NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Le système de rétention d'échantillons NanoDrop est une technologie innovante qui utilise la tension superficielle intrinsèque des liquides pour maintenir et mesurer des échantillons de volume microscopique entre deux supports optiques, sans recourir à des QTS ni à des capillaires. Aussi peu qu'un microlitre d'échantillon est pipeté directement sur la surface optique inférieure. Lors de la fermeture du bras du spectromètre, une colonne de liquide se forme entre les supports optiques supérieur et inférieur.

Grâce à la tension superficielle formant un trajet optique vertical, la longueur du trajet peut automatiquement changer en temps réel pendant la mesure. Le raccourcissement du trajet permet la mesure de concentrations plus élevées, éliminant ainsi efficacement la nécessité de réaliser des dilutions pour la plupart des échantillons d'acides nucléiques. De plus, le système de rétention de l'échantillon accélère le processus expérimental grâce à un nettoyage rapide, qui consiste simplement à essuyer les surfaces optiques avec un chiffon de laboratoire.

Aujourd'hui, nous allons démontrer deux procédures permettant de déterminer la concentration en acides nucléiques à l'aide d'un instrument thermoscientifique à volume micro. Le premier protocole consiste en une mesure directe des acides nucléiques à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop 2000 C. Le second protocole est une mesure indirecte par fluorescence des acides nucléiques à l'aide du fluorospectromètre NanoDrop 3,300.

Pour commencer, nettoyez les surfaces optiques supérieure et inférieure du système de rétention d'échantillon du spectrophotomètre à volume micro en pipetant deux à trois microlitres d'eau déionisée propre sur la surface optique inférieure. Abaissez le bras articulé afin que le plot supérieur entre en contact avec l'eau déionisée. Relevez le bras articulé et essuyez soigneusement les deux surfaces optiques à l’aide d’un chiffon de laboratoire propre, sec et sans particules.

Ensuite, ouvrez le logiciel NanoDrop et sélectionnez l'application acide nucléique. Utilisez une pipette calibrée de petit volume pour effectuer une mesure de blanc en déposant un microlitre de tampon sur la surface optique inférieure. Abaissez le bras articulé et sélectionnez « blanc » dans l'application acide nucléique.

Une fois la mesure du blanc terminée, nettoyez les deux surfaces optiques avec un essuie-laboratoire. Comme précédemment, sélectionnez la constante appropriée pour l'échantillon à mesurer. Ensuite, déposez un microlitre d'échantillon d'acide nucléique sur le socle optique inférieur et abaissez le bras de levier.

Étant donné que la mesure est indépendante du volume, l'échantillon doit simplement former un pont entre les deux surfaces optiques. Pour effectuer une mesure, sélectionnez « mesurer » dans le logiciel de l'application ; le logiciel calculera automatiquement la concentration en acides nucléiques et les rapports de pureté. Après la mesure de l'échantillon, examinez le spectre obtenu. Un échantillon typique d'acide nucléique présente un profil très caractéristique.

Les indicateurs spectraux d'un échantillon de mauvaise qualité incluent des pics à la baisse et au niveau du pic à 260 nanomètres. Les sources courantes de contaminants associées à des techniques spécifiques d'isolement des acides nucléiques comprennent le phénol, le triol et l'extraction sur colonne. Dans le cas de l'extraction au phénol-triol, une contamination résiduelle par les réactifs peut se manifester par des spectres anormaux entre 220 et 240 nanomètres, ainsi que par des décalages dans la région allant de 260 à 280 nanomètres.

En revanche, les résidus de guanine provenant de l'extraction par colonne peuvent contribuer à un pic proche de 230 nanomètres et à un décalage du creux de 230 nanomètres vers environ 240 nanomètres. Pour évaluer précisément la pureté de l'échantillon, le rapport 260/280 et le rapport 260/230 doivent être analysés conjointement avec la qualité spectrale globale. Les acides nucléiques purs donnent généralement un rapport 260/280 d'environ 1,8 pour l'ADN et d'environ 2,0 pour l'ARN.

Ce rapport dépend du pH et de la force ionique du tampon utilisé pour effectuer les mesures du blanc et de l'échantillon. Le spectrophotofluorimètre Banana drop 3, 300 utilise le même système breveté de rétention d'échantillon en microvolume que le spectrophotomètre NanoDrop 2000 C. Les mesures de fluorescence étant réalisées avec aussi peu qu'un microlitre d'échantillon, l'utilisateur choisit l'une des trois DEL comme source d'excitation, qui émet horizontalement vers l'échantillon.

