Test clonogénique: cellules adhérentes

Bonjour, je m’appelle Lum et j’entreprends actuellement mon doctorat à l’Institut du cœur et du diabète BE IDI sous la supervision du Dr Tom Carianne, qui dirige le laboratoire de médecine épigénomique. Dans cette vidéo, je vais faire la démonstration de la procédure connue sous le nom de Clon Genic Survival Assay. Il s’agit d’une technique vieille de 50 ans, qui permet d’évaluer l’impact de différents traitements tels que l’exposition à des radiations ou à des agents chimiques sur la viabilité reproductive cellulaire.

Le test de survie congénique est une technique centrale en radiobiologie pour évaluer la sensibilité aux radiations de différentes lignées cellulaires et tester l’efficacité de différents composés radioprotecteurs ou radiosensibilisants. Lors de l’utilisation d’une lignée cellulaire adhérente A, le test de survie cryogénique se compose de trois phases. Tout d’abord, le traitement d’une monocouche de cellules adhérentes.

Deuxièmement, la préparation d’une suspension cellulaire unique et le placage d’un nombre connu de cellules et de plats peints, et troisièmement, la coloration, le comptage et les colonies formées après une période d’incubation. Dans cette vidéo, j’utiliserai des cellules de site cino humaines immortalisées pour démontrer comment le test biblique polygénique peut être utilisé pour déterminer les propriétés de protection radio de l’antioxydant naturel. 1225 millions de flas sont ensemencés de cellules dans cinq mils de milieu au préalable, de sorte que le jour de l’expérience, il y a 1 million de cellules par flacon.

50 microlitres du médicament sont ajoutés à différentes concentrations aux cinq mils de milieu dans chaque flacon correctement étiqueté pour atteindre la concentration requise, cinq concentrations sont utilisées ainsi qu’un témoin de véhicule dans ce cas, le PBS. Après l’ajout du médicament, les cellules sont incubées pendant une heure dans les conditions appropriées à la lignée cellulaire utilisée après l’incubation. Les flux, à l’exclusion du groupe témoin, sont irradiés à la dose choisie, qui dans ce cas est de quatre gris produits par une source de césium émettant des rayons gamma

Après l’irradiation, les milieux se sont déversés et chaque flacon est lavé avec deux mils de PBS pendant cinq minutes. Après avoir versé le PBS, deux mils de trypsine à 0,05 % sont ajoutés à chaque fiole pour détacher les cellules adhérentes A du ballon. Les cinq millilitres inférieurs de DMEM contenant 10 % de sérum de bovin fœtal sont ensuite ajoutés à chaque flacon pour désactiver la trypsine.

Le contenu complet du fasc est ensuite transféré dans des tubes Falcon de 10 millilitres étiquetés. Une fois terminés, ces tubes sont centrifugés pendant cinq minutes, après quoi le supinateur est soigneusement jeté sans déranger le palais, et cinq mils de média de crécy sont ajoutés à chaque tube. La concentration de cellules pour chaque échantillon est calculée ENC ainsi que le volume nécessaire de chaque échantillon pour atteindre la concentration finale des cellules à disposer dans cinq boîtes de Pétri par échantillon avec cinq millilitres de milieu chacune.

Par exemple, pour le groupe témoin, 100 cellules sont plaquées par boîte, de sorte que le volume nécessaire pour atteindre 500 cellules par 25 millilitres est calculé pour des échantillons plus concentrés, effectuez soit une dilution 10 fois, soit une dilution 100 fois plus sérielle pour minimiser l’erreur impliquée lors de l’utilisation de volumes inférieurs à 100 microlitres. Maintenant, le volume précédemment calculé est préparé dans un tube Falcon contenant 25 millilitres de milieu pour chaque échantillon. Les échantillons peuvent maintenant être transférés dans des plats préalablement étiquetés, en ajoutant cinq millilitres à chaque plat pour faciliter la manipulation et le transport.

Conservez la vaisselle dans un grand récipient stérile ou désinfecté. Les plats sont ensuite placés dans un incubateur humidifié dans les conditions appropriées et incubés pendant huit jours. Si vous utilisez des kératinocytes après huit jours, retirez soigneusement la vaisselle de l’incubateur et disposez-les une par une à l’intérieur d’une hotte.

Veillez à manipuler l’endroit avec douceur afin que les colonies qui se sont formées ne soient pas dérangées. Retirez les couvercles et ajoutez cinq ml de solution saline à 0,9 % dans chaque plat pour les laver. Dirigez la pointe de préparation dans le coin du plat et évitez de toucher le fond du plat afin de ne pas gratter accidentellement les colonies.

Après cinq minutes, aspirez soigneusement la solution saline. Maintenant, les colonies sont fixées avec trois millilitres de formule à 4 %, et les fils doivent être remplacés pour éviter l’évaporation. Après 15 minutes à une demi-heure, la formule est aspirée et éliminée de manière appropriée.

Les colonies sont maintenant prêtes à être colorées avec 0,1 % de violet cristallin, cinq millilitres sont ajoutés à chaque plat et les couvercles sont remplacés après une demi-heure à une heure. Le colorant est ensuite lavé à l’eau distillée et la vaisselle est inversée et laissée sécher pendant la nuit. Les colonies sont maintenant prêtes à être comptées.

Les colonies peuvent être comptées manuellement à l’aide d’un microscope à dissection. Tout groupe de cellules contenant 50 cellules ou plus est considéré comme une colonie. Et cela conclut notre démonstration de l’essai de survie congénique.

Le principal avantage de ce test par rapport aux autres techniques est qu’il est incroyablement sensible et peut détecter la survie sur une large plage, même après six journaux de destruction cellulaire. Cette sensibilité est obtenue en plaquant un plus grand nombre de cellules. Cet essai peut facilement être utilisé à d’autres fins, telles que le test, comme le test de cytotoxicité.

Merci d’avoir regardé.