Efficace polyéthylène glycol transformation médiée (PEG) de la mousse Physcomitrella patens
19 avril 2011
Une méthode simple et efficace pour transformer Pantens Physcomitrella Protoplastes est décrite. Cette méthode est adaptée à partir des protocoles de Physocmitrella Protonemal protoplastes et Arabidopsis Transformation de protoplastes de mésophylle 1.
L'objectif général de cette procédure est de transformer des protoplastes de SCO Metre. Cette transformation est réalisée en digérant d'abord les plantes avec du Drizly. Ensuite, les protoplastes sont lavés avec du mannitol pour éliminer le Drizly, puis incubés avec de l'ADN et du PEG.
Enfin, les protoplastes transformés sont étalés sur des boîtes de culture et incubés. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant les protoplastes transformés exprimant des protéines marquées par fluorescence grâce à la microscopie en fluorescence. La démonstration de cette procédure sera effectuée par Y. Lu, postdoctorant de mon laboratoire.
L'avantage principal de cette technique est qu'elle est efficace et produit de manière constante des protoplastes exprimant la protéine d'intérêt. Pour isoler les protoplastes de mousse, commencez par ajouter neuf millilitres de mannitol à 8 % dans une boîte de Pétri à l'aide d'une spatule. Placez dans le mannitol une mousse âgée de cinq à sept jours provenant de deux à trois plaques PP NH4. Veuillez consulter le protocole écrit accompagnant pour celui-ci ainsi que pour les recettes de réactifs supplémentaires. Ensuite, ajoutez trois millilitres de Drizly à 2 % et incubez à température ambiante sous agitation douce pendant une heure.
Filtrez le mélange à travers une maille de 100 microns pour obtenir une suspension homogène verte. Ensuite, centrifugez le filtrat à 250 G pendant cinq minutes. Jetez délicatement le surnageant.
Resuspendre les protoplastes dans 500 microlitres de mannitol à 8 %. Puis ajouter 9,5 millilitres supplémentaires de mannitol à 8 %. S'assurer que les protoplastes sont complètement en suspension.
Effectuer les étapes de lavage deux fois supplémentaires en centrifugeant à nouveau la solution à 250 G pendant cinq minutes. Jeter le surnageant et resuspendre les protoplastes, d'abord dans 500 microlitres.
Ensuite, 9,5 millilitres de mannitol à 8 % à l’aide d’un cytomètre hématique. Comptez le nombre de protoplastes dans 10 microlitres de la suspension afin de transformer l’ADN dans les protoplastes isolés. Dans un premier temps, centrifugez le mélange de protoplastes à 250 ×g pendant cinq minutes.
Éliminer le surnageant et resuspendre les protoplastes à 1,6 million par millilitre dans la solution MMG. Incuber la suspension à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, ajouter 600 microlitres de la solution de protoplastes dans un tube de culture contenant 60 microgrammes d'ADN. Agiter.
Ajouter délicatement 700 microlitres de solution de PEG au calcium et agiter. Incuber correctement l'échantillon à température ambiante pendant 30 minutes durant cette période d'attente. Recouvrir les plaques PRMB de cellophane.
Ensuite, diluez la suspension avec trois millilitres de solution W5 et centrifugez à 250 ×g pendant cinq minutes. Pour éliminer le PEG, resuspendez les protoplastes dans deux millilitres de milieu PRMT et plaquez un millilitre par boîte de Petri PRMB recouverte de cellophane. Conservez les boîtes à 25 degrés Celsius dans une chambre de croissance.
Enfin, quatre jours après la transformation, transférez la cellophane sur des nouvelles plaques de sélection. Cette figure montre un exemple de plantes âgées de 18 jours régénérées à partir de protoplastes, transformés avec 15 microgrammes d'ADN plasmidique en forme de superhélice, portant une cassette de résistance à l'hygromycine. Ici, 30 microgrammes du même ADN plasmidique en forme de superhélice ont été transformés dans des protoplastes.
Soixante microgrammes d'ADN de type «plaid» ont été transformés dans cet échantillon. Et finalement, ces plantes ont été régénérées à partir de protoplastes ayant été transformés avec 120 microgrammes du même ADN plasmidique en forme de superhélice portant la cassette de résistance à l'hygromycine. L'efficacité de la transformation n'est pas affectée par des concentrations d'ADN allant jusqu'à 60 microgrammes.
Cependant, des concentrations plus élevées d'ADN sont préjudiciables à cette procédure. Les données indiquent que cette méthode fournit des résultats reproductibles sur une large gamme de quantités d'ADN Une fois le semestre. Cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement.
Après cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que l'ARNi transitoire et les invalidations génétiques peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions concernant la fonction des gènes.
Aperçu
Cet article décrit une méthode simple et efficace pour transformer des protoplastes de Physcomitrella patens. La technique est adaptée des protocoles existants de transformation des protoplastes et vise à produire des résultats constamment satisfaisants.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie végétale
- Génie génétique
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les protoplastes sont des cellules végétales dont la paroi cellulaire a été retirée.
