'alcool et de tapoter la zone avec du ruban adhésif. Cela est suffisant que cette procédure expérimentale est en phase terminale. </li><li> Placez la souris sur un conseil clair chirurgicale en position couchée et attacher la souris pour le conseil en enregistrant chaque coussinet plantaire à la planche. La température corporelle est maintenue par une lampe de chaleur externe et surveillé via thermomètre rectal pour s'assurer que l'hypothermie ne se produit pas en raison de l'anesthésie. </li></ol> 3. Procédure chirurgicale <ol><li> Pendant toute la procédure chirurgicale d'assurer tissu exposé est toujours maintenu superfusées avec une solution équilibrée PSS réchauffé. Il est également important de ne jamais entrer en contact avec la vascularisation d'intérêt avec des instruments chirurgicaux ou de blesser les vaisseaux en plaçant à la force de beaucoup sur eux en manipulant les tissus adipeux et le tissu conjonctif qui les entourent. </li><li> Placez la souris sous le microscope à dissection. Faire une incision médiane le long de la surface ventrale de la cavité abdominale et rétracter la peau vers la colonne vertébrale de la souris. </li><li> Une fois que la peau se rétracte pour que le LN est facilement visible, la broche de la peau sur un piédestal de transparence Sylgard 184. </li><li> Retirez la mince couche de tissu conjonctif recouvrant la zone autour de la LN </li><li> Effacer la superposition du tissu adipeux et entourent les ganglions lymphatiques jusqu'à ce que le lit microvasculaire est exposée. Le segment des principales artères pose à côté de la LN et est couramment recouvert par la veinule. La chirurgie prend environ 30 minutes. </li></ol> 4. Imagerie et analyse des navires <ol><li> Une fois le segment des navires d'intérêt est exposé sous le coup de dissection, sécuriser la préparation sur le microscope intravitale. Notez que les restes d'animaux sur le plateau claires chirurgicale tandis que sur le microscope intravitale pendant toute la durée de l'expérience. La température corporelle est maintenue par une lampe chauffante et mesurée par thermomètre rectal comme décrit lors de la section chirurgicale. L'avion d'anesthésie est également surveillé tout au long de l'expérience comme décrit dans la section 2.1. </li><li> Mettre en place la surfusion et des lignes d'aspiration. Superfusion du PSS se fait par l'alimentation par gravité à partir d'un réservoir, vers le réservoir d'eau chauffée veste (la veste de l'eau est distribuée et chauffée par le bain-marie circulateur) étant perfusé par le CO 2 5% d'azote équilibré, et en bas une ligne au goutte à goutte à un taux de 10ml / min. Un tuyau d'aspiration doit être utilisée pour continuer tirez PSS superfusées loin de la préparation. Notez que avant l'expérience des lignes d'aspiration et la chemise d'eau sont soigneusement nettoyés et stockés après chaque expérience. Cela garantit la stérilité avant l'expérience suivante. </li><li> Vérifiez la température de la PSS superfusing. Réglez la température de lacirculant bain d'eau et / ou le taux de surfusion PSS pour atteindre une température de ~ 37 ° C à travers la préparation. </li><li> Autoriser la vascularisation s'équilibrer avec PSS pour au moins 60 minutes et de quantifier le diamètre du vaisseau en utilisant l'étrier vidéo. Typiquement, le diamètre du vaisseau devrait être déterminée en des points multiples (par exemple, à 40, 50 et 60 minutes) pour s'assurer que le navire s'est stabilisé. </li><li> Évaluer la santé de la cuve à l'aide d'un agoniste du muscle lisse spécifiques (ex. phényléphrine, PE) et un agoniste endothélium spécifiques (ex.: l'acétylcholine, l'ACh). Concentration d'agoniste doit être ajustée en fonction de l'agoniste, mais pour le PE et Ach le navire doit être évaluée à chaque concentration par addition cumulative (10-5M à 10-9M) à l'superfusat. Chaque demande agoniste doivent être séparées par une phase de lavage (généralement 30 minutes) en utilisant PSS jusqu'à ce que le navire rentre au diamètre de repos. </li><li> Après évaluation de la santé des navires, à la suite médicaments vasoactifs, marquage fluorescent, et la cellule de traçage expériences peuvent être menées. </li><li> Après la fin de l'expérience de l'animal est donné une surdose de pentobarbital de sodium. L'animal est ensuite surveillé pour s'assurer qu'il n'ya pas de réponse à pincement de l'orteil et l'absence de mouvement respiratoire ou battement de coeur. Au moment où ceci est suivi par dislocation cervicale. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Après la période d'équilibrage de la préparation devrait donner une image claire qui permet d'identifier à la fois l'artériole et la veinule qui alimente le ganglion lymphatique inguinal. Il devrait y avoir un minimum de cellules adipeuses entourant les vaisseaux pour permettre aux murs de l'artériole et la veinule être clairement observées pour les étriers de la vidéo à superposer pour calculer le diamètre du vaisseau. Le point intégrante d'une préparation réussie est l'artériole a une alimentation riche en sang en mouvement dans la lumière et qu'il ya un degré significatif de tonus vasculaire (c'est à dire l'artériole a la capacité de vasoconstriction et d'vasodilate muscles lisses et endothéliales agonistes spécifiques respectivement) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="Figure 1"> Figure 1. Image de microscopie intravitale des ganglions inguinaux nourrissent artériole (flèche rouge) d'alimentation du ganglion lymphatique équilibrée avec une solution saline physiologique et courir le long du côté de la veinule principale (flèche verte). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="Figure 2"> Figure 2. Vasoactifs réponse normale à la phényléphrine superfusées (PE) par addition cumulative d'eau physiologique à partir des concentrations 10 -9 M à 10 -5 M. La présence d'une vasoconstriction robuste est suggestive de la fonction musculaire normale lisses présentes dans l'artériole. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="Figure 3"> Figure 3. Vasoactifs réponse normale à l'acétylcholine superfusées (ACh) par l'addition cumulée à partir de sérum physiologique des concentrations de 10 -9 M à 10 -5 M. La présence d'une vasodilatation robuste est suggestive de l'actuelle fonction normale endothéliale dans l'artériole.

