Name: Évaluation des propriétés de signalisation ectodermique épithéliums au cours du développement cranio-facial (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez une technique de transplantation tissulaire pour créer des embryons chimériques et étudier les propriétés de signalisation de l'ectoderme céphalique superficiel chez l'embryon de poulet.

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1. Préparer le tissu du donneur <ol><li> Préparer les milieux de culture, d'affiner broches verre, affûter les aiguilles de tungstène. </li><li> Recueillir l'embryon de la coquille, lavez-les à PBS glacé. <ol class="lalpha"><li> En utilisant une seringue de 10 ml et une aiguille 18 gauge retirer 1,0 ml d'albumine de l'extrémité pointue de la coquille d'oeuf. </li><li> Faire un petit trou sur le dessus de la coquille en utilisant le point de ciseaux, puis couper une ouverture circulaire pour exposer l'embryon </li></ol></li><li> Retirez la tête et la placer dans du DMEM (sans sérum, température ambiante) </li><li> Disséquer processus fronto partir de l'embryon (ou le site d'autres donateurs tels que le processus maxillaire ou mandibulaire) </li><li> Digest en 2.4U / ml dans le PBS dispase sur la glace pendant 20 minutes </li><li> Couvrir les tissus avec du DMEM avec la BSA à 1% pour arrêter la digestion </li><li> Utiliser l'aiguille de tungstène aiguisé pour ectoderme séparée, mésenchyme, et neuroectoderme </li><li> Magasin de tissu greffé en BSA DMEM 1% sur la glace jusqu'à ce hôte est prêt pour la transplantation </li></ol> 2. Préparation de l'hôte <ol><li> Exposer l'embryon <ol class="lalpha"><li> En utilisant une seringue de 10 ml et une aiguille 18 gauge retirer 1,0 ml d'albumine de l'extrémité pointue de la coquille d'oeuf. </li><li> Faire un petit trou sur le dessus de la coquille en utilisant le point de ciseaux. Placer un morceau de ruban adhésif sur le trou, puis couper une ouverture circulaire pour exposer l'embryon. </li></ol></li><li> Utiliser 2 paires de pinces, saisir l'amnios et doucement lacrymogènes pour faire un trou. </li><li> Tournez la tête en plaçant une pince sur l'œil droit et en appliquant une pression. Tout en tenant la tête droite, utiliser une aiguille de tungstène pour enlever l'ectoderme d'hôte pour accueillir le greffon. </li><li> Transfert de la greffe à l'hôte à l'aide d'une pipette en verre. </li><li> Position de la greffe pour remplacer l'ectoderme enlevé. Insérez une épingle en verre dans chaque coin du tissu greffé à la broche le greffon en place. Pour rendre broches verre, tirez un tube microcapillaire à un point précis sur une flamme d'alcool. </li><li> Placez ruban serré sur le trou et le retour d'embryon à l'incubateur pour la longueur de temps appropriée pour l'analyse. </li><li> voir aussi: 9 </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Pour évaluer les chimères, embryons doivent être collectées et traitées à l'analyse de la répartition de l'hôte et les tissus des donateurs. Pour la détection de cellules de caille, immunohistochimie en utilisant l'anticorps QcPN (décrit dans: 3) est utilisé, et pour la détection de cellules de souris, l'hybridation in situ sur coupes en paraffine est utilisée 6. Les cellules donneuses doivent être limitées à l'épithélium, et il devrait y avoir aucune preuve de tissus mésenchymateux donneur (Figure 1). La présence de cellules du donneur isolées dans le mésenchyme indique la présence de cellules de contamination de la crête neurale qui se confondent toute interprétation morphologique due à l'influence de ces cellules sur plusieurs aspects du développement du visage (par exemple, 10). Une fois convaincu que la technique de greffe est libre de contamination de mésenchyme, les mesures des résultats encore morphologiques ou moléculaires peuvent être utilisés pour évaluer les chimères. Pour nos fins, nous avons détecté la présence de cartilages et des os ectopique qui correspondaient à des duplications de la mâchoire supérieure qui ont été induites par les tissus transplantés (figure 2), et des changements moléculaires dans les tissus mésenchymateux en réponse à l'ectoderme greffé (figure 3) 5,6. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Évaluation de chimérisme (A) Anti-QcPN coloration est utilisée pour détecter les cellules de caille dans le caille-chiches chimères. Il n'existe aucune preuve de la coloration dans le mésenchyme. (B) L'hybridation in situ est utilisée pour détecter l'expression des transcrits B2 SINE chez la souris-chiches chimères. L'expression est limitée à l'ectoderme comprenant la greffe. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Coloration Figure 2. Trichrome montre duplication du squelette mâchoire supérieure en (A) de caille-chiches chimère, et (B) de souris chimères chiches. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. L'ectoderme regultes l'expression des gènes dans le mésenchyme. (A) Normale BMP7 expression dans le mésenchyme d'un embryon de poulet (radioactive d'hybridation in situ avec un signal pseudo-couleur rouge positif dans Adobe Photoshop). (B) l'expression BMP7 est induite dans le mésenchyme adjacent à la greffe (Arrow) dans les embryons chimériques.

