Efficace polyéthylène glycol transformation médiée (PEG) de la mousse Physcomitrella patens
19 avril 2011
Une méthode simple et efficace pour transformer Pantens Physcomitrella Protoplastes est décrite. Cette méthode est adaptée à partir des protocoles de Physocmitrella Protonemal protoplastes et Arabidopsis Transformation de protoplastes de mésophylle 1.
L’objectif global de cette procédure est de transformer les protoplastes métriques SCO. Ceci est accompli en digérant d’abord les plantes avec Drizly. Ensuite, les protoplastes sont lavés avec du mannitol pour éliminer le drizly, puis sont incubés avec de l’ADN et du peg.
Enfin, les protoplastes transformés sont étalés sur des plaques et incubés. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus. Cela montre des protoplastes transformés exprimant des protéines marquées par fluorescence par microscopie à fluorescence La démonstration de la procédure sera Y lu, un post-doctorant de mon laboratoire.
Le principal avantage de cette technique est qu’elle est efficace et génère constamment des protoplastes qui expriment la protéine d’intérêt Pour isoler la mousse Protoplastes Commencez par ajouter neuf millilitres de mannitol à 8 % dans une boîte de Pétri à l’aide d’une spatule Placez de la mousse de cinq à sept jours de deux à trois PP NH quatre plaques dans le mannitol. Veuillez consulter le protocole écrit ci-joint pour cela et des recettes de réactifs supplémentaires. Ensuite, ajoutez trois millilitres de drizly à 2 % et incubez à température ambiante en secouant doucement pendant une heure.
Filtrer le mélange à travers une maille de 100 microns pour obtenir une suspension homogène verte. Faites ensuite tourner le filtrat à 250 G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant très doucement.
Remettre en suspension les protoplastes dans 500 microlitres de mannitol à 8 %. Ajoutez ensuite 9,5 millilitres supplémentaires de mannitol à 8 %. Assurez-vous que les protoplastes sont complètement suspendus.
Effectuez les étapes de lavage deux fois de plus en essorant à nouveau la solution à 250 G pendant cinq minutes. Élimination du surnageant et du résus suspendant les protoplastes. Premier en 500 microlitres.
Puis 9,5 millilitres de mannitol à 8 % à l’aide d’un hémocytomètre. Comptez le nombre de protoplastes dans 10 microlitres de suspension pour transformer l’ADN en protoplastes isolés. Tout d’abord, faites tourner le mélange de protoplastes à 250 G pendant cinq minutes.
Retirez le surnageant, remettez en suspension les protoplastes à 1,6 million par millilitre dans une solution MMG. Incuber la suspension à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de la solution Protoplasts dans un tube de culture contenant 60 microgrammes d’ADN. Secouer.
Ajoutez doucement 700 microlitres de solution de calcium PEG et agitez. Bien incuber l’échantillon à température ambiante pendant 30 minutes pendant cette période d’attente. Recouvrez les plaques PRMB de cellophane.
Diluez ensuite la suspension avec trois millilitres de solution W cinq, essorez à 250 G pendant cinq minutes. Pour retirer le PEG remis en suspension, les protoplastes dans deux millilitres de plaque PRMT un millilitre par plaque PRMB recouverte de cellophane. Conservez les plaques à 25 degrés Celsius dans une chambre de croissance.
Enfin, quatre jours après la transformation, déposez la cellophane sur des plaques de sélection fraîches. Cette figure montre un exemple de plantes âgées de 18 jours régénérées à partir de protoplastes, transformées avec 15 microgrammes de plasma super enroulé, l’ADN, portant une cassette de résistance à l’hygromycine. Ici, 30 microgrammes du même plasmide super enroulé, l’ADN, ont été transformés en protoplastes.
60 microgrammes d’ADN plaid ont été transformés dans cet échantillon. Et enfin, ces plantes ont été régénérées à partir de protoplastes qui ont été transformés avec 120 microgrammes du même ADN plasma super-enroulé portant la cassette de résistance à l’hygromycine. L’efficacité de la transformation n’est pas affectée par des concentrations d’ADN allant jusqu’à 60 microgrammes.
Cependant, des concentrations plus élevées d’ADN sont préjudiciables à cette procédure. Les données indiquent que cette méthode donne des résultats cohérents sur une large gamme de quantités d’ADN une fois par semestre. Cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée.
À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que l’ARNi transitoire et l’inactivation de gènes peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la fonction des gènes.
Aperçu
Cet article décrit une méthode simple et efficace pour transformer des protoplastes de Physcomitrella patens. La technique est adaptée des protocoles existants de transformation des protoplastes et vise à produire des résultats constamment satisfaisants.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie végétale
- Génie génétique
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les protoplastes sont des cellules végétales dont la paroi cellulaire a été retirée.