<ol><li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li>
<li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li>
<li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li>
<li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li>
<li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li>
<li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li>
</ol>

Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal présentée ici permet de microvascularisation image du ganglion in-vivo. Ainsi, il facilite un moyen de direct, en temps réel d&#39;observation. L&#39;imagerie de la microvascularisation LN est un site unique qui permet d&#39;étudier l&#39;interface entre la réponse immunitaire et le système vasculaire. Utiliser cette préparation, l&#39;accent peut être dirigé spécifiquement à la réponse immunitaire, des altérations dans le système vasculaire, ou à l&#39;interaction entre les deux. Comme avec toutes les approches expérimentales, la norme microscopie intravitale a la fois des avantages et des limites. Standard IVM, tels que la préparation est décrit ici peut facilement être modifié, et a déjà été démontré par les auteurs pour permettre à la microscopie à épifluorescence via l&#39;introduction de colorants traceur fluorescent ou de populations de cellules étiquetées. Bien IVM norme ne donne pas la possibilité de imagerie tridimensionnelle et de traçage, comme serait donné par microscopie à deux photons ou d&#39;angiographie, le suivi de la cellule est toujours réalisé en deux dimensions permettant de cellule à cellule et cellule-à-vasculaire à l&#39;interaction observés et quantifiés et en liaison avec l&#39;administration in vivo et coloration subséquente avec des anticorps fluorescents peuvent être utilisés pour fournir des données sur les protéines / marqueur d&#39;expression en temps réel. Notamment, les techniques d&#39;imagerie alternatives nécessitent un environnement statique pour les images; de serrage de la zone chirurgicale ou l&#39;ajout d&#39;une lamelle sur une préparation plat est souvent nécessaire. Cette limite, voire élimine, la capacité à perfuser activement médiateurs vasculaires ou d&#39;autres sur la préparation d&#39;évaluer l&#39;intégrité vasculaire et de la physiologie etc, ou l&#39;utilisation d&#39;autres techniques telles que des expériences menées dans la vasodilatation de la préparation IVM. Par ailleurs, la norme IVM ne nécessite pas une préparation complètement à plat et n&#39;est pas affectée par le mouvement, tels que celui généré par la respiration de l&#39;animal. Cela permet IVM standard à utiliser dans des zones plus chirurgical avec une plus grande reproductibilité. Ceci est illustré par la préparation ganglion lymphatique inguinal décrites ici. Etant donné la taille et la forme des ganglions lymphatiques, la préparation ne peut être faite à plat, sans blesser les tissus et l&#39;emplacement du nœud donne lieu à des mouvements significatifs dus à la respiration des animaux. Ces questions seraient difficiles à surmonter par d&#39;autres méthodes, mais sont facilement traitées en utilisant la préparation IVM standard décrit. En résumé, la préparation détaillée ci-dessus peuvent être combinés avec n&#39;importe quel nombre d&#39;autres biochimiques, vasculaires et / ou techniques immunologiques telles que le transfert de parties de cellules activées ou étiquetés, l&#39;induction de l&#39;hypoxie, et la sur-expression de l&#39;épuisement des médiateurs vasculaires. Cependant, des applications supplémentaires sont dépendants de la santé de la préparation initiale. Par conséquent, il est essentiel de toujours tester la santé de la vascularisation observée et évaluée. Points clés pour atteindre une préparation de la santé sont d&#39;assurer la préparation est constamment perfusé avec PSS équilibré à la température du corps et de minimiser le contact et le stress placé sur la zone opérée pendant la chirurgie.

