Name: Test clonogénique: cellules adhérentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Apprenez le test clonogénique pour évaluer la viabilité reproductive cellulaire après traitement par rayonnement ou agents chimiques sur cellules adhérentes. Cette technique essentielle en biologie de la radiation permet de tester la sensibilité des lignées cellulaires.

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Le soutien de l&#39;Institut australien des sciences et génie nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix Ainse. Médecine de laboratoire épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council of Australia (566559). HR est pris en charge par un Australien d&#39;études supérieures et des prix BakerIDI étincelles lumineuses. Ce travail est financé par le CRC d&#39;Imagerie Biomédicale Development Ltd (CRC-BID), mis en place et soutenus dans le cadre de la recherche du gouvernement australien centres du programme de coopération. Le CO est le destinataire d&#39;un australien d&#39;études supérieures prix et une bourse supplémentaire CRC-BID.

1. Culture cellulaire et expérimental <ol><li> Kératinocytes humains sont maintenues sous forme de monocouches dans 75 cm 2 flacons de culture tissulaire contenant 15 ml de kératinocytes-SFM (K-SFM) (GIBCO, un milieu sans sérum) additionné de L-glutamine (2 mM), facteur de croissance épidermique (5 ng / mL), extrait pituitaire bovin (40 pg / ml) et 20 mg / mL de gentamicine. Les cellules sont cultivées dans une atmosphère humidifiée 2 5% l&#39;environnement à 37 ° C. </li><li> Les cellules sont ensemencées en 12 x 25 cm 2 flacons de culture tissulaire contenant 5 ml de milieu K-SFM. </li></ol> Suspensions monocellulaires sont préparés par traitement à la trypsine. Les cellules sont lavées avec du PBS et incubées avec un 0,05% de trypsine / EDTA solution pendant 5-10 minutes. Lorsque les cellules commencent à s&#39;arrondir et ~ 30% sont détachés, 3 volumes de Eagle modifié par Dulbecco milieu contenant 10% de sérum fœtal bovin est ajouté pour neutraliser la trypsine. Les cellules sont détachées par aspirationet vers le bas (20 fois). Les cellules sont comptées à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. Le nombre de cellules appropriées sont ensemencées en fonction du temps de doublement de la ligne de cellules (environ 20 heures pour l&#39;homme FEP-1811 kératinocytes). L&#39;objectif est de parvenir à une confluence de 90% (~ 10 6 cellules par flacon) le jour de l&#39;expérience. Une expérience composé de 12 flacons est optimal pour un seul essai clonogénique (six témoins non irradiés et irradiés six flacons), qui peut être complété en environ quatre heures. 2. Traitement et irradiation <ol><li> Traiter les cellules pendant un temps approprié avec un rayonnement pertinentes composé modifiant et exposer les cellules aux rayonnements ionisants soit γ-irradiation ou rayons-X. </li></ol> Typiquement six flacons servir efficacité d&#39;étalement (non traité) et les commandes de médicaments seulement. Les six autres flacons sont irradiées. Dans cet exemple, les kératinocytes humains sonttraitées avec différentes concentrations de Cinnulin PF (PCF; nutraceutiques intégrité internationales, Spring Hill, Tennessee, États-Unis, des données représentatives de 20 pg / mL est indiqué ci-dessous), une formulation soluble dans l&#39;eau antioxydant naturel, pendant 1 heure à 37 ° C. Les cellules sont irradiées avec 4 Gy en utilisant une source de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiateur Elite; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min). 3. Placage <ol><li> Après le traitement, les suspensions cellulaires simples sont obtenus comme décrit précédemment. </li><li> Le nombre de cellules dans chaque échantillon sont comptés soigneusement à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et dilué de sorte que le nombre de cellules appropriées sont ensemencées dans des boîtes de Pétri (cinq répétitions de chaque en 15 plats mm). L&#39;efficacité d&#39;étalement et / ou fraction survivante devrait être prévu au moment de décider du nombre de cellules de graines par plaque. L&#39;objectif est de parvenir à une fourchette comprise entre 20 à 150 colonies. </li></ol> Des boîtes de Pétri sont disposés dans un p humidifiéboîte de clonage lastic et incubées dans un environnement de CO 2 5% à 37 ° C pour la formation de colonies. Le temps d&#39;incubation pour la formation de colonies varie de 1-3 semaines pour les lignées cellulaires différentes, il est admis que le temps doit être équivalente à au moins six divisions cellulaires. Dans cet exemple, les plats de contrôle des kératinocytes humains besoin de huit jours pour former des clones suffisamment nombreuse composée de 50 cellules ou plus. 4. Fixation et coloration des colonies Effectuez les étapes suivantes dans une hotte. <ol><li> Retirer doucement le support de chacune des plaques par aspiration. </li><li> Laver chaque plaque avec 5 mL de solution saline à 0,9%. </li><li> Fixer les colonies avec 5 ml solution à 10% formol neutre tamponné pendant 15-30 minutes. </li><li> Coloration à 5 ml 0,01% (p / v) de cristal violet à dH 2 O pendant 30-60 minutes. </li><li> Laver cristal violet excès avec dH 2 O et permettre plats à sécher. </li></ol>5. Le comptage de colonies Stéréomicroscope <ol><li> Des colonies contenant plus de 50 cellules individuelles sont comptées à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope. </li></ol> D&#39;imagerie numérique et de comptage en utilisant un logiciel d&#39;imagerie <ol><li> Les images numériques des colonies sont obtenues à l&#39;aide d&#39;un appareil photo ou le périphérique de numérisation </li><li> Les colonies sont comptées à l&#39;aide d&#39;imagerie paquets logiciels d&#39;analyse comme décrit ci-dessous. </li></ol> Le comptage cellulaire en utilisant ImageJ (Fidji Version 1.44a) <ol><li> Ouvrez le fichier image à Fidji, allez dans Fichier -&gt; Ouvrir. </li><li> Si nécessaire convertir l&#39;image en format 8 bits, allez dans Image -&gt; Réglages ... -&gt; Seuil. </li><li> Ajuster le seuil de réduire les niveaux de fond non spécifique de sorte que seules les colonies sont détectées. </li><li> Compter les colonies en utilisant le suivant: aller au Processus -&gt; Binaire -&gt; Trouver maxima. </li></ol> Pour ce format d&#39;image, la tolérance au bruit peut être réglé sur 0. Assurez-vous que l&#39;option est cochée fond clair etun aperçu de la détection des maxima de vérifier que toutes les colonies de cellules ont été correctement enregistré.

