Évaluation des propriétés de signalisation ectodermique épithéliums au cours du développement cranio-facial

L’objectif global de cette procédure est de créer des embryons chimériques en transplantant l’ectoderme d’embryons de donneurs dans la mâchoire supérieure en développement d’embryons de poulet. Pour ce faire, il faut d’abord retirer le derme du donneur pour la transplantation. Ensuite, le site hôte est préparé pour la greffe.

La dernière étape de la procédure consiste à placer le tissu donneur sur le site hôte et à fixer le greffon en position. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une greffe exclusive de l’ectoderme du donneur, et grâce à l’analyse moléculaire et morphologique, la fonction du derme recod du donneur peut être déterminée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que l’identification du rôle de divers tissus au cours de la morphogenèse.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Diane, qui est une chercheuse principale de notre laboratoire. Avant de commencer cette procédure, préparez le milieu et assurez-vous que toutes les solutions requises sont accessibles et à la bonne température. Ensuite, tout en portant des lunettes de protection adéquates, tirez les microtubes capillaires vers un point fin au-dessus d’une flamme d’alcool.

Pour fabriquer des épingles en verre, aiguisez les aiguilles de tungstène en les tenant dans la flamme d’un chalumeau au propane. Commencez l’extraction de l’embryon de donneur de la coquille en plaçant un morceau de ruban adhésif sur l’extrémité de l’ovule. Shell puis utilisez la pointe d’une aiguille de dissection pour créer un petit trou au centre du ruban.

Insérez une seringue de 10 millilitres et une aiguille hypodermique de calibre 18 dans le trou et retirez un millilitre d’albumine de l’œuf. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de dissection, faites un petit trou sur le dessus de la coquille. Placez un deuxième morceau de ruban adhésif pour couvrir ce trou.

Découpez une ouverture circulaire dans l’œuf à l’aide de deux paires de pinces. Saisissez l’embryon et placez-le dans un plat de PBS glacé pour le laver. Une fois que la tête de l’embryon a été retirée, placez-la dans une boîte de culture tissulaire contenant du DMEM à température ambiante, sans sérum.

Placez la boîte sous le microscope de dissection tout en tenant la tête avec une pince. Utilisez des ciseaux à ressort pour disséquer grossièrement la mâchoire supérieure et le lagon du reste de la tête. Ensuite, à l’aide d’un porte-lame avec une lame de rasoir tranchante, coupez l’apophyse nasale frontale de la mâchoire supérieure.

À l’aide d’une pipette, transférez l’apophyse nasale fronton dans une boîte de Pétri de 30 millimètres contenant un volume suffisant de diss en PBS et incubez sur de la glace pendant 20 minutes. Une fois le temps d’incubation écoulé, aspirez la solution dispa sans perturber les tissus. Ensuite, couvrez complètement les tissus avec du DMEM contenant 1 % de BSA.

Pour arrêter la digestion, transférez le tissu dans une nouvelle boîte de culture. Ensuite, il travaille sous un microscope à dissection. Tenez le tissu avec une aiguille de tungstène non aiguisée à l’aide d’une aiguille de tungstène aiguisée.

Séparez l’ectoderme en le décollant des autres tissus. Une fois préparé, conservez le tissu greffé dans du DMEM avec BSA sur de la glace jusqu’à ce que l’hôte soit prêt pour la transplantation. En utilisant la méthode précédemment démontrée, créez une fenêtre dans l’œuf de poule.

Placez l’ovule contenant l’embryon sous le microscope de dissection à l’aide de deux paires de pinces. Saisissez la membrane IGN et l’amnion et déchirez doucement pour faire un trou et exposer l’embryon hôte. Faites pivoter la tête en plaçant une paire de pinces sur l’œil droit et en appliquant une pression tout en maintenant la tête stable.

Utilisez une langue et une aiguille pour retirer le derme hôte afin d’accueillir la greffe. Ajoutez deux microlitres de rouge neutre dans la boîte de Pétri contenant les greffons préparés. À l’aide d’une pipette en verre, transférez le greffon sur l’hôte.

Placez le greffon en position pour remplacer l’ectoderme retiré. Insérez une goupille de verre dans chaque coin du tissu greffé pour épingler le greffon en place après la greffe. Fermez hermétiquement la fenêtre avec du ruban adhésif.

Renvoyez l’embryon dans l’incubateur jusqu’au stade de développement requis pour l’analyse, cette image montre le tissu d’un poussin de caille URA qui a été coloré avec un anticorps spécifique de caille anti Q-C-P-N-A. Le tissu greffé est situé entre les deux flèches. Il n’y a aucune preuve de coloration QCPN dans le type de tissu meen d’un miroir de carillon de poussin de souris est visible ici Encore une fois, le tissu greffé est situé entre les deux flèches dans l’hybridation C deux avec une séquence répétitive spécifique approuvée au signe B deux.

En miroir, les gènes de la première classe révèlent que l’expression du signe B deux est limitée à l’ome comprenant le greffon montré ici comme une image d’un miroir de carillon de poussin de caille qui a été coloré en trichrome, la coloration au trichrome rend le collagène et l’os de couleur bleue. La duplication du squelette de la mâchoire supérieure est visible comme l’indique la flèche. Cette image montre un miroir de carillon de poussin de souris qui a été à nouveau coloré en trichrome.

Une duplication du squelette de la mâchoire supérieure est observée. Cette image montre l’hybridation radioactive en C deux de l’expression normale de BMP sept dans le méchy d’un embryon de poussin en radeau, montré ici est du tissu d’un miroir de carillon de poussin de souris. On peut voir que l’expression de BMP sept est induite dans le méchy adjacent au greffon comme indiqué par la flèche.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler les embryons de poussin pour évaluer les mécanismes qui régulent le développement du processus frontal et nasal.