Name: Efficace polyéthylène glycol transformation médiée (PEG) de la mousse Physcomitrella patens /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Découvrez une méthode efficace de transformation de protoplastes de Physcomitrella patens par PEG. Ce protocole simplifié permet d'obtenir des résultats cohérents pour l'expression de protéines fluorescentes en biologie végétale.

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1. Rendre les protoplastes <ol><li> Ajouter 9 ml de 8% de mannitol à une boîte de Pétri. </li><li> Avec une spatule, mis 7 jours vieille mousse 2-3 PPNH4 plaques de 5 - dans la boîte de Pétri contenant du mannitol. </li><li> Ajouter 3 ml de Driselase 2% (Sigma D9515-25G) pour la boîte de Pétri. </li><li> Incuber les boîtes de Pétri à température ambiante avec agitation douce pendant 1 heure. </li><li> Filtrer la suspension de protoplastes à travers une maille 100 um (BD Falcon 352 350). </li><li> Spin filtré la suspension à 250 g pendant 5 minutes. Enlever le surnageant. </li><li> Re-suspendre les protoplastes très doucement avec 500 uL de mannitol 8%. </li><li> Ajouter 9,5 ml de mannitol 8% dans le tube de culture. Assurez-vous que les protoplastes sont entièrement suspendus. </li><li> Répétez la filtration et la remise en suspension des mesures (1.6, 1.7 et 1.8) deux fois plus. </li><li> Prenez 10 ul de la solution de protoplastes et de compter les protoplastes dans un hématimètre. </li><li> Multiplier le nombre de protoplastes dans une zone de 16 carrés par 10 000 pour obtenir le nombre de protoplastes par ml (voir figure 1). </li></ol> 2. Transformation <ol><li> Faites tourner la suspension de protoplastes à 250 g pendant 5 minutes. Enlever le surnageant. </li><li> Re-suspendre protoplastes dans une solution de MMG à la concentration de 1,6 million de protoplastes / mL. </li><li> Incuber la suspension de protoplastes à température ambiante pendant 20 minutes. </li><li> Ajouter 600 uL de suspension de protoplastes dans un tube de culture contenant 60 ug d'ADN. Agiter le tube doucement. </li><li> Ajouter 700 ul de PEG / Ca solution dans le mélange de protoplastes / ADN. Agiter le tube doucement jusqu'à ce mélange est homogène. </li><li> Incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Pendant cette période d'attente, la couverture PRM-B assiettes avec du cellophane (80 mm de diamètre des cercles, AA Packaging Limited, UK); permettent d'hydrater la cellophane sur la surface de la plaque pendant au moins 5 min. </li><li> Avec une spatule, retirer les bulles d'air piégées entre la cellophane et de la plaque. </li><li> Diluer le mélange avec 3 ml de solution de W5. </li><li> Spin le mélange à 250 g pendant 5 minutes. Enlever le surnageant. </li><li> Re-suspendre protoplastes dans fondu 2 mL de PRM-T (avant de l'ajouter aux protoplastes cette solution peut être maintenu liquide à 42 ° C). Planche 1 mL de remettre en suspension protoplastes par PRM-B plaque recouverte par du cellophane. Envelopper les plaques avec Micropore (3M, les soins de santé). Garder les assiettes à 25 ° C dans une chambre de croissance. </li><li> Alternativement, des protoplastes peuvent être remis en suspension dans 1 ml de milieu liquide et placage plaqué de 0,5 mL sur une plaque PRM-B recouverte de cellophane. Ceci permet une régénération plus rapide, mais le nombre de régénération des plantes est plus faible. </li><li> Chambre de croissance est fixé pour un h 16. lumière et 8 heures. cycle de sombre. </li><li> Déplacer le cellophane sur une assiette nouvelle sélection 4 jours après la transformation. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Un exemple de transformation est montré dans la figure 2. L'ADN utilisé dans cet exemple était de 7,8 kb superenroulé plasmide portant une cassette résistante hygromycine. Le montant de protoplastes plaqués a été réduit à 50% pour la photographie. Les photos ont été prise deux semaines après que les plantes ont été déplacés vers les plaques de sélection. L'efficacité de transformation n'est pas affectée par la concentration d'ADN jusqu'à 60 pg. Des concentrations plus élevées de l'ADN sont préjudiciables à l'efficacité de transformation. Les données ont montré que cette méthode offre des résultats cohérents sur une large gamme de quantités d'ADN. Cette méthode peut également générer des transformants stables de manière efficace comme le montre le tableau 1, nous pouvons obtenir environ 4 transformants stables par microgramme d'ADN linéarisé, qui est beaucoup plus élevé que ce qui a été indiqué précédemment 14. Nous avons également testé l'effet du choc thermique sur l'efficacité de transformation en transformant un plasmide superenroulé transportant un gène d'une protéine fluorescente comme un marqueur. Le choc thermique a été effectué 10 minutes après l'incubation température ambiante (dans l'étape 2.6), en incubant le mélange dans un bain d'eau à 45 ° C pendant 3 minutes. Le mélange a été incubé dans un bain d'eau à température ambiante immédiatement après choc thermique pendant 17 min. Les résultats ont été enregistrés 22 heures après la transformation. Les ratios des transformants obtenus avec et sans choc thermique étaient très similaires (~ 25%), mais nous avons observé un effet négatif du choc thermique sur la viabilité des protoplastes (données non présentées). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Vue de protoplastes dans hémocytomètre. La section nécessaire pour le comptage des protoplastes est indiquée par un carré rouge. Notez les 16 carrés nécessaires pour le comptage des protoplastes (voir 1.11), l'image montre un décompte de 24 protoplastes (240 000 cellules / mL). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Photos de 18 jours anciens transformants transitoires. Protoplastes ont été transformé avec le montant indiqué de plasmide superenroulé. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> Montant de l'ADN (pg) </td><td> Efficacité (tranformants / ug d'ADN) </td></tr><tr><td> 15, plasmide superenroulé </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, plasmide superenroulé </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, plasmide superenroulé </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, plasmide superenroulé </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, plasmide linéarisé </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> Efficacité de transformation tableau 1. ADN à des montants différents.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

