Test clonogénique: cellules adhérentes

Bonjour, je m'appelle Lum et je prépare actuellement mon doctorat au BE IDI Heart and Diabetes Institute sous la supervision du Dr. Tom Carianne, responsable du laboratoire de Médecine Épigénomique. Dans cette vidéo, je vais démontrer la procédure appelée test de survie clonogénique. Il s'agit d'une technique âgée de 50 ans, qui permet d'évaluer l'impact de différents traitements, tels que l'exposition aux rayonnements ou à des agents chimiques, sur la viabilité reproductive cellulaire.

Le test de survie congénique est une technique fondamentale en biologie de la radiation pour évaluer la sensibilité à la radiation de différentes lignées cellulaires et tester l'efficacité de divers composés radio-protecteurs ou radio-sensibilisateurs. Lorsqu'on utilise une lignée cellulaire adhérente, le test de survie cryogénique comprend trois phases. Premièrement, le traitement d'une monocouche de cellules adhérentes.

Deuxièmement, la préparation d'une suspension de cellules uniques et la mise en place d'un nombre connu de cellules dans des boîtes traitées, et troisièmement, la coloration, le décompte et les colonies formées après une période d'incubation. Dans cette vidéo, j'utiliserai des cellules humaines immortalisées de type cino pour démontrer comment le test polygénique Bible peut être utilisé afin de déterminer les propriétés radio-protectrices de l'antioxydant naturel. Des flacons de 1225 M contenant des cellules sont ensemencés dans cinq millilitres de milieu à l'avance, de sorte que le jour de l'expérience, il y ait 1 million de cellules par flacon.

50 microlitres du médicament sont ajoutés à différentes concentrations aux cinq millilitres de milieu dans chaque flacon correctement étiqueté afin d'obtenir la concentration requise ; cinq concentrations sont utilisées, ainsi qu'un témoin véhicule dans ce cas, le PBS. Après l'ajout du médicament, les cellules sont incubées pendant une heure dans les conditions appropriées pour la lignée cellulaire utilisée. Après incubation, les échantillons, à l'exception du groupe témoin, sont irradiés à la dose choisie, qui est dans ce cas de quatre gray produits par une source de césium émettant des rayons gamma.

Après irradiation, les milieux sont versés et chaque flacon est lavé avec deux millilitres de PBS pendant cinq minutes. Après avoir vidé le PBS, deux millilitres de trypsine à 0,05 % sont ajoutés à chaque flacon pour détacher les cellules adhérentes A du flacon. Cinq millilitres inférieurs de DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal sont ensuite ajoutés à chaque flacon afin d'inactiver la trypsine.

Le contenu total du fasc est ensuite transféré dans des tubes coniques de 10 millilitres étiquetés. Une fois cette étape terminée, ces tubes sont centrifugés pendant cinq minutes, après quoi le surnageant est soigneusement éliminé sans perturber le culot, et cinq millilitres de milieu crecy sont ajoutés à chaque tube. La concentration de cellules pour chaque échantillon est calculée, ainsi que le volume nécessaire de chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de cellules à ensemencer dans cinq boîtes de Pétri par échantillon, avec cinq millilitres de milieu chacune.

Par exemple, pour le groupe témoin, 100 cellules sont ensemencées par boîte, donc le volume nécessaire pour obtenir 500 cellules par 25 millilitres est calculé ; pour les échantillons plus concentrés, effectuez une dilution 10 fois ou une dilution sérielle 100 fois afin de minimiser l'erreur associée à l'utilisation de volumes inférieurs à 100 microlitres. Le volume précédemment calculé est maintenant préparé dans un tube Falcon contenant 25 millilitres de milieu pour chaque échantillon. Les échantillons peuvent ensuite être transférés dans des boîtes préalablement étiquetées, en ajoutant cinq millilitres par boîte pour faciliter la manipulation et le transport.

Conserver les boîtes dans un récipient grand, stérile ou désinfecté. Placer ensuite les boîtes dans un incubateur humidifié, dans les conditions appropriées, et incuber pendant huit jours. Si l'on utilise des kératinocytes après huit jours, retirer soigneusement les boîtes de l'incubateur et les disposer une par une à l'intérieur d'une hotte aspirante.

Manipulez délicatement la boîte afin de ne pas perturber les colonies éventuellement formées. Retirez les couvercles et ajoutez cinq ml de solution saline à 0,9 % dans chaque boîte pour les rincer. Dirigez la pointe de la pipette vers l'angle de la boîte et évitez de toucher le fond afin de ne pas rayer accidentellement les colonies.

Après cinq minutes, aspirez soigneusement la solution saline. Fixez maintenant les colonies avec trois millilitres de 4%formula, et remplacez les couvercles afin d'éviter l'évaporation. Après 15 minutes à une demi-heure, aspirez et éliminez correctement le formula.

Les colonies sont désormais prêtes à être colorées avec du violet de crésyl à 0,1 % ; cinq millilitres sont ajoutés à chaque boîte, puis les couvercles sont remis en place après une demi-heure à une heure. Le colorant est ensuite éliminé par rinçage à l’eau distillée, et les boîtes sont retournées et laissées sécher toute la nuit. Les colonies sont maintenant prêtes à être comptées.

Les colonies peuvent être comptées manuellement à l'aide d'un microscope stéréoscopique. Tout groupement de cellules contenant 50 cellules ou plus est considéré comme une colonie. Et voilà qui conclut notre démonstration du test de survie congénique.

Le principal avantage de ce test par rapport à d'autres techniques est qu'il est extrêmement sensible et peut détecter la survie sur une vaste gamme, même après une réduction de six logarithmes du nombre de cellules. Cette sensibilité est obtenue en ensemencant un plus grand nombre de cellules. Ce test peut facilement être utilisé à d'autres fins, telles que l'évaluation de la cytotoxicité.

Merci d'avoir regardé.