Orthotopique xénogreffe de l'homme-luciférase Tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur Gaine pour In vivo Test d'agents thérapeutiques candidats

Une méthode pour greffer de manière fiable la luciférase taggés humaines malignes des cellules nerveuses périphériques gaine de la tumeur dans le nerf sciatique de souris immunodéficientes est décrite. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence pour démontrer établissement correct des greffes tumorales et les critères de la ségrégation aléatoire des animaux dans des groupes d'étude sont également discutées.

L’objectif global de cette procédure est de déterminer si un agent thérapeutique candidat inhibe efficacement la croissance des cellules M-P-N-S-T greffées dans le nerf sciatique de souris immunodéficientes. Pour ce faire, il suffit d’abord de retirer les cellules tumorales d’une fiole de tissu, de les laver et de les suspendre à la bonne concentration. La deuxième étape de la procédure consiste à exposer chirurgicalement le nerf sciatique, puis à injecter au nerf 5 000 cellules.

L’étape suivante consiste à déterminer le succès de la greffe à l’aide de l’imagerie in vivo, basée sur la lumière, randomisant le CIN pour les groupes d’étude et à commencer le traitement avec l’agent thérapeutique candidat. La dernière étape de la procédure consiste à collecter les tumeurs 30 jours après la greffe et à analyser les effets de l’agent thérapeutique candidat sur la tumeur. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent si l’agent thérapeutique a diminué la croissance tumorale grâce à des méthodes telles que la comparaison des poids tumoraux, l’examen des taux relatifs de prolifération par immunocoloration pour KI 67 et l’évaluation des niveaux de mort des cellules tumorales chez les souris témoins et traitées avec des tests tunnel.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la greffe sous-cutanée, c’est qu’elle modélise le microenvironnement normal, ce qui modélise mieux la croissance M-P-N-S-T démontrant cette technique sera Amy Turk, une technicienne de mon laboratoire. Des souris immunodéficientes non nues sont préparées la veille de la greffe. Utilisez une tondeuse pour raser les cheveux d’une souris anesthésiée travaillant sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle.

Utilisez un agent dépilatoire chimique pour enlever les poils restants. Une fois tous les poils enlevés, placez la souris sur un coussin chauffant dans une cage d’isolement sans litière jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie. Le jour de la greffe, centrifugez les cellules à 3000 tr/min pendant cinq minutes.

Retirez le snat avec précaution et remettez en suspension la pastille cellulaire dans du DMEM 10 sans mycine pure à une concentration finale de cinq fois 10 pour les troisièmes cellules par trois microlitres. Gardez les cellules sur de la glace jusqu’au moment de l’utiliser. Pour commencer, placez un animal anesthésié sur un coussin chauffant et appliquez une pommade ophtalmique sur chaque œil.

Fixez une étiquette d’oreille avec un numéro d’identification unique à l’oreille droite de chaque souris. Pour faciliter l’identification tout au long de l’étude, placez l’animal sur le ventre et écartez ses pattes arrière. Couvrez la souris avec un champ stérile et exposez une fenêtre chirurgicale où la greffe aura lieu.

Appliquez la bétadine sur le site chirurgical à l’aide d’un applicateur à embout de coton, en commençant par le centre du flanc et en spiralant progressivement vers l’extérieur jusqu’aux bords de la fenêtre chirurgicale. De l’éthanol à 70 % est ensuite appliqué sur le site chirurgical de la même manière. Des applications consécutives de bétadine suivie d’éthanol sont répétées deux fois de plus.

Retirez les cellules de la glace et faites un léger vortex ou agitez le tube pour remettre en suspension les cellules décantées. À l’aide d’une pipette, prélevez 3,2 microlitres de suspension cellulaire et éjectez-la sur un morceau de paraforme. Tirez trois microlitres de suspension cellulaire dans une seringue Hamilton de 10 microlitres.

