Name: Orthotopique xénogreffe de lhomme-luciférase Tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur Gaine pour In vivo Test dagents thérapeutiques candidats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Découvrez la xénogreffe orthotopique de cellules tumorales de gaine nerveuse périphérique marquées à la luciférase chez la souris immunodéficiente. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité d'agents thérapeutiques candidats par imagerie de bioluminescence in vivo.

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La méthode détaillée orthotopique xénogreffe présenté ici est celui que nous avons développés en utilisant des cellules MPNST ST88-14, une ligne qui est largement utilisé dans les études de ces NF1 associée tumeurs des gaines nerveuses périphériques. Toutefois, cette méthodologie est facilement adaptable pour des études précliniques avec d&#39;autres lignées cellulaires MPNST. Par exemple, nous avons également procédé orthotopique xénogreffe avec STS-26T 10 cellules, une ligne dérivée d&#39;une sporadique MPNST et T265-2c 11 cellules, qui sont issus d&#39;un MPNST NF1-associé, avec un succès similaire à celui observé avec ST88 -14 cellules. Cela dit, nous notons que les conditions exactes que nous décrivons ici pour orthotopique xénogreffe de cellules ST88-14 ne peuvent pas être directement adopté pour le greffage de lignes MPNST autres. Au lieu de cela, les paramètres clés de la méthodologie doit être déterminé empiriquement pour chaque lignée cellulaire. Ces paramètres incluent le nombre de cellules greffées MPNST d&#39;abord, le temps alloué pour le développement du greffon et, dans une moindre mesure, le volume dans lequel les cellules tumorales sont injectées. Pour établir ces paramètres pour une nouvelle ligne, nous greffons des groupes de souris (5 souris par groupe) avec 10 3 à 5 x 10 6 cellules tumorales, en vérifiant deux concentrations de cellules pour chaque ordre de grandeur (c&#39;est à dire, 10 3 cellules, 5 x 10 3 cellules, 10 4 cellules, 5 x 10 4 cellules, etc.) Plus grand nombre de cellules tumorales (&gt; 10 6) doit être injecté dans un volume plus important, nous avons constaté que jusqu&#39;à 5 ml peuvent être injectés sans perte de cellules du nerf greffé. Nous avons également constaté que pas plus de 5 x 10 6 cellules tumorales par 5 ml de volume peut être injecté sous forme de suspensions denses de plus en plus enclins à cisaillement qui tue les cellules tumorales. Nous suivons ces souris au moins jusqu&#39;à trois animaux au sein de chaque groupe ont des tumeurs palpables, à quel point nous résilions ce groupe et d&#39;examiner le nerf histologiquement pour confirmer la croissance du greffon. Évidemment, le temps nécessaire pour atteindre ce point sera différent, selon le nombre de cellules injectées, en général, nous cherchons une concentration de cellules qui atteindra maximale permise croissance tumorale dans les 30-60 jours. Une croissance plus rapide, il peut être difficile à atteindre des concentrations thérapeutiques efficaces avant la résiliation de l&#39;expérience et / ou empêcher la collecte de suffisamment de points de données d&#39;imagerie par bioluminescence au cours des expériences. Un cours de temps plus de 60 jours rend le réglage des paramètres expérimentaux lourds et prolonge inutilement la durée de l&#39;expérimentation prévue. Enfin, nous aimerions aussi noter que nous avons utilisé cette méthodologie orthotopique xénogreffe avec ST88-14 cellules greffées à des souris NIH III pour démontrer l&#39;efficacité thérapeutique du tamoxifène 6. Une description détaillée des méthodes que nous utilisons pour évaluer systématiquement les effets des agents thérapeutiques candidats sur des xénogreffes orthotopique peuvent être trouvés dans ce manuscrit. Il a également été démontré que les cellules neurofibrome peut être avec succès greffé dans des nerfs périphériques 12, ce qui suggère que, avec les adaptations, les procédures décrites dans ce protocole peut être utilisé pour effectuer des essais précliniques avec des agents thérapeutiques candidats dirigée contre neurofibromes.