<ol><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Neural+Crest+in+Patterning+of+Avian+Cranial+Skeletal%2C+Connective%2C+and+Muscle+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues.</a> Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mesodermal+Tissues+on+Avian+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration.</a> Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+can+form+cartilages+normally+derived+from+mesoderm+during+development+of+the+avian+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton.</a> Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).</li>
<li>Couly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Hox-negative+cephalic+neural+crest+cells+and+the+foregut+endoderm+in+patterning+the+facial+skeleton+in+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head.</a> Development. 129, 1061-1061 (2002).</li>
<li>Evans, D. J., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relations+between+avian+craniofacial+neural+crest+and+paraxial+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells.</a> Dev Dyn. , (2006).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130, 1749-1749 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Dev Biol. 325, 200-200 (2009).</li>
<li>Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+derivatives+of+the+neural+crest%3A+analysis+of+chimaeric+quail+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).</li>
<li>Bollag, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+repetitive+mouse+B2+element+to+identify+transplanted+mouse+cells+in+mouse-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras.</a> Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-duck+chimeras+reveal+spatiotemporal+plasticity+in+molecular+and+histogenic+programs+of+cranial+feather+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development.</a> Development. 132, 1499-1499 (2005).</li>
<li>Odent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Sonic+hedgehog+%28SHH+%29+gene+during+early+human+development+and+phenotypic+expression+of+new+mutations+causing+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly.</a> Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).</li>
<li>Szabo-Rogers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skeletogenic+patterning+roles+for+the+olfactory+pit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit.</a> Development. 136, 219-219 (2009).</li>
</ol>

En utilisant cette méthode de transplantation nous a permis de déterminer que l&#39;ectoderme contient des informations de signalisation qui régule la polarité dorso-ventrale et l&#39;extension proximodistal de la mâchoire supérieure. La similitude des résultats lors de l&#39;utilisation de caille ou ectoderme de la souris, et la conservation des signaux moléculaires dans ce tissu parmi les nombreuses espèces 6,11 indique qu&#39;il s&#39;agit d&#39;un centre de signalisation hautement conservée chez les verté...

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>University of California - San Francisco</td><td>CCFDA003</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de Petri 35x10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Pinces de Dumont n°5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille au tungstène</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr><tr><td>Tube capillaire micro</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-225-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Porte-lame</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation des propriétés de signalisation ectodermique épithéliums au cours du développement cranio-facial

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

L&#39;accessibilité des embryons aviaires a aidé à comprendre les embryologistes expérimentale du sort des cellules pendant le développement et le rôle des interactions tissus qui régulent la structuration et la morphogenèse des vertébrés (par exemple, 1, 2, 3, 4). Ici, nous illustrons une méthode qui exploite cette accessibilité pour tester les propriétés de signalisation et de structuration des tissus ectodermiques lors de l&#39;élaboration du visage. Dans ces expériences, nous créons de caille-chiches 5 ou 6 souris chimères chiches en transplantant l&#39;ectoderme de surface céphalique qui recouvre la mâchoire supérieure de caille ou de la souris sur soit la même région ou d&#39;une région extra-utérine d&#39;embryons de poulet. L&#39;utilisation de la caille en tissu du donneur pour une transplantation dans les poussins a été développé pour tirer parti d&#39;un marqueur nucléolaire présente dans les cellules de caille, mais pas chiches, permettant ainsi aux enquêteurs d&#39;hôte et de distinguer les tissus des donneurs 7. De même, un élément répétitif est présent dans le génome de la souris et est exprimée de façon ubiquitaire, ce qui nous permet de distinguer les tissus hôtes et les donateurs dans les souris chimères chiches 8. L&#39;utilisation de la souris comme ectoderme tissu du donneur va augmenter considérablement notre compréhension de ces interactions tissulaires, parce que cela va nous permettre de tester les propriétés de signalisation des issues de différentes ectoderme embryons mutants.

Cet article décrit une technique de transplantation de tissus qui a été conçu pour tester les propriétés de signalisation et de structuration de la surface ectoderme céphalique au cours du développement cranio-facial.

L'accessibilité des embryons aviaires a permis aux embryologistes expérimentateurs de comprendre le devenir des cellules pendant le développement et le rôle des tissus...