La fluorescence de l'échantillon ultérieure est ensuite collectée à un angle de 90 degrés verticalement dans un spectromètre interne. Pour démontrer la quantification de nucléotides en microvolume avec une haute sensibilité à l'aide du NanoDrop 3300, un kit de fluorescence Pico Green est utilisé pour commencer à équilibrer les étalons du kit ainsi que tous les échantillons d'acides nucléiques à température ambiante. Les échantillons fluorescents sont sensibles à la lumière et doivent être conservés dans des tubes en verre ambré ou enveloppés d'aluminium.

Préparez suffisamment de tampon 1X TE pour toutes les normes et échantillons à mesurer, ainsi que pour la solution de travail au pico vert nécessaire. Préparez le tampon 1X TE en diluant le tampon 20X TE fourni avec de l'eau sans noyau selon le protocole du fabricant. Les volumes de réaction peuvent varier de 200 microlitres à seulement 10 microlitres.

Dans cet exemple, nous préparerons des volumes de réaction de 10 microlitres. Ensuite, préparez des étalons d'ADN double brin dilués en série ainsi que des vials ou des tubes sans nuclease. Cela couvrira la plage de concentration attendue des échantillons d'ADN inconnus.

Transférez cinq microlitres de chacun des étalons d'ADN double brin dilués dans un tube individuellement étiqueté, sans nucléase et protégé de la lumière (tube ambré ou recouvert de papier d'aluminium). Ensuite, aliquotez cinq microlitres de chaque échantillon d'ADN double brin d'intérêt dans le tube correspondant protégé de la lumière. Après avoir préparé la solution de travail Pico Green selon le protocole du fabricant, ajoutez un volume équivalent de cette solution à chaque tube contenant soit un étalon d'ADN double brin, soit un échantillon d'ADN double brin, soit dans ce cas cinq microlitres.

Combinez des volumes égaux d'un tampon XTE et de la solution de travail Pico Green. Pour préparer le témoin négatif qui sert de solution de référence, mélangez soigneusement le contenu de chaque tube par pipetage doux et laissez incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

Toutes les normes et échantillons doivent être équilibrés à la même température avant la mesure, car le signal fluorescent est influencé par la température. Pour préparer l'appareil et effectuer les mesures, nettoyez d'abord les surfaces inférieure et supérieure du système de rétention de l'échantillon, puis pipetez deux à trois microlitres d'eau déionisée sur la surface optique inférieure. Ensuite, ouvrez le bras de levier et essuyez les plateaux supérieur et inférieur avec un chiffon de laboratoire propre et sans peluches.

Veillez à ce que les surfaces soient exemptes de peluches avant de poursuivre. En effet, les peluches peuvent présenter une fluorescence en présence d'une source d'excitation et peuvent interférer avec la mesure. Ouvrez le logiciel de l'appareil.

Sélectionnez l'application acides nucléiques et choisissez l'option ADN double brin pico vert. Pipetez deux microlitres de XTE 1X sur le socle inférieur. Fermez le bras de levier et sélectionnez « blanc » dans le champ logiciel de l'instrument. Une fois le blanc terminé, essuyez la solution de blanc sur les deux faces du système de rétention d'échantillon.

Ensuite, mélangez la solution de référence en pipetant doucement à l’aide de pointes à faible rétention. Pipetez deux microlitres de la solution de référence sur le socle inférieur et fermez le bras de levier. Sélectionnez « référence » sous l’onglet étalons et choisissez les unités souhaitées.

Cliquez sur mesurer pour lancer le cycle de mesure. Une fois le cycle de mesure terminé, ouvrez le bras de levier et essuyez soigneusement les surfaces du système de rétention de l'échantillon. Effectuez jusqu'à cinq réplicats du témoin en utilisant un Eloqua neuf pour chaque réplicat.

Répétez le processus pour les étalons supplémentaires afin d'élaborer une courbe d'étalonnage. Jusqu'à sept étalons peuvent être utilisés. Le logiciel est conçu pour stocker jusqu'à cinq réplicats pour chaque étalon.

Les réplicats des étalons sont moyennés pour générer une courbe standard à partir de laquelle les concentrations des échantillons sont déterminées automatiquement. Une fois la courbe standard terminée, sélectionnez l'onglet échantillons, saisissez les informations d'identification des échantillons respectifs et mesurez chaque échantillon inconnu. Une courbe valide indique que le nombre minimal d'étalons requis a été atteint.

La concentration d'ADN est automatiquement déterminée à partir de la courbe standard. Les instruments à microvolume NanoDrop peuvent déterminer la concentration en acides nucléiques soit par des mesures directes d'absorbance à 260 nm, soit par des méthodes fluorométriques indirectes. Les spectrophotomètres NanoDrop peuvent également être utilisés pour quantifier les protéines en mesurant l'absorbance directe à 280 nm ou par des dosages colorimétriques des protéines.