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+x-rays+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Action of x-rays on mammalian cells.</a> J Exp Med. 103, 653-666 (1956).</li>
<li>Hurlin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).</li>
</ol>

Dans cet exemple, l'homme FEP-1811 kératinocytes ont été traitées avec différentes concentrations allant jusqu'à 100 mg / mL PCF; données sont présentées pour 20 pg / ml PCF pendant 1 heure à 37 ° C. Cellules de traitement suivants ont été irradiés avec 4 Gy en utilisant une source de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiateur Elite; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min). Pour le contrôle non traités et de drogues traitements à seulement 100 cellules ont été étalées dans chaque boîte de Pétri et 1000 cellu...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Kératinocytes milieu sans sérum </td><td> Le milieu de croissance </td><td> Invitrogen </td><td> 17005042 </td><td> Supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, la gentamicine 20μg/ml, du facteur de croissance épidermique, extrait d&#39;hypophyse bovine. </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td> 0,05% de trypsine / EDTA pour détacher les cellules adhérentes; 10 en stock x dilué dans du PBS w / o Ca 2 + / Mg 2 +. </td></tr><tr><td> Dulbecco milieu modifié essentiel </td><td> Le milieu de croissance </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-084 </td><td> Supplémenté avec 10% de FBS et 20μg/mlgentamicine; utilisé pour neutraliser la trypsine / EDTA. </td></tr><tr><td> Saline 0,09% </td><td> Solution </td><td></td><td></td><td> Utilisé pour laver les colonies. </td></tr><tr><td> 10% Neutre solution de formaline tamponnée </td><td> Solution </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td> ~ Formaldéhyde à 4%; utilisé pour fixer les colonies. </td></tr><tr><td> Cristal violet </td><td> Poudre </td><td> SPI-Chem </td><td> 02577-MB </td><td> 0,01% solution de cristal violet, établi en dH 2 O, utilisé pour colorer les colonies. </td></tr><tr><td> Gammacell 1000 irradiateur élite </td><td></td><td> Nordion International Inc </td><td></td><td></td><tr><td> Des boîtes de Pétri </td><td> 60 x 15 mm </td><td> Faucon </td><td> 353002 </td><td></td><tr><td> Hémocytomètre </td><td></td><td> Hawksley; médical et de laboratoire </td><td> AC1000 </td><td></td><tr><td> Boîte de clonage </td><td></td><td></td><td></td><td> Boîte en plastique avec des trous de poing au côté opposés de couvercle; pour stocker des boîtes de Pétri pendant l&#39;incubation prolongée pour la formation de colonies. </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope </td><td> Type 102 </td><td> Nikon </td><td></td><td> Utilisé pour compter les colonies composées de 50 cellules&gt;. </td></tr></tbody></table></div>