L'objectif général de cette procédure est de créer des embryons chimériques en transplantant de l'ectoderme provenant d'embryons donneurs vers la mâchoire supérieure en développement d'embryons de poulet. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant l'ectoderme donneur destiné à la greffe, puis en préparant le site hôte pour l'engraftement.La dernière étape de la procédure consiste à placer le tissu donneur sur le site hôte et à fixer la greffe en position. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant un engraftement exclusif de l'ectoderme donneur, et grâce à des analyses moléculaires et morphologiques, la fonction du derme recod donneur peut être déterminée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que l'identification du rôle de divers tissus durant la morphogenèse.Le Dr. Diane, chercheuse principale de notre laboratoire, démontrera la procédure. Avant de commencer cette procédure, préparez les milieux et assurez-vous que toutes les solutions nécessaires sont disponibles et à la température appropriée. Ensuite, tout en portant une protection oculaire adéquate, étirez des tubes capillaires microscopiques jusqu'à une pointe fine au-dessus d'une flamme d'alcool.Pour fabriquer des épingles en verre, aiguisez des aiguilles en tungstène en les maintenant dans la flamme d'un chalumeau au propane. Commencez l'extraction de l'embryon donneur à partir de la coquille en plaçant un morceau de ruban adhésif sur l'extrémité de l'œuf. Utilisez ensuite la pointe d'une aiguille de dissection pour créer un petit trou au centre du ruban.Insérez une seringue de 10 millilitres et une aiguille hypodermique de calibre 18 dans le trou, puis retirez un millilitre d'albumine de l'œuf. Ensuite, à l'aide d'une aiguille de dissection, faites un petit trou en haut de la coquille. Placez un deuxième morceau de ruban adhésif pour couvrir ce trou.Pratiquez une ouverture circulaire dans l’œuf à l’aide de deux paires de forceps. Saisissez l’embryon et placez-le dans une boîte contenant du PBS glacé pour le laver. Une fois la tête de l’embryon retirée, placez-la dans une boîte de culture tissulaire contenant du DMEM sans sérum à température ambiante.Placer la boîte sous le microscope stéréoscopique tout en tenant la tête avec une pince. Utiliser des ciseaux à ressort pour disséquer grossièrement la mâchoire supérieure et le lagon du reste de la tête. Puis, à l’aide d’un porte-lame muni d’un scalpel aiguisé, découper le processus nasal frontal de la mâchoire supérieure.Utilisez une pipette pour transférer le bourgeon nasal dans une boîte de Pétri de 30 millimètres contenant un volume suffisant de solution diss dans du PBS et incubez sur de la glace pendant 20 minutes. Une fois le temps d'incubation écoulé, aspirez la solution dispa sans perturber le tissu. Ensuite, recouvrez complètement les tissus de DMEM contenant 1 % de BSA.Pour arrêter la digestion, transférez le tissu dans une nouvelle boîte de culture. Ensuite, travaillez sous un microscope stéréoscopique. Maintenez le tissu avec une aiguille de tungstène non aiguisée en utilisant une aiguille de tungstène aiguisée.Séparez l'ectoderme en le détachant des autres tissus. Une fois préparé, conservez le tissu greffon dans du DMEM contenant du BSA sur de la glace jusqu'à ce que l'hôte soit prêt pour la transplantation. À l'aide de la méthode précédemment décrite, créez une fenêtre dans l'œuf de poulet.Placer l'œuf contenant l'embryon sous le microscope stéréoscopique à l'aide de deux paires de pinces. Saisir la membrane IGN et l'amnion et déchirer doucement pour créer une ouverture et exposer l'embryon hôte. Tourner la tête en plaçant une paire de pinces sur l'œil droit et en appliquant une pression tout en maintenant la tête immobile.Utilisez un tire-lames et une aiguille pour retirer le derme hôte afin de loger la greffe. Ajoutez deux microlitres de rouge neutre dans la boîte de Pétri contenant les greffes préparées. Utilisez une pipette en verre pour transférer la greffe vers l'hôte.Placer la greffe en position pour remplacer l'ectoderme retiré. Insérer une épingle en verre dans chaque coin du tissu greffé afin de fixer la greffe en place après la greffe. Fermer hermétiquement la fenêtre avec du ruban adhésif.Replacer l'embryon dans l'incubateur jusqu'au stade de développement requis pour l'analyse. Cette image montre un tissu provenant d'un greffon urachique de poulet caille, coloré avec un anticorps spécifique à la caille anti Q-C-P-N-A. Le tissu greffé se situe entre les deux flèches. Aucune coloration QCPN n'est détectable dans le tissu mésenchymateux d'origine murine du chimère poulet-souris visible ici. Là encore, le tissu greffé se trouve entre les deux flèches, en C, après hybridation avec une sonde spécifique de la séquence répétitive sign B deux.L'analyse des gènes de classe un révèle que l'expression du marqueur B deux est restreinte à l'ombrette comprenant la greffe, montrée ici comme une image d'un chimère poulet-caille qui a été colorée par trichrome ; la coloration trichrome rend le collagène et l'os de couleur bleue. Une duplication du squelette de la mâchoire supérieure est observée, comme indiqué par la flèche. Cette image montre un chimère poulet-souris, à nouveau coloré par trichrome.On observe une duplication du squelette de la mâchoire supérieure. Cette image montre l'hybridation in situ radioactive de l'expression normale de BMP7 dans le mésenchyme d'un embryon de poulet greffé, dont le tissu provient d'un chimère souris-poulet illustré ici. On peut voir que l'expression de BMP7 est induite dans le mésenchyme adjacent au greffon, comme indiqué par la flèche.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manipulation des embryons de poulet afin d'évaluer les mécanismes régulant le développement du front et du processus nasal.

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