La méthode présentée ici permet une transformation de l&#39;ADN simple et cohérente dans des protoplastes Physcomitrella patens. Cette méthode a été initialement développé pour une Arabidopsis, mais ici nous avons démontré qu&#39;il se comporte bien avec des protoplastes de Physcomitrella patens, une plante simple et différent. Par conséquent, cette méthode peut être appliquée à d&#39;autres espèces végétales avec des modifications mineures. Modifications possibles pour l&#39;optimisation incluent la concentration de protoplastes MMG, le temps d&#39;incubation dans une solution de MMG et PEG / Ca. Nous avons choisi d&#39;utiliser 60 ug d&#39;ADN dans nos expériences de routine parce que le nombre de transformants augmente linéairement avec la concentration d&#39;ADN jusqu&#39;à ce point (tableau 1). Nous pourrions obtenir environ 7000 transformants transitoires ou 200 transformants stables sur une seule transformation de 60 ug d&#39;ADN, qui permet de dépistage et d&#39;analyse d&#39;une grande population de plantes. Les protoplastes transformés peuvent être réparties en milieu d&#39;étalement de liquide ou PRM-T. Bien que l&#39;efficacité de la régénération est plus faible lorsque milieu d&#39;étalement liquide est utilisé, nous avons choisi cette méthode lorsque les protoplastes ont été transformées avec les plasmides superenroulé. Comme montré dans le tableau 1, les transformations fait avec l&#39;ADN plasmidique superenroulé générer des transformants beaucoup plus et donc, nous pouvons encore obtenir un grand nombre de plantes avec des moyennes plaquage liquide. Par ailleurs, la propagation protoplastes avec milieu d&#39;étalement liquide permet une régénération plus rapide, ce qui est important pour les expériences impliquant des phénotypes transitoires, telles que RNAi renverser expériences 9,15. En plus de l&#39;absence de top agar permet d&#39;isoler des plantes faciles pour immunomarquage et RT-PCR 9,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Ingrédient </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1,84 mM KH 2 PO 4 3,4 mM Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2,72 tartrate de diammonium mM 54 uM FeSO 4 .7 H 2 O 9,93 uM 3 H 3 BO 1,97 uM MnCl2 0,4 H 2 O 0,23 uM 2 .6 H 2 O CoCl 0,19 uM ZnSO 4. 7H 2 O 0,22 uM CuSO 4. 5H 2 O 0,10 uM Na 2 MoO 4 .2 H 2 O 0.168 KI uM Ajouter agar 0,7% pour un milieu solide. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> PPNH 4 avec le mannitol 6% et 0,8% d&#39;agar. Ajouter 10 ml de CaCl 2 1M à 1 L avant de couler les plaques. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> PPNH 4 avec le mannitol 6% et 0,6% d&#39;agar. Ajouter 0,5 ml de CaCl 2 1M à 50 mL avant l&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> Milieu d&#39;étalement liquide </td><td> PPNH 4 avec le mannitol 8,5% sans agar. Ajouter 0,5 ml de CaCl 2 1M à 50 mL avant l&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> Driselase 2% </td><td> Ajouter 4 g de Driselase (Sigma D9515-25G) à 200 ml de mannitol à 8%. Remuer doucement pendant 30 min. à température ambiante, incuber 30 min. à 4 ° C, et remuer doucement pendant 5 min. à température ambiante. Spin 2500 g pendant 10 min, jeter à granulés. Filtre avec 0,22 um, et de stocker gelés aliquotes de 10 ml. Dégel dans un bain d&#39;eau à température ambiante avant utilisation. </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0,4 M mannitol 15 mM MgCl 2 4 mM de MES (pH 5,7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 g PEG4000 3 ml H 2 O 2,5 ml à 0,8 M mannitol 1 ml de CaCl 2 1M </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM de NaCl 125 mM de CaCl2 5 mM de KCl 2 mM de MES (pH 5,7) </td></tr></tbody></table>

