Évaluation des propriétés de signalisation ectodermique épithéliums au cours du développement cranio-facial

L'objectif général de cette procédure est de créer des embryons chimériques en transplantant de l'ectoderme provenant d'embryons donneurs vers la mâchoire supérieure en développement d'embryons de poulet. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant l'ectoderme donneur destiné à la greffe, puis en préparant le site hôte pour l'engraftement.

La dernière étape de la procédure consiste à placer le tissu donneur sur le site hôte et à fixer la greffe en position. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant un engraftement exclusif de l'ectoderme donneur, et grâce à des analyses moléculaires et morphologiques, la fonction du derme recod donneur peut être déterminée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que l'identification du rôle de divers tissus durant la morphogenèse.

Le Dr. Diane, chercheuse principale de notre laboratoire, démontrera la procédure. Avant de commencer cette procédure, préparez les milieux et assurez-vous que toutes les solutions nécessaires sont disponibles et à la température appropriée. Ensuite, tout en portant une protection oculaire adéquate, étirez des tubes capillaires microscopiques jusqu'à une pointe fine au-dessus d'une flamme d'alcool.

Pour fabriquer des épingles en verre, aiguisez des aiguilles en tungstène en les maintenant dans la flamme d'un chalumeau au propane. Commencez l'extraction de l'embryon donneur à partir de la coquille en plaçant un morceau de ruban adhésif sur l'extrémité de l'œuf. Utilisez ensuite la pointe d'une aiguille de dissection pour créer un petit trou au centre du ruban.

Insérez une seringue de 10 millilitres et une aiguille hypodermique de calibre 18 dans le trou, puis retirez un millilitre d'albumine de l'œuf. Ensuite, à l'aide d'une aiguille de dissection, faites un petit trou en haut de la coquille. Placez un deuxième morceau de ruban adhésif pour couvrir ce trou.

Pratiquez une ouverture circulaire dans l’œuf à l’aide de deux paires de forceps. Saisissez l’embryon et placez-le dans une boîte contenant du PBS glacé pour le laver. Une fois la tête de l’embryon retirée, placez-la dans une boîte de culture tissulaire contenant du DMEM sans sérum à température ambiante.

Placer la boîte sous le microscope stéréoscopique tout en tenant la tête avec une pince. Utiliser des ciseaux à ressort pour disséquer grossièrement la mâchoire supérieure et le lagon du reste de la tête. Puis, à l’aide d’un porte-lame muni d’un scalpel aiguisé, découper le processus nasal frontal de la mâchoire supérieure.

Utilisez une pipette pour transférer le bourgeon nasal dans une boîte de Pétri de 30 millimètres contenant un volume suffisant de solution diss dans du PBS et incubez sur de la glace pendant 20 minutes. Une fois le temps d'incubation écoulé, aspirez la solution dispa sans perturber le tissu. Ensuite, recouvrez complètement les tissus de DMEM contenant 1 % de BSA.

Pour arrêter la digestion, transférez le tissu dans une nouvelle boîte de culture. Ensuite, travaillez sous un microscope stéréoscopique. Maintenez le tissu avec une aiguille de tungstène non aiguisée en utilisant une aiguille de tungstène aiguisée.

Séparez l'ectoderme en le détachant des autres tissus. Une fois préparé, conservez le tissu greffon dans du DMEM contenant du BSA sur de la glace jusqu'à ce que l'hôte soit prêt pour la transplantation. À l'aide de la méthode précédemment décrite, créez une fenêtre dans l'œuf de poulet.

Placer l'œuf contenant l'embryon sous le microscope stéréoscopique à l'aide de deux paires de pinces. Saisir la membrane IGN et l'amnion et déchirer doucement pour créer une ouverture et exposer l'embryon hôte. Tourner la tête en plaçant une paire de pinces sur l'œil droit et en appliquant une pression tout en maintenant la tête immobile.

Utilisez un tire-lames et une aiguille pour retirer le derme hôte afin de loger la greffe. Ajoutez deux microlitres de rouge neutre dans la boîte de Pétri contenant les greffes préparées. Utilisez une pipette en verre pour transférer la greffe vers l'hôte.

Placer la greffe en position pour remplacer l'ectoderme retiré. Insérer une épingle en verre dans chaque coin du tissu greffé afin de fixer la greffe en place après la greffe. Fermer hermétiquement la fenêtre avec du ruban adhésif.

Replacer l'embryon dans l'incubateur jusqu'au stade de développement requis pour l'analyse. Cette image montre un tissu provenant d'un greffon urachique de poulet caille, coloré avec un anticorps spécifique à la caille anti Q-C-P-N-A. Le tissu greffé se situe entre les deux flèches. Aucune coloration QCPN n'est détectable dans le tissu mésenchymateux d'origine murine du chimère poulet-souris visible ici. Là encore, le tissu greffé se trouve entre les deux flèches, en C, après hybridation avec une sonde spécifique de la séquence répétitive sign B deux.

L'analyse des gènes de classe un révèle que l'expression du marqueur B deux est restreinte à l'ombrette comprenant la greffe, montrée ici comme une image d'un chimère poulet-caille qui a été colorée par trichrome ; la coloration trichrome rend le collagène et l'os de couleur bleue. Une duplication du squelette de la mâchoire supérieure est observée, comme indiqué par la flèche. Cette image montre un chimère poulet-souris, à nouveau coloré par trichrome.

On observe une duplication du squelette de la mâchoire supérieure. Cette image montre l'hybridation in situ radioactive de l'expression normale de BMP7 dans le mésenchyme d'un embryon de poulet greffé, dont le tissu provient d'un chimère souris-poulet illustré ici. On peut voir que l'expression de BMP7 est induite dans le mésenchyme adjacent au greffon, comme indiqué par la flèche.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manipulation des embryons de poulet afin d'évaluer les mécanismes régulant le développement du front et du processus nasal.