<table><tbody><tr><td>Souris SCID Foxchase non consanguines</td><td>Charles River Laboratories</td><td>#236</td><td></td></tr><tr><td>Souris NIH III</td><td>Taconic</td><td>#NIHBNX</td><td></td></tr><tr><td>Souris NOD-SCID&amp;#947;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>Détacheur de cellules (Cell Stripper)</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-056-cl</td><td></td></tr><tr><td>Colle chirurgicale Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>#80030</td><td>volume de 10 &amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Aiguilles pour seringue Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>#7803-05</td><td>33 Ga., 0,5 pouce, PT4 (fabriquée sur commande)</td></tr><tr><td>Marques d'oreille</td><td>National Band and Ear Tag Co.</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

orthotopique xénogreffe de l&#39;homme-luciférase tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur gaine pour in vivo test d&#39;agents thérapeutiques candidats

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Bien que dans les écrans vitro sont essentiels pour l&#39;identification initiale des agents thérapeutiques candidats, une évaluation rigoureuse de la capacité du médicament à inhiber la croissance tumorale doivent être effectuées dans un modèle animal approprié. Le type de modèle animal qui convient le mieux à cette fin est un sujet de discussion intense. Certaines preuves indiquent que des essais précliniques portant sur ​​les effets des médicaments sur les tumeurs provenant de souris transgéniques sont plus prédictifs de l&#39;issue clinique 1 et donc agents thérapeutiques candidats sont souvent testés dans ces modèles. Malheureusement, les modèles transgéniques ne sont pas disponibles pour de nombreux types de tumeurs. En outre, les modèles transgéniques ont souvent d&#39;autres limitations telles que des préoccupations quant à la façon dont les modèles tumoraux de souris son homologue humain, une pénétrance incomplète du phénotype tumoral et une incapacité à prédire quand les tumeurs se développent. En conséquence, de nombreux chercheurs utilisent des modèles de xénogreffe (cellules tumorales humaines greffées dans des souris immunodéficientes) pour des essais précliniques, le cas échéant des modèles tumoraux transgéniques ne sont pas disponibles. Même si les modèles transgéniques sont disponibles, ils sont souvent en partenariat avec des modèles de xénogreffe comme la dernière de faciliter la détermination rapide des gammes thérapeutiques. En outre, ce partenariat permet une comparaison de l&#39;efficacité de l&#39;agent dans les tumeurs transgéniques et authentique des cellules tumorales humaines. Historiquement, xénogreffe a souvent été effectué en injectant les cellules tumorales par voie sous cutanée (xénogreffes ectopiques). Cette technique est rapide et reproductible, relativement peu coûteux et permet la quantification de la croissance tumorale en continu pendant la période thérapeutique 2. Toutefois, l&#39;espace sous-cutané n&#39;est pas le microenvironnement normale pour la plupart des tumeurs et donc les résultats obtenus avec xénogreffe ectopique peut être trompeuse en raison de facteurs tels que l&#39;absence d&#39;organe de l&#39;expression spécifique du tissu hôte et des gènes tumoraux. Il a ainsi été fortement recommandé que les études de la greffe ectopique être remplacées ou complétées par des études dans lesquelles des cellules tumorales humaines sont greffés dans leur tissu d&#39;origine (xénogreffe orthotopique) 2. Malheureusement, la mise en œuvre de cette recommandation est souvent contrarié par le fait que les méthodologies xénogreffe orthotopique n&#39;ont pas encore été développé pour de nombreux types de tumeurs. Malignes tumeurs des gaines nerveuses périphériques (MPNSTs) sont des sarcomes très agressif qui se produisent sporadiquement ou en association avec une neurofibromatose de type 1 3 et le plus souvent se poser dans le nerf sciatique 4. Nous décrivons ici une méthode techniquement simple dans lequel la luciférase de luciole-taggés cellules humaines sont MPNST orthopically xénogreffées dans le nerf sciatique de souris immunodéficientes. Notre approche visant à évaluer le succès de la procédure de greffe chez des animaux individuels et ultérieures de randomisation non biaisée en groupes d&#39;étude est également discuté.