efficace polyéthylène glycol transformation médiée (peg) de la mousse physcomitrella patens</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

<p class="jove_content"&gt; Une méthode simple et efficace pour transformer<em&gt; Pantens Physcomitrella</em&gt; Protoplastes est décrite. Cette méthode est adaptée à partir des protocoles de<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplastes et<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Transformation de protoplastes de mésophylle<sup&gt; 1</sup&gt;. Grâce à sa capacité à subir mitotique efficaces recombinaison homologue<em&gt;, Physcomitrella patens</em&gt; A émergé comme un système modèle important ces dernières années<sup&gt; 2</sup&gt;. Cette capacité permet à des fréquences élevées de ciblage génique<sup&gt; 3-9</sup&gt;, Qui ne se voit pas dans les plantes telles que le modèle d&#39;autres<em&gt; Arabidopsis</em&gt;. Pour profiter pleinement de ce système, nous avons besoin d&#39;une méthode efficace et facile à transporter l&#39;ADN dans les cellules de la mousse. Les façons les plus courantes pour transformer cette mousse sont bombardement de particules<sup&gt; 10</sup&gt; Et le PEG-médiée ADN absorption<sup&gt; 11</sup&gt;. Bien que le bombardement de particules peut produire un rendement de transformation de haute<sup&gt; 12</sup&gt;, Canons à gènes ne sont pas facilement disponibles pour de nombreux laboratoires et le protocole est difficile à standardiser. D&#39;autre part, le PEG transformation médiée ne nécessite pas d&#39;équipements spécialisés, et peut être réalisée dans tout laboratoire avec une hotte stérile. Ici, nous montrons une méthode simple et très efficace pour la transformation de protoplastes de mousse. Cette méthode peut générer plus de 120 transformants transitoires par microgramme d&#39;ADN, qui est une amélioration par rapport au protocole le plus efficace indiqué précédemment<sup&gt; 13</sup&gt;. En raison de sa simplicité, l&#39;efficacité et la reproductibilité, cette méthode peut être appliquée à des projets nécessitant grand nombre de transformants ainsi que pour la transformation de la routine.</p

Une méthode simple et efficace pour transformer<em&gt; Pantens Physcomitrella</em&gt; Protoplastes est décrite. Cette méthode est adaptée à partir des protocoles de<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplastes et<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Transformation de protoplastes de mésophylle<sup&gt; 1</sup&gt;.