<a href="https://app.jove.com/t/6652">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/2551">10.3791/2551</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/2551">Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node</a>. The Authors&#160;and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th></tr><tr><td> Bicarbonate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Chlorure de Potassium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Nitroprussiate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Phényléphrine </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> L&#39;acétylcholine </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium heptahydraté </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Sodium pentobarbital </td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Les ganglions lymphatiques (LN), situés à travers le corps, sont une composante intégrante du système immunitaire. Ils servent un site pour l&#39;induction de la réponse immunitaire adaptative, et donc, le développement de cellules effectrices. En tant que tel, LNS sont la clé de la lutte contre les pathogènes envahisseurs et le maintien de la santé. Le choix de la LN à l&#39;étude est dicté par l&#39;accessibilité et le modèle désiré, le ganglion lymphatique inguinal est bien situé et supporte facilement les études de modèles biologiquement pertinentes de la peau et les muqueuses génitales d&#39;infection. La LN inguinale, comme tous les ganglions, dispose d&#39;un réseau microvasculaire étendue lui fournissant le sang. En général, ce réseau microvasculaire comprend l&#39;artériole l&#39;alimentation principale de la LN que par la suite les branches et les aliments de haute veinules endothéliales (HEV). HEV sont spécialisés pour faciliter le trafic des cellules immunitaires dans le LN pendant les deux homéostasie et de l&#39;infection. Comment réguler le trafic HEV dans la LN en vertu de ces circonstances est une zone d&#39;exploration intense. La LN nourrissent artériole, a une influence directe sur l&#39;amont HEV et l&#39;alimentation principale de nutriments et de cellules du sang riche dans le LN. Par ailleurs, des changements dans l&#39;artériole alimentation sont impliqués dans la facilitation de l&#39;induction de la réponse immunitaire adaptative. Le système microvasculaire LN a une importance évidente dans le maintien d&#39;un approvisionnement en sang optimal à la LN et de réglementer l&#39;afflux de cellules immunitaires dans le LN, qui sont des éléments cruciaux dans la fonction LN et la réponse adéquate suite immunitaire. La possibilité d&#39;étudier la microvascularisation LN in vivo est la clé pour élucider la façon dont le système immunitaire et le système microvasculaire interagissent et s&#39;influencent les uns les autres au sein de l&#39;LN. Ici, nous présentons une méthode pour l&#39;imagerie in vivo du ganglion lymphatique inguinal. Nous nous concentrons sur l&#39;imagerie de la microvascularisation de la LN, en accordant une attention particulière aux méthodes qui assurent l&#39;étude des vaisseaux sains, la capacité à maintenir l&#39;imagerie des vaisseaux viables sur un certain nombre d&#39;heures, et la quantification de l&#39;ampleur du navire. Méthodes pour la perfusion de la microcirculation avec des médicaments vasoactifs ainsi que le potentiel de tracer et de quantifier le trafic cellulaire sont également présentés. Microscopie intravitale de la LN inguinale permet une évaluation directe de la fonctionnalité microvasculaires et en temps réel de l&#39;interface directe entre les cellules immunitaires, les LN, et la microcirculation. Cette technique pourrait être combinée avec des techniques immunologiques nombreuses et l&#39;étiquetage des cellules fluorescentes ainsi que pour étudier la vascularisation manipulé de LNS autres.

Une technique pour effectuer la microscopie intravitale du ganglion inguinal (LN) est décrite. Cette technique permet en temps réel,<em&gt; In vivo</em&gt; Une étude de la microvascularisation des ganglions lymphatiques et de la structure à la fois lors de l&#39;homéostasie et de l&#39;infection. Cette technique peut être adaptée à des études de trafic cellulaire et à d&#39;autres sites ganglionnaires.

Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

Les ganglions lymphatiques (GL), répartis dans tout l'organisme, sont une composante intégrale du système immunitaire. Ils servent de site d'induction de l'immunité adaptative...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et d'évaluer in vivo l'artère nourricière du ganglion lymphatique inguinal. Cela est réalisé en créant d'abord un lambeau cutané par une dissection minutieuse de la peau dans la région inguinale de la souris, recouvrant le ganglion lymphatique inguinal. Ensuite, le tissu conjonctif recouvrant la zone du ganglion lymphatique est détaché.Ensuite, le tissu adipeux environnant doit être retiré afin d'exposer la vascularisation artérielle afférente du ganglion lymphatique. Enfin, les modifications de la vascularisation du ganglion lymphatique sont visualisées et évaluées par microscopie intravitale P. Bien que la préparation que vous allez voir aujourd'hui soit la microcirculation du ganglion lymphatique inguinal, les techniques chirurgicales peuvent être utilisées pour d'autres préparations telles que le muscle squelettique ainsi que le cerveau.En général, lors de l'utilisation de cette technique, les débutants éprouvent des difficultés pour deux raisons principales. Premièrement, vous travaillez avec un animal vivant, et deuxièmement, comme vous réalisez une chirurgie dans une zone très restreinte, toute perturbation au niveau du vaisseau lui-même ou de la zone environnante pourrait avoir un impact négatif, ce qui nuirait à l'expérience que vous souhaitez mener. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle pour réussir.Il existe plusieurs étapes complexes qui sont difficiles à transposer fidèlement du texte à la réalisation pratique de la technique. Il est important de la voir pour la réaliser correctement. Avec un grand succès.La souris est d'abord anesthésiée et la zone chirurgicale est rasée. Veuillez consulter le manuscrit pour plus de détails. La souris peut ensuite être placée sur une planche chirurgicale transparente en position supine.Attachez la souris sur la planche en fixant chaque patte avec du ruban adhésif. La veille de l'expérience, mélangez le thes guard 180 4 selon les instructions du fabricant. Ensuite, en utilisant une boîte de Pétri jetable standard comme moule, versez le mélange sur une profondeur d’environ un quart de pouce et laissez polymériser toute la nuit. Retirez le thes guard de la boîte de Pétri et placez-le sur la planche chirurgicale.Placer la souris anesthésiée et épilée sous le microscope stéréoscopique. Réaliser une incision médiane le long de la surface ventrale de la cavité abdominale à l’aide de pinces en acier inoxydable numéro cinq et de ciseaux droits à ressort. Puis prolonger l’incision médiane en diagonale vers les membres et écarter la peau vers la colonne vertébrale massive.Une fois que le ln est facilement visible, fixez la peau rétractée à l'aide d'épingles à insectes en acier inoxydable et de pinces recouvertes d'époxy inox sur le socle du cigare 180 4. Ajoutez une solution saline physiologique ou SSP dans la zone.Ensuite, retirez la fine couche de tissu conjonctif recouvrant la zone autour du ganglion lymphatique. À l’aide de pinces, saisissez délicatement de petits morceaux de tissu conjonctif et disséquez-les du ganglion lymphatique. À l’aide de ciseaux à ressort, éliminez ensuite le tissu adipeux recouvrant et entourant le ganglion lymphatique jusqu’à l’exposition du lit microvasculaire.Pour cette étape, il est important de faire attention à ne jamais entrer en contact avec la vascularisation d'intérêt à l'aide d'instruments chirurgicaux ni de blesser les vaisseaux en exerçant une pression excessive sur eux lors de la manipulation des tissus environnants. La graisse est mieux éliminée du ganglion en relâchant le tissu conjonctif, en pinçant ensemble l'adipose avec une pince, puis en retirant délicatement le tissu adipeux jusqu'à ce que le champ de vision soit dégagé. Une fois les tissus conjonctif et adipeux retirés, le segment artériel principal adjacent au ganglion et la veine accompagnante sus-jacente deviennent visibles.Une fois le segment vasculaire d'intérêt exposé sous le microscope stéréoscopique, fixez la préparation sur le microscope intravitale. Mettez en place les lignes de superfusion et d'aspiration. Pendant cette partie de la procédure, il est essentiel que le tissu exposé soit constamment maintenu en superfusion avec la solution PSS équilibrée.La superperfusion de PSS s'effectue par gravité. Alimenter à partir d'un réservoir initial vers un réservoir chauffé par une double enveloppe d'eau, qui est perfusé avec un mélange de 5 % de dioxyde de carbone équilibré par de l'azote, puis acheminer le liquide le long d'une tubulure de goutte-à-goutte à un débit de 10 millilitres par minute. Une ligne d'aspiration doit être utilisée pour continuer à éliminer la PSS superperfusée de la préparation en la plaçant au fond du lambeau cutané ; la température du bain d'eau circulant et le débit de la superperfusion de PSS doivent alors être vérifiés et ajustés afin d'obtenir une température optimale d'environ 36 degrés Celsius.Pendant la préparation, laissez le réseau vasculaire s'équilibrer avec la PSS pendant au moins 60 minutes. Veillez à ce que l'animal ne devienne pas hypothermique à l'aide d'un thermomètre rectal et fournissez une lampe chauffante externe. Pendant que la PSS s'équilibre, quantifiez le diamètre du vaisseau.Utiliser les pieds à coulisse vidéo à plusieurs points temporels afin de s'assurer que le vaisseau a atteint une stabilisation définie comme une taille de diamètre restant constante à cinq micromètres près pendant une période de 20 minutes. Les mesures du diamètre sont enregistrées sur un ordinateur à l'aide d'un logiciel Chart Lab. Après la période d'équilibration, évaluer l'état de santé du vaisseau à l'aide d'un agoniste spécifique des muscles lisses, tel que la phényléphrine, comme illustré ici avec la phényléphrine.Ajoutez l'agoniste au suse. Huit agonistes doivent être évalués à chaque logarithme, en augmentant la concentration cumulative de l'agoniste au fur et à mesure de son ajout au destin du SUP entre les administrations de chaque agoniste. Une phase de lavage utilisant du PSS doit être réalisée pendant 30 minutes ou jusqu'à ce que le vaisseau retrouve son diamètre de repos.Voici des résultats représentatifs d'un ganglion inguinal après la période d'équilibration. L'irrigation de l'artère par une solution saline physiologique fournit une image nette permettant l'identification de l'artère d'apport, indiquée ici par la flèche rouge, et de la veine, indiquée par la flèche verte, qui vascularisent le ganglion lymphatique inguinal. Le graphique montre une réponse vasoréactive typique d'une artère afférente du ganglion inguinal à l'ajout cumulatif de phényléphrine SUP dans la solution saline physiologique.D'une concentration de 10 à la puissance moins neuf molaire à 10 à la puissance moins cinq molaire, la présence d'une vasoconstriction marquée suggère une fonction normale du muscle lisse présent dans l'artère. Sur ce graphique, une réponse vasoréactive typique à l'acétylcholine ajoutée de façon cumulative au sérum physiologique. Une concentration allant de 10 à la puissance moins neuf molaire à 10 à la puissance moins cinq molaire est représentée.La présence d'une vasodilatation robuste suggère une fonction endothéliale normale présente dans l'artère. Lors de la réalisation de cette préparation, l'un des points essentiels à retenir est de minimiser la perturbation du vaisseau et de la zone environnante afin de maximiser le taux de réussite. Après cette procédure, d'autres méthodes peuvent être introduites, comme la fluorescence, afin d'explorer d'autres fonctions cellulaires telles que le trafic cellulaire.Après le développement de cette technique, elle a ouvert la voie à une intégration des domaines de l'immunologie et de la biologie vasculaire au sein d'un nouveau champ disciplinaire : l'immunologie vasculaire.