Une méthode pour greffer de manière fiable la luciférase taggés humaines malignes des cellules nerveuses périphériques gaine de la tumeur dans le nerf sciatique de souris immunodéficientes est décrite. L&#39;utilisation de l&#39;imagerie par bioluminescence pour démontrer établissement correct des greffes tumorales et les critères de la ségrégation aléatoire des animaux dans des groupes d&#39;étude sont également discutées.

Orthotopique xénogreffe de l&#39;homme-luciférase Tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur Gaine pour In vivo Test d&#39;agents thérapeutiques candidats

Bien que les criblages in vitro soient essentiels pour l'identification initiale d'agents thérapeutiques candidats, une évaluation rigoureuse de la capacité du médicament à...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer si un agent thérapeutique candidat inhibe efficacement la croissance de cellules M-P-N-S-T greffées dans le nerf sciatique de souris immunodéficientes. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant les cellules tumorales à partir d'un flacon de culture, en les lavant puis en les resuspendant à la concentration appropriée. La deuxième étape de la procédure consiste à exposer chirurgicalement le nerf sciatique, puis à injecter 5 000 cellules dans le nerf.L'étape suivante consiste à déterminer le succès de la greffe en utilisant une imagerie in vivo basée sur la lumière, en randomisant les CIN en groupes d'étude et en commençant le traitement avec l'agent thérapeutique candidat. La dernière étape de la procédure est de prélever les tumeurs 30 jours après la greffe et d'analyser les effets que l'agent thérapeutique candidat a eus sur la tumeur. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant si l'agent thérapeutique a réduit la croissance tumorale par des méthodes telles que la comparaison des masses tumorales, l'analyse des taux relatifs de prolifération par immunomarquage de KI 67 et l'évaluation des niveaux de mort cellulaire tumorale chez les souris témoins et traitées à l'aide de tests TUNEL.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la greffe sous-cutanée, est qu'elle modélise le microenvironnement normal, ce qui permet une meilleure modélisation de la croissance du M-P-N-S-T. La démonstration de cette technique sera assurée par Amy Turk, une technicienne de mon laboratoire. Les souris immunodéficientes non nues sont préparées la veille de la greffe. Utilisez un tondeur pour raser les poils d'une souris anesthésiée, en travaillant sur un coussin chauffant afin de maintenir la température corporelle.Utilisez un agent dépilatoire chimique pour éliminer les poils restants. Une fois tous les poils enlevés, placez la souris sur un tapis chauffant dans une cage d'isolement sans litière jusqu'à ce qu'elle soit complètement réanimée. Le jour de la greffe, centrifugez les cellules à 3000 tr/min pendant cinq minutes.Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans du DMEM 10 sans pur mycine à une concentration finale de cinq fois 10 à la puissance trois cellules par trois microlitres. Conservez les cellules sur de la glace jusqu'à leur utilisation. Pour commencer, placez un animal anesthésié sur un tapis chauffant et appliquez une pommade ophtalmique sur chaque œil.Clipser une puce d'oreille portant un numéro d'identification unique à l'oreille droite de chaque souris. Pour faciliter l'identification tout au long de l'étude, placer l'animal en décubitus ventral et écarter ses pattes postérieures. Recouvrir la souris d'un champ stérile et exposer une fenêtre chirurgicale là où la greffe sera réalisée.Appliquez de la Bétadine sur le site chirurgical à l'aide d'un applicateur en coton en partant du centre du flanc et en spirale progressivement vers les bords de la fenêtre chirurgicale. De l'éthanol à 70 % est ensuite appliqué sur le site chirurgical de la même manière. Répétez deux fois supplémentaires des applications consécutives de Bétadine suivies d'éthanol.Retirer les cellules de la glace et, soit les vortexer doucement, soit taper légèrement sur le tube pour resuspendre les cellules déposées. Utiliser une pipette pour prélever 3,2 microlitres de la suspension cellulaire et l'expulser sur un morceau de paraforme. Aspirer trois microlitres de la suspension cellulaire dans une seringue Hamilton de 10 microlitres.