- Les techniques de transformation sont essentielles pour l'étude de la fonction des gènes chez les plantes.
- Physcomitrella patens sert d'organisme modèle dans la recherche végétale.
- Les méthodes existantes de transformation des protoplastes peuvent être complexes et longues.
Objectif de l'étude
- Proposer un protocole simplifié pour la transformation de protoplastes de Physcomitrella patens.
- Améliorer l'efficacité et la fiabilité de la transformation des protoplastes.
- Faciliter des études génétiques ultérieures chez les mousses.
Méthodes utilisées
- Digérer le tissu de mousse avec du Drizly pour isoler les protoplastes.
- Laver les protoplastes avec du mannitol pour éliminer les contaminants.
- Transformer les protoplastes isolés avec de l'ADN en utilisant du PEG.
- Incuber les protoplastes transformés sur un milieu sélectif.
Résultats principaux
- Les protoplastes transformés ont exprimé avec succès des protéines fluorescentes.
- La méthode a montré une efficacité de transformation constante à différentes concentrations d'ADN.
- Des concentrations plus élevées d'ADN se sont révélées préjudiciables au succès de la transformation.
- L'ensemble de la procédure peut être réalisé en environ trois heures.
Conclusions
- Cette méthode offre une approche fiable pour la transformation de protoplastes de Physcomitrella patens.
- Elle permet des expériences ultérieures telles que l'ARNi transitoire et les invalidations génétiques.
- Le protocole peut grandement contribuer à la compréhension de la fonction des gènes chez les mousses.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La transformation médiée par PEG de protoplastes de Physcomitrella patens permet une livraison de gènes efficace et reproductible, soutenant la génomique fonctionnelle à haut débit dans les systèmes végétaux. Cette capacité est essentielle pour les équipes de découverte précoce cherchant à explorer la fonction des gènes, valider des cibles et accélérer l'élucidation des voies métaboliques dans un modèle génétiquement manipulable. La possibilité de mettre à l'échelle et de normaliser cette méthode la rend précieuse pour le criblage génétique à l'échelle du portefeuille et pour la réduction des risques mécanistiques.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une interrogation rapide de la fonction des gènes grâce à une livraison efficace d'ADN dans les cellules de mousse.
- Prend en charge le ciblage génique à haute fréquence pour la validation fonctionnelle des cibles et l'analyse des voies biologiques.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en permettant des modifications génétiques précises dans un système modèle.
- Améliore la confiance prédictive pour les hypothèses biologiques ultérieures.
Tests et développement de dosages
- Propose un protocole standardisé pour générer un grand nombre de transformants destinés à des tests de criblage.
- Assure une efficacité de transformation reproductible, soutenant la fiabilité et l'évolutivité des tests.
- Permet la préparation de systèmes biologiques validés pour l'évaluation de composés et le criblage phénotypique.
- Réduit la dépendance à l'égard d'équipements spécialisés, augmentant ainsi l'accessibilité pour les équipes de développement de tests.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet des applications ultérieures telles que les études d'ARNi transitoire et de délétion génique pertinentes pour la modélisation des maladies.
- Assure une continuité allant de la découverte génique à la validation préclinique dans des systèmes à base de plantes.
- Offre une plateforme pour l'exploration translationnelle de biomarqueurs lorsqu'elle est associée à des voies pertinentes pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole de transformation s'inscrit dans la continuité entre la découverte précoce et l'identification de composés candidats, permettant la manipulation génétique, la validation de cibles et le développement de tests dans des modèles végétaux.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification des hypothèses et la clarification des voies grâce à une livraison efficace des gènes et à l'analyse de leur expression.
- Criblage : Favorise la préparation et la reproductibilité des tests en générant des populations de transformants cohérentes.
- Analytique : Fournit des données quantitatives telles que l'efficacité de transformation et l'expression protéique pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Permet des études génétiques qui orientent le développement de modèles précliniques et l'identification de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une capacité de transformation standardisée et largement applicable pour diverses études génétiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études sur la fonction des gènes.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des protocoles de transformation génétique.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/non aller » et l'efficacité du capital en permettant une génération robuste de données précoces.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustées au risque, des cibles et voies génétiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire végétale et en technique stérile pour l'isolement et la transformation de protoplastes.
- Suppose l'accès à une infrastructure de laboratoire de base, incluant la centrifugation et la microscopie à fluorescence pour la validation des résultats.
- Exige une standardisation inter-équipes des paramètres de transformation afin d'assurer la reproductibilité entre les projets.
- Pourrait nécessiter des adaptations afin d'être utilisé chez d'autres espèces végétales ou systèmes modèles autres que Physcomitrella patens.
- L'efficacité de la transformation est sensible à la concentration d'ADN, des quantités plus élevées pouvant être préjudiciables.