Efficace polyéthylène glycol transformation médiée (PEG) de la mousse Physcomitrella patens</em

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L'objectif général de cette procédure est de transformer des protoplastes de SCO Metre. Cela est réalisé en digérant d'abord les plantes avec du Drizly. Ensuite, les protoplastes sont lavés avec du mannitol pour éliminer le Drizly, puis incubés avec de l'ADN et du PEG.Enfin, les protoplastes transformés sont étalés sur des boîtes de Petri et incubés. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant les protoplastes transformés exprimant des protéines marquées par fluorescence grâce à la microscopie en fluorescence. La démonstration de la procédure sera effectuée par Y. Lu, postdoctorant de mon laboratoire.L'avantage principal de cette technique est qu'elle est efficace et produit de manière constante des protoplastes exprimant la protéine d'intérêt. Pour isoler les protoplastes de mousse, commencez par ajouter neuf millilitres de mannitol à 8 % dans une boîte de Pétri à l'aide d'une spatule. Placez la mousse âgée de cinq à sept jours provenant de deux à trois plaques PP NH4 dans le mannitol. Veuillez consulter le protocole écrit accompagnant pour celui-ci ainsi que pour les recettes de réactifs supplémentaires. Ensuite, ajoutez trois millilitres de Drizly à 2 % et incubez à température ambiante sous agitation douce pendant une heure.Filtrez le mélange à travers une maille de 100 microns pour obtenir une suspension homogène verte. Ensuite, centrifugez le filtrat à 250 G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant très délicatement.Ressuspendez les protoplastes dans 500 microlitres de mannitol à 8 %. Ajoutez ensuite 9,5 millilitres supplémentaires de mannitol à 8 %. Assurez-vous que les protoplastes sont complètement ressuspendus.Répétez les étapes de lavage deux fois supplémentaires en centrifugeant à nouveau la solution à 250 G pendant cinq minutes. Éliminez le surnageant et resuspendez les protoplastes, d'abord dans 500 microlitres.Ensuite, 9,5 millilitres de mannitol à 8 % à l’aide d’un cytomètre hématologique. Comptez le nombre de protoplastes dans 10 microlitres de la suspension afin de transformer l’ADN dans les protoplastes isolés. Tout d’abord, centrifugez le mélange de protoplastes à 250 ×g pendant cinq minutes.Éliminer le surnageant et resuspendre les protoplastes à 1,6 million par millilitre dans la solution MMG. Incuber la suspension à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, ajouter 600 microlitres de la solution de protoplastes dans un tube de culture contenant 60 microgrammes d'ADN. Agiter.Ajouter délicatement 700 microlitres de solution de PEG au calcium et agiter. Incuber correctement l'échantillon à température ambiante pendant 30 minutes durant cette période d'attente. Recouvrir les plaques PRMB de cellophane.Ensuite, diluez la suspension avec trois millilitres de solution W5 et centrifugez à 250 ×g pendant cinq minutes. Pour éliminer le PEG, resuspendez les protoplastes dans deux millilitres de PRMT et plaquez un millilitre par plaque PRMB recouverte de cellophane. Incubez les plaques à 25 degrés Celsius dans une chambre de croissance.Enfin, quatre jours après la transformation, transférez la cellophane sur des nouvelles plaques de sélection. Cette figure montre un exemple de plantes âgées de 18 jours régénérées à partir de protoplastes transformés avec 15 microgrammes d'ADN plasmidique superenroulé, portant une cassette de résistance à l'hygromycine. Ici, 30 microgrammes du même ADN plasmidique superenroulé ont été transformés dans les protoplastes.Soixante microgrammes d'ADN de type plaid ont été transformés dans cet échantillon. Et enfin, ces plantes ont été régénérées à partir de protoplastes ayant été transformés avec 120 microgrammes du même ADN plasmidique en forme de superhélice portant la cassette de résistance à l'hygromycine. L'efficacité de la transformation n'est pas affectée par des concentrations d'ADN allant jusqu'à 60 microgrammes.Cependant, des concentrations plus élevées d'ADN sont préjudiciables à cette procédure. Les données indiquent que cette méthode fournit des résultats reproductibles sur une large gamme de quantités d'ADN Une fois le semestre. Cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement.Après cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que l'ARNi transitoire et les invalidations génétiques peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions concernant la fonction des gènes.

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