Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et d'évaluer in vivo l'artère nourricière du ganglion lymphatique inguinal. Cela est réalisé en créant d'abord un lambeau cutané par une dissection minutieuse de la peau dans la région inguinale de la souris, recouvrant le ganglion lymphatique inguinal. Ensuite, le tissu conjonctif recouvrant la zone du ganglion lymphatique est détaché.

Ensuite, le tissu adipeux environnant doit être retiré afin d'exposer la vascularisation artérielle afférente du ganglion lymphatique. Enfin, les modifications de la vascularisation du ganglion lymphatique sont visualisées et évaluées par microscopie intravitale P. Bien que la préparation que vous allez voir aujourd'hui soit la microcirculation du ganglion lymphatique inguinal, les techniques chirurgicales peuvent être utilisées pour d'autres préparations telles que le muscle squelettique ainsi que le cerveau.

En général, lors de l'utilisation de cette technique, les débutants éprouvent des difficultés pour deux raisons principales. Premièrement, vous travaillez avec un animal vivant, et deuxièmement, comme vous réalisez une chirurgie dans une zone très restreinte, toute perturbation au niveau du vaisseau lui-même ou de la zone environnante pourrait avoir un impact négatif, ce qui nuirait à l'expérience que vous souhaitez mener. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle pour réussir.

Il existe plusieurs étapes complexes qui sont difficiles à transposer fidèlement du texte à la réalisation pratique de la technique. Il est important de la voir pour la réaliser correctement. Avec un grand succès.

La souris est d'abord anesthésiée et la zone chirurgicale est rasée. Veuillez consulter le manuscrit pour plus de détails. La souris peut ensuite être placée sur une planche chirurgicale transparente en position supine.

Attachez la souris sur la planche en fixant chaque patte avec du ruban adhésif. La veille de l'expérience, mélangez le thes guard 180 4 selon les instructions du fabricant. Ensuite, en utilisant une boîte de Pétri jetable standard comme moule, versez le mélange sur une profondeur d’environ un quart de pouce et laissez polymériser toute la nuit. Retirez le thes guard de la boîte de Pétri et placez-le sur la planche chirurgicale.

Placer la souris anesthésiée et épilée sous le microscope stéréoscopique. Réaliser une incision médiane le long de la surface ventrale de la cavité abdominale à l’aide de pinces en acier inoxydable numéro cinq et de ciseaux droits à ressort. Puis prolonger l’incision médiane en diagonale vers les membres et écarter la peau vers la colonne vertébrale massive.

Une fois que le ln est facilement visible, fixez la peau rétractée à l'aide d'épingles à insectes en acier inoxydable et de pinces recouvertes d'époxy inox sur le socle du cigare 180 4. Ajoutez une solution saline physiologique ou SSP dans la zone.

Ensuite, retirez la fine couche de tissu conjonctif recouvrant la zone autour du ganglion lymphatique. À l’aide de pinces, saisissez délicatement de petits morceaux de tissu conjonctif et disséquez-les du ganglion lymphatique. À l’aide de ciseaux à ressort, éliminez ensuite le tissu adipeux recouvrant et entourant le ganglion lymphatique jusqu’à l’exposition du lit microvasculaire.

Pour cette étape, il est important de faire attention à ne jamais entrer en contact avec la vascularisation d'intérêt à l'aide d'instruments chirurgicaux ni de blesser les vaisseaux en exerçant une pression excessive sur eux lors de la manipulation des tissus environnants. La graisse est mieux éliminée du ganglion en relâchant le tissu conjonctif, en pinçant ensemble l'adipose avec une pince, puis en retirant délicatement le tissu adipeux jusqu'à ce que le champ de vision soit dégagé. Une fois les tissus conjonctif et adipeux retirés, le segment artériel principal adjacent au ganglion et la veine accompagnante sus-jacente deviennent visibles.