test clonogénique: cellules adhérentes

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Le clonogénique (ou formant colonie) test a été mis en place depuis plus de 50 ans, le document original décrivant la technique a été publié en 1956 1. En dehors de la documentation du procédé, l&#39;étude de référence initiale générée de la première courbe de réponse en rayonnement dose de rayons X irradiés mammifères (HeLa) des cellules en culture 1. Fondamentalement, le test clonogénique permet d&#39;évaluer les différences de viabilité de reproduction (capacité des cellules à produire une descendance; c&#39;est à dire une seule cellule pour former une colonie de 50 cellules ou plus) entre les cellules témoins non traitées et les cellules qui ont subi divers traitements tels que l&#39;exposition aux rayonnements ionisants, divers composés chimiques (par exemple des agents cytotoxiques) ou dans d&#39;autres cas de manipulation génétique. Le dosage est devenue la technique la plus largement acceptée en radiobiologie et a été largement utilisé pour évaluer la sensibilité aux rayonnements de différentes lignées cellulaires. En outre, le test clonogénique est couramment utilisé pour monitoring l&#39;efficacité des composés rayonnement modification et pour déterminer les effets des agents cytotoxiques et d&#39;autres thérapies anti-cancéreuses sur la capacité de formation de colonies, dans différentes lignées cellulaires. Une expérience de survie clonogénique typique utilisant des lignées de cellules adhérentes comporte trois composantes distinctes, 1) le traitement de la monocouche de cellules dans des flacons de culture tissulaire, 2) préparation des suspensions cellulaires simples et placage d&#39;un nombre approprié de cellules dans des boîtes de Pétri et 3) fixation et coloration des colonies après une période d&#39;incubation approprié, qui peut varier de 1-3 semaines, en fonction de la lignée cellulaire. Ici nous montrent le mode opératoire général pour la réalisation du test clonogénique avec des lignées de cellules adhérentes à l&#39;aide d&#39;une ligne cellulaire de kératinocytes humains immortalisés (FEP-1811) 2. En outre, nos objectifs sont de décrire les caractéristiques communes des essais clonogéniques y compris le calcul de l&#39;efficacité d&#39;étalement et des fractions de survie après exposition des cellules aux radiations, et d&#39;illustrer la modification desrayonnement de réponse à l&#39;utilisation d&#39;une formulation anti-oxydant naturel.

L&#39;applicabilité du test clonogénique pour évaluer la viabilité de la reproduction a été mis en place depuis plus de 50 ans. Ici, nous démontrons la procédure générale pour réaliser le dosage clonogénique de cellules adhérentes.

Test clonogénique: cellules adhérentes

L'essai clonogénique (ou de formation de colonies) est établi depuis plus de 50 ans ; l'article original décrivant la technique a été publié en 19561. ...