Équipé d’une aiguille de calibre 33. Tenez les cellules et la cellule contenant la seringue sur de la glace jusqu’au moment de l’utiliser. À l’aide d’un manche de scalpel numéro quatre, équipé d’une lame de scalpel numéro 22, faites une incision à travers la peau du flanc juste en dessous et parallèlement au fémur.

Ouvrez l’incision cutanée avec la pince chirurgicale pour exposer le muscle sous-jacent. Utilisez une paire de ciseaux à pointe pointue pour disséquer émoussé à travers le fascia qui s’étend sur toute la longueur de la jambe et exposer le nerf sciatique qui se trouve sous une structure linéaire blanche de l’épaisseur d’un fil épais travaillant au microscope. Utilisez une paire de pinces incurvées à pointe pointue pour disséquer soigneusement sous le nerf, en le détachant du muscle sous-jacent.

Laissez la pince en place pour maintenir le nerf à la fois élevé et isolé avec précaution Insérez l’aiguille de la seringue Hamilton dans le nerf en essayant de maintenir l’angle d’injection aussi parallèle que possible avec le nerf, afin de ne pas percer jusqu’à la face inférieure. Une fois que l’aiguille est correctement positionnée dans le nerf, relâchez la tension produite par la pince et injectez lentement les cellules sur une période de 45 à 60 secondes. Une injection lente est essentielle pour éviter un ressac des cellules tumorales entraînant leur perte.

Une fois que toutes les cellules ont été injectées avec succès, retirez lentement l’aiguille pour minimiser la perte de matériau injecté. Une fois l’injection terminée, retirez la pince chirurgicale et la pince. Ensuite, remettez soigneusement le nerf à son emplacement d’origine.

Fermez l’incision avec de la colle chirurgicale vet bond, en la maintenant ensemble avec une pince pendant environ 20 secondes pour permettre à la colle de sécher. Placez l’animal dans une cage chauffée et exempte de litière jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Surveillez la santé des souris.

Les souris quotidiennes sont retirées de l’étude. Si la charge tumorale dépasse 10 % du poids corporel normal de l’animal ou si la perte de poids dépasse 20 %Pour déterminer le succès de la procédure, effectuez une imagerie de bioluminescence un et trois jours après la greffe. Injectez à une souris 2,5 milligrammes de Lucifer et placez l’animal anesthésié sur la plate-forme d’imagerie chauffée.

L’émission de lumière de la luciférase exprimée par la luciférase exprimée par la tumeur est détectée 10 minutes après l’injection du substrat. À l’aide du logiciel Xeno Gen, réglez les temps d’acquisition d’images sur une plage d’une seconde à 10 minutes. Ensuite, prenez des photos en noir et blanc des souris Pseudocolor.

L’échelle de la bioluminescence est superposée à ces images pour fournir une mesure de l’intensité de l’émission de lumière. Pour être éligibles à l’inclusion dans une cohorte d’essais précliniques, les souris doivent avoir un signal de bioluminescence détectable, à la fois un et trois jours après la greffe, et l’intensité du signal doit augmenter entre le premier et le troisième jour. On voit ici une augmentation progressive typique de la bioluminescence observée un à 18 jours après la greffe dans une xénogreffe orthotopique correctement établie chez une souris nue.

Notez la similitude des signaux détectés dans la région d’intérêt des différentes souris. La réimagerie 10 jours et 18 jours après la greffe montre que les signaux bioluminescents augmentent progressivement au site de greffe chez les souris individuelles. La quantification des signaux bioluminescents observés un à 24 jours après la greffe montre que, bien que ces signaux augmentent progressivement, la croissance tumorale s’accélère nettement dans les derniers stades de la période d’étude.

Compte tenu de la croissance agressive de M pns ts, les cellules tumorales greffées franchissent souvent les barrières normales du nerf et envahissent les tissus adjacents. Cette photomicrographie du site de greffe démontre la croissance tumorale et l’invasion focale dans le muscle squelettique adjacent Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée chez une souris en 10 minutes lorsqu’elle est effectuée correctement.