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Haute résolution intravitale imagerie avec un contraste accru jusqu'à 120 um de profondeur dans les ganglions lymphatiques de la souris adulte est obtenue en modulant spatialement le modèle d'excitation d'un multi-focal microscope à deux photons. En 100 profondeur pm nous avons mesuré des résolutions de 487 nm (latéraux) et 551 nm (axial), contournant ainsi les limites de diffusion et de diffraction.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Ce protocole décrit une technique pour imager différentes populations de cellules dans les ganglions lymphatiques drainants sans altérations dans la structure d'organe.

Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

Ici, nous montrons comment effectuer la microscopie intravitale sur les venules post-capillaires du muscle de cremaster de souris. Communément appliqués à différents modèles d’inflammation et de septicémie, en particulier ceux induits par les chimiothérapeutiques et les cytokines, nous soulignons sa pertinence dans l’étude des muscolopathies impliquant l’infiltration musculaire exagérée de leucocyte.

Infiltration de Leukocyte de Cremaster Muscle chez les souris évaluées par microscopie intravitale

Le mélanome est une maladie très agressive qui se propage rapidement à d’autres organes. Ce protocole décrit l’application de l’imagerie échographique à ultra-haute fréquence, associée à un rendu 3D, pour surveiller le volume des ganglions lymphatiques inguinaux dans le modèle murin Braf/Pten du mélanome métastatique.

Analyse du volume des ganglions lymphatiques par imagerie ultrasonore à ultra-haute fréquence dans le modèle murin de mélanome génétiquement modifié Braf/Pten

Apprenez la microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal chez la souris pour étudier la microcirculation vasculaire en temps réel. Cette méthode permet d'évaluer les réponses vasculaires et la fonction endothéliale in vivo.

Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

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