- Les techniques de transformation sont essentielles pour l'étude de la fonction des gènes chez les plantes.
- Physcomitrella patens sert d'organisme modèle dans la recherche végétale.
- Les méthodes existantes de transformation des protoplastes peuvent être complexes et longues.
Objectif de l'étude
- Proposer un protocole simplifié pour la transformation de protoplastes de Physcomitrella patens.
- Améliorer l'efficacité et la fiabilité de la transformation des protoplastes.
- Faciliter des études génétiques ultérieures chez les mousses.
Méthodes utilisées
- Digérer le tissu de mousse avec du Drizly pour isoler les protoplastes.
- Laver les protoplastes avec du mannitol pour éliminer les contaminants.
- Transformer les protoplastes isolés avec de l'ADN en utilisant du PEG.
- Incuber les protoplastes transformés sur un milieu sélectif.
Résultats principaux
- Les protoplastes transformés ont exprimé avec succès des protéines fluorescentes.
- La méthode a montré une efficacité de transformation constante à différentes concentrations d'ADN.
- Des concentrations plus élevées d'ADN se sont révélées préjudiciables au succès de la transformation.
- L'ensemble de la procédure peut être réalisé en environ trois heures.
Conclusions
- Cette méthode offre une approche fiable pour la transformation de protoplastes de Physcomitrella patens.
- Elle permet des expériences ultérieures telles que l'ARNi transitoire et les invalidations génétiques.
- Le protocole peut grandement contribuer à la compréhension de la fonction des gènes chez les mousses.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La transformation médiée par PEG de protoplastes de Physcomitrella patens permet une livraison de gènes efficace et reproductible, soutenant la génomique fonctionnelle à haut débit dans les systèmes végétaux. Cette capacité est essentielle pour les équipes de découverte précoce cherchant à explorer la fonction des gènes, valider des cibles et accélérer l'élucidation des voies métaboliques dans un modèle génétiquement manipulable. La possibilité de mettre à l'échelle et de normaliser cette méthode la rend précieuse pour le criblage génétique à l'échelle du portefeuille et pour la réduction des risques mécanistiques.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une interrogation rapide de la fonction des gènes grâce à une livraison efficace d'ADN dans les cellules de mousse.
- Prend en charge le ciblage génique à haute fréquence pour la validation fonctionnelle des cibles et l'analyse des voies biologiques.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en permettant des modifications génétiques précises dans un système modèle.
- Améliore la confiance prédictive pour les hypothèses biologiques ultérieures.
Tests et développement de dosages
- Propose un protocole standardisé pour générer un grand nombre de transformants destinés à des tests de criblage.
- Assure une efficacité de transformation reproductible, soutenant la fiabilité et l'évolutivité des tests.
- Permet la préparation de systèmes biologiques validés pour l'évaluation de composés et le criblage phénotypique.
- Réduit la dépendance à l'égard d'équipements spécialisés, augmentant ainsi l'accessibilité pour les équipes de développement de tests.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet des applications ultérieures telles que les études d'ARNi transitoire et de délétion génique pertinentes pour la modélisation des maladies.
- Assure une continuité allant de la découverte génique à la validation préclinique dans des systèmes à base de plantes.
- Offre une plateforme pour l'exploration translationnelle de biomarqueurs lorsqu'elle est associée à des voies pertinentes pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole de transformation s'inscrit dans la continuité entre la découverte précoce et l'identification de composés candidats, permettant la manipulation génétique, la validation de cibles et le développement de tests dans des modèles végétaux.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification des hypothèses et la clarification des voies grâce à une livraison efficace des gènes et à l'analyse de leur expression.
- Criblage : Favorise la préparation et la reproductibilité des tests en générant des populations de transformants cohérentes.
- Analytique : Fournit des données quantitatives telles que l'efficacité de transformation et l'expression protéique pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Permet des études génétiques qui orientent le développement de modèles précliniques et l'identification de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une capacité de transformation standardisée et largement applicable pour diverses études génétiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études sur la fonction des gènes.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des protocoles de transformation génétique.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/non aller » et l'efficacité du capital en permettant une génération robuste de données précoces.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustées au risque, des cibles et voies génétiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire végétale et en technique stérile pour l'isolement et la transformation de protoplastes.
- Suppose l'accès à une infrastructure de laboratoire de base, incluant la centrifugation et la microscopie à fluorescence pour la validation des résultats.
- Exige une standardisation inter-équipes des paramètres de transformation afin d'assurer la reproductibilité entre les projets.
- Pourrait nécessiter des adaptations afin d'être utilisé chez d'autres espèces végétales ou systèmes modèles autres que Physcomitrella patens.
- L'efficacité de la transformation est sensible à la concentration d'ADN, des quantités plus élevées pouvant être préjudiciables.