Équipé d'une aiguille de calibre 33. Garder les cellules et la seringue contenant les cellules sur de la glace jusqu'au moment de l'utilisation. Utiliser un manche de bistouri n°4, équipé d'une lame de bistouri n°22, pour pratiquer une incision à travers la peau du flanc juste en dessous et parallèlement au fémur.Ouvrir l'incision cutanée avec la pince chirurgicale afin d'exposer le muscle sous-jacent. Utiliser une paire de ciseaux à pointes fines pour disséquer en émoussant l'aponévrose qui s'étend sur la longueur de la jambe, et exposer le nerf sciatique situé sous une structure linéaire blanche d'une épaisseur comparable à celle d'un fil épais, en travaillant au microscope. Utiliser une paire de pinces courbes à pointes fines pour disséquer délicatement sous le nerf, en le libérant du muscle sous-jacent.Laisser la pince en place afin de maintenir le nerf à la fois surélevé et soigneusement isolé. Introduire l'aiguille de la seringue Hamilton dans le nerf en essayant de conserver un angle d'injection aussi parallèle que possible par rapport au nerf, afin de ne pas le transpercer jusqu'à sa face inférieure. Une fois l'aiguille correctement positionnée dans le nerf, relâcher la tension exercée par la pince et injecter lentement les cellules sur une durée de 45 à 60 secondes. Une injection lente est essentielle pour éviter un reflux des cellules tumorales, qui entraînerait leur perte.Une fois que toutes les cellules ont été injectées avec succès, retirez lentement l'aiguille afin de minimiser la perte du matériel injecté. Une fois l'injection terminée, retirez la pince chirurgicale et la pince à épiler. Ensuite, replacez soigneusement le nerf à son emplacement d'origine.Fermer l'incision avec de la colle chirurgicale Vet Bond, en la maintenant fermée avec une pince pendant environ 20 secondes pour permettre à la colle de sécher. Placer l'animal dans une cage chauffée, sans litière, jusqu'à ce qu'il soit complètement réveillé. Surveiller l'état de santé des souris.Les souris sont retirées quotidiennement de l'étude. Si la charge tumorale dépasse 10 % du poids corporel normal de l'animal ou si la perte de poids excède 20 %, pour déterminer la réussite de la procédure, effectuez une imagerie bioluminescente un jour et trois jours après la greffe. Injectez une souris avec 2,5 milligrammes de luciférine et placez l'animal anesthésié sur la plateforme d'imagerie chauffée.L'émission de lumière provenant de la luciférase de luciole exprimée par la tumeur est détectée 10 minutes après l'injection du substrat. À l'aide du logiciel de Xeno Gen, réglez les durées d'acquisition d'images sur une plage allant d'une seconde à 10 minutes. Ensuite, prenez des photographies en noir et blanc des souris et appliquez une coloration pseudocolor.La gradation de la bioluminescence est superposée à ces images afin de fournir une mesure de l'intensité de l'émission lumineuse. Pour être éligible à l'inclusion dans un groupe d'essai préclinique, les souris doivent présenter un signal de bioluminescence détectable à la fois un et trois jours après la greffe, et l'intensité du signal doit augmenter entre le jour un et le jour trois. On observe ici une augmentation typique et progressive de la bioluminescence entre le jour 1 et le jour 18 après la greffe, dans un xénogreffe orthotopique correctement établi chez une souris nude.Remarquez la similitude des signaux détectés dans la région d'intérêt de différentes souris. La réimagerie effectuée 10 et 18 jours après la greffe montre que les signaux bioluminescents augmentent progressivement sur le site de greffe chez des souris individuelles. La quantification des signaux bioluminescents observés entre un et 24 jours après la greffe révèle que, bien que ces signaux augmentent progressivement, la croissance tumorale s'accélère nettement lors des stades ultérieurs de la période d'étude.Étant donné la croissance agressive des cellules de M pns ts, les cellules tumorales greffées franchissent souvent les barrières normales du nerf et envahissent les tissus adjacents. Cette microphotographie du site de greffe montre la croissance tumorale et une invasion focale dans le muscle squelettique adjacent. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 minutes sur une souris, si elle est bien exécutée.

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Orthotopique xénogreffe de lhomme-luciférase Tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur Gaine pour In vivo Test dagents thérapeutiques candidats (Vidéo) | JoVE Journal

Orthotopique xénogreffe de l'homme-luciférase Tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur Gaine pour In vivo Test d'agents thérapeutiques candidats

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