Bonjour, je m'appelle Lum et je prépare actuellement mon doctorat au BE IDI Heart and Diabetes Institute sous la supervision du Dr Tom Carianne, responsable du laboratoire de Médecine Épigénomique. Dans cette vidéo, je vais démontrer la procédure appelée test de survie clonogénique. Il s'agit d'une technique âgée de 50 ans, qui permet d'évaluer l'impact de différents traitements, tels que l'exposition aux rayonnements ou à des agents chimiques, sur la viabilité reproductive cellulaire.Le test d'aptitude vitale congénique est une technique fondamentale en biologie de la radiation pour évaluer la sensibilité à la radiation de différentes lignées cellulaires et tester l'efficacité de divers composés radio-protecteurs ou radio-sensibilisateurs. Lorsqu'on utilise une lignée cellulaire adhérente, le test d'aptitude vitale cryogénique comprend trois phases. Premièrement, le traitement d'une monocouche de cellules adhérentes.Deuxièmement, la préparation d'une suspension de cellules individuelles et la mise en place d'un nombre défini de cellules dans des boîtes traitées, et troisièmement, la coloration, le décompte et les colonies formées après une période d'incubation. Dans cette vidéo, j'utiliserai des cellules humaines immortalisées de lignée cino site pour démontrer comment le test polygénique Bible peut être utilisé afin de déterminer les propriétés radio-protectrices de l'antioxydant naturel. Des flacons de 1225 M contenant des cellules sont ensemencés dans cinq mils de milieu à l'avance, de sorte que le jour de l'expérience, il y ait 1 million de cellules par flacon.50 microlitres du médicament sont ajoutés à différentes concentrations aux cinq millilitres de milieu dans chaque flacon correctement étiqueté afin d'obtenir la concentration requise ; cinq concentrations sont utilisées, ainsi qu'un témoin véhicule dans ce cas, le PBS. Après l'ajout du médicament, les cellules sont incubées pendant une heure dans les conditions appropriées pour la lignée cellulaire utilisée. Après incubation, les échantillons, à l'exception du groupe témoin, sont irradiés à la dose choisie, qui est dans ce cas de quatre gray produits par une source de césium émettant des rayons gamma.Après irradiation, les milieux sont versés et chaque flacon est lavé avec deux millilitres de PBS pendant cinq minutes. Après avoir vidé le PBS, deux millilitres de trypsine à 0,05 % sont ajoutés à chaque flacon pour détacher les cellules adhérentes A du flacon. Cinq millilitres de DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal sont ensuite ajoutés au fond de chaque flacon afin d'inactiver la trypsine.Le contenu total du fasc est ensuite transféré dans des tubes coniques de 10 millilitres étiquetés. Une fois cette étape terminée, les tubes sont centrifugés pendant cinq minutes, après quoi le surnageant est éliminé soigneusement sans perturber le culot, et cinq millilitres de milieu crecsy sont ajoutés à chaque tube. La concentration de cellules pour chaque échantillon est calculée de manière ENC, ainsi que le volume nécessaire de chaque échantillon pour atteindre la concentration finale de cellules à ensemencer dans cinq boîtes de Pétri par échantillon, avec cinq millilitres de milieu chacune.Par exemple, pour le groupe témoin, 100 cellules sont ensemencées par boîte, donc le volume nécessaire pour obtenir 500 cellules par 25 millilitres est calculé ; pour les échantillons plus concentrés, effectuez une dilution 10 fois ou une dilution sérielle 100 fois afin de minimiser l'erreur associée à l'utilisation de volumes inférieurs à 100 microlitres. Le volume précédemment calculé est maintenant préparé dans un tube Falcon contenant 25 millilitres de milieu pour chaque échantillon. Les échantillons peuvent ensuite être transférés dans des boîtes préalablement étiquetées, en ajoutant cinq millilitres par boîte pour faciliter la manipulation et le transport.Conserver les boîtes dans un récipient grand, stérile ou désinfecté. Placer ensuite les boîtes dans un incubateur humidifié, dans les conditions appropriées, et incuber pendant huit jours. Si l'on utilise des kératinocytes après huit jours, retirer soigneusement les boîtes de l'incubateur et les disposer une par une à l'intérieur d'une hotte. Manipulez délicatement la boîte afin de ne pas perturber les colonies éventuellement formées. Retirez les couvercles et ajoutez cinq ml de solution saline à 0,9 % dans chaque boîte pour les rincer. Dirigez la pointe de la pipette vers l'angle de la boîte et évitez de toucher le fond afin de ne pas détacher accidentellement les colonies.Après cinq minutes, aspirez soigneusement la solution saline. Fixez maintenant les colonies avec trois millilitres de 4%formula, et remplacez les couvercles afin d'éviter l'évaporation. Après 15 minutes à une demi-heure, aspirez et éliminez la formule de manière appropriée.Les colonies sont désormais prêtes à être colorées avec du violet de crésyl à 0,1 % ; cinq millilitres sont ajoutés à chaque boîte, puis les couvercles sont remis en place après une demi-heure à une heure. Le colorant est ensuite éliminé par rinçage à l’eau distillée, et les boîtes sont retournées et laissées sécher toute la nuit. Les colonies sont maintenant prêtes à être comptées.Les colonies peuvent être comptées manuellement à l'aide d'un microscope stéréoscopique. Tout groupement de cellules contenant 50 cellules ou plus est considéré comme une colonie. Et voilà qui conclut notre démonstration du test de survie congénique.Le principal avantage de ce test par rapport à d'autres techniques est qu'il est extrêmement sensible et peut détecter la survie sur une large plage, même après une réduction de six logarithmes des cellules. Cette sensibilité est obtenue en ensemencant un plus grand nombre de cellules. Ce test peut facilement être utilisé à d'autres fins, telles que l'évaluation de la cytotoxicité.Merci d'avoir regardé.

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