Une fois le segment vasculaire d'intérêt exposé sous le microscope stéréoscopique, fixez la préparation sur le microscope intravitale. Mettez en place les lignes de superfusion et d'aspiration. Pendant cette partie de la procédure, il est essentiel que le tissu exposé soit constamment maintenu en superfusion avec la solution PSS équilibrée.

La superperfusion de PSS s'effectue par gravité. Alimenter à partir d'un réservoir initial vers un réservoir chauffé par une double enveloppe d'eau, qui est perfusé avec un mélange de 5 % de dioxyde de carbone équilibré par de l'azote, puis acheminer le liquide le long d'une tubulure de goutte-à-goutte à un débit de 10 millilitres par minute. Une ligne d'aspiration doit être utilisée pour continuer à éliminer la PSS superperfusée de la préparation en la plaçant au fond du lambeau cutané ; la température du bain d'eau circulant et le débit de la superperfusion de PSS doivent alors être vérifiés et ajustés afin d'obtenir une température optimale d'environ 36 degrés Celsius.

Pendant la préparation, laissez le réseau vasculaire s'équilibrer avec la PSS pendant au moins 60 minutes. Veillez à ce que l'animal ne devienne pas hypothermique à l'aide d'un thermomètre rectal et fournissez une lampe chauffante externe. Pendant que la PSS s'équilibre, quantifiez le diamètre du vaisseau.

Utiliser les pieds à coulisse vidéo à plusieurs points temporels afin de s'assurer que le vaisseau a atteint une stabilisation définie comme une taille de diamètre restant constante à cinq micromètres près pendant une période de 20 minutes. Les mesures du diamètre sont enregistrées sur un ordinateur à l'aide d'un logiciel Chart Lab. Après la période d'équilibration, évaluer l'état de santé du vaisseau à l'aide d'un agoniste spécifique des muscles lisses, tel que la phényléphrine, comme illustré ici avec la phényléphrine.

Ajoutez l'agoniste au suse. Huit agonistes doivent être évalués à chaque logarithme, en augmentant la concentration cumulative de l'agoniste au fur et à mesure de son ajout au destin du SUP entre les administrations de chaque agoniste. Une phase de lavage utilisant du PSS doit être réalisée pendant 30 minutes ou jusqu'à ce que le vaisseau retrouve son diamètre de repos.

Voici des résultats représentatifs d'un ganglion inguinal après la période d'équilibration. L'irrigation de l'artère par une solution saline physiologique fournit une image nette permettant l'identification de l'artère d'apport, indiquée ici par la flèche rouge, et de la veine, indiquée par la flèche verte, qui vascularisent le ganglion lymphatique inguinal. Le graphique montre une réponse vasoréactive typique d'une artère afférente du ganglion inguinal à l'ajout cumulatif de phényléphrine SUP dans la solution saline physiologique.

D'une concentration de 10 à la puissance moins neuf molaire à 10 à la puissance moins cinq molaire, la présence d'une vasoconstriction marquée suggère une fonction normale du muscle lisse présent dans l'artère. Sur ce graphique, une réponse vasoréactive typique à l'acétylcholine ajoutée de façon cumulative au sérum physiologique. Une concentration allant de 10 à la puissance moins neuf molaire à 10 à la puissance moins cinq molaire est représentée.

La présence d'une vasodilatation robuste suggère une fonction endothéliale normale présente dans l'artère. Lors de la réalisation de cette préparation, l'un des points essentiels à retenir est de minimiser la perturbation du vaisseau et de la zone environnante afin de maximiser le taux de réussite. Après cette procédure, d'autres méthodes peuvent être introduites, comme la fluorescence, afin d'explorer d'autres fonctions cellulaires telles que le trafic cellulaire.

Après le développement de cette technique, elle a ouvert la voie à une intégration des domaines de l'immunologie et de la biologie vasculaire au sein d'un nouveau champ disciplinaire : l'immunologie vasculaire.