Name: La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires daspiration (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-20T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Apprenez à fabriquer des électrodes d'aspiration extracellulaires pour enregistrer l'activité électrique de la moelle épinière de rongeurs néonataux in vitro. Cette méthode utilise un lampe à alcool pour façonner le tubage plastique.

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Samuel L. Pfaff est un professeur dans les laboratoires de l&#39;expression génique au Salk Institute for Biological Studies et un chercheur à l&#39;Institut médical Howard Hughes. Ce travail a été soutenu par la Christopher Reeve et Dana Foundation. Joe Belcovson, Kent et Mike Sullivan Schnoeker de Ressources Multimédia à l&#39;Institut Salk a fourni une aide à la photographie et l&#39;édition.

Enregistrements électrophysiologiques de la moelle épinière isolée peut révéler des changements génétiques et développementales de neurones de circuits 1. Nous avons précédemment démontré une méthode de disséquer les cordons de souris néonatales vertébrale 2. Nous présentons ici une méthode pour préparer les électrodes d'aspiration utile dans l'enregistrement de locomotion fictive dans les régions isolées de la moelle épinière 3. La pointe d'une électrode de tubes en plastique peuvent être tirées d'une pointe très fine à la main en utilisant une lampe à alcool à basse température 3-5. Le tube de plastique (PE90, Clay Adams Intramedic TM) est détenu sur la flamme pour adoucir le tube dans une forme malléable. Comme le tube commence à fondre et devient plus translucide, il est retiré de la source de chaleur et les extrémités sont doucement tiré à part. Le moment de retirer le tube de la flamme est important pour assurer le plastique ne s'effondre ou divisé en cours d'élaboration. La partie mince du tube est coupé avec une lame de rasoir en fonction du diamètre interne désirée, comme dicté par l'âge de l'échantillon ou le niveau segmentaire de la moelle. Pour plus de facilité de placer un joint torique sur le tuyau, une coupe de 45 ° est faite à l'extrémité la plus épaisse de la tubulure avec une lame de rasoir. Une bague et le joint torique sont installés sur la fin d'épaisseur pour fixer le bout de l'électrode sur le canon de l'électrode. Pour permettre électrodes spécifiquement dimensionnés et éviter les difficultés de la main-conseils en tirant des électrodes, électrodes peuvent être construits en utilisant des tubes insérés dans une petite épais tubes (PE90). Les longueurs de la tubulure sont spécifiques aux exigences de la configuration d'enregistrement et sont variables. Nous présentons les mesures utilisées dans nos expériences 1-3,5. Une longueur de 1 cm de tube PTFE fines (Zeus, petites pièces) et une longueur de 10cm du tube PE90 sont coupés avec une lame de rasoir. Les extrémités du tube petits devraient être examinés pour s'assurer qu'ils ne sont pas écrasés ou fermé. Ils peuvent être ouverts à l'aide d'une broche d'insectes (Outils Fine Science). Une goutte de colle (JB Weld) est placée sur le milieu du tube PTFE. Le tube de PTFE et de l'adhésif sont aspirés dans le tuyau d'aspiration en utilisant PE90 bouche sur le tube PE90. Une coupe de 45 ° est faite à l'issue d'épaisseur du tube et un embout et joint torique sont attachés, comme précédent. Le connecteur BNC virole et sont dévissés partir d'une électrode d'aspiration commerciales. Le connecteur BNC est trempé dans du xylène pendant une heure pour enlever le sceau de cire. Le connecteur est ensuite rincé à l'eau et séché. Un port latérale inférieure inclinée doit être faite sur le côté du canon. Une tige de métal est chauffé à l'aide d'un brûleur Bunsen et pressé dans le trou existant du côté du baril à un angle faible. Une longueur de 15cm de 0,010 pouces de fil d'argent (AM Systems) est coupé et imbibé d'eau de javel pendant quinze minutes. Ceci est fait pour créer un revêtement de chlorure d'argent qui aide à 6 de la conduction du signal. Le fil est rincé à l'eau, séché, puis soudé sur le connecteur BNC. Le fil connecteur BNC et l'argent sont insérés dans le canon d'électrodes d'aspiration avec assez de place pour le connecteur BNC de rester sur le côté du canon. Tuyau d'aspiration est insérée dans le port du côté 2-3cm. Mastic silicone est injecté dans le cylindre d'environ 2-3cm. Le connecteur BNC est vissé dans le canon de l'électrode de pousser le mastic avant. La pointe de l'électrode est désormais vissé dans la partie avant de l'électrode. Gaine thermorétractable peuvent également être ajoutés pour renforcer la ligne d'aspiration du côté bâbord. Les électrodes sont montées sur micromanipulateurs qui sont attachés aux stands magnétique, et placé près de l'antenne d'enregistrement. BNC câbles coaxiaux sont attachés à un headstage qui est relié à un amplificateur. L'amplificateur est connecté à un adaptateur (Polyview) qui est connecté à une carte de l'analogique au numérique (National Instruments) dans un ordinateur PC avec le logiciel d'acquisition de données (Polyview). Lors de l'enregistrement des données électrophysiologiques, il est nécessaire d'éliminer toutes les interférences extérieures. Le plat d'enregistrement, un amplificateur, et le stade de la tête sont placés sur une table de l'air intérieur d'une cage de Faraday pour éviter les interférences électriques et mécaniques, respectivement. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Une électrode d'aspiration disponibles dans le commerce peuvent être modifiés par l'ajout d'un fil de plus gros calibre d'argent et un bout de plastique qui est dessiné à la main sur une lampe à alcool, ou construits avec des tubes en plastique disponibles dans le commerce de formats spécifiques. En outre, l'étanchéité de paraffine est remplacé avec plus de mastic silicone calfeutrage durable. <img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Un schéma de l'électrode d'aspiration par rapport à la table de l'air (pour l'isolation mécanique), cage de Faraday (électrique isolatile), un amplificateur et un ordinateur. Il faut noter qu'il ya un terrain référencé à l'antenne d'enregistrement et un deuxième motif qui est référencé à la table de l'air et la cage de Faraday.

<ol><li>Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+rhythmic+locomotor+burst+patterns+using+a+continuous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform.</a> Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Gallarda, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, 233-236 (2008).</li>
<li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+motor+projection+patterns+in+the+chick+hind+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of motor projection patterns in the chick hind limb.</a> J Physiol. 284, 391-414 (1978).</li>
<li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Chanin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+chloride+by+use+of+the+silver-silver+chloride+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode.</a> Science. 119, 323-324 (1954).</li>
<li>Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+controlling+vertebrate+locomotion%3A+moving+in+a+new+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction.</a> Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).</li>
</ol>

Développement du système nerveux peut être étudiée en utilisant des cordons rongeurs isolés épinière. En présence de neurotransmetteurs, la locomotion fictive peut être généré à partir de la moelle épinière dans la forme de motifs activité électrique 1,3. Ces bouffées rythmiques sont produites à 0,2 à 0,5 Hz et sont modelés en alternances gauche-droite et fléchisseurs-extenseurs. A différents stades de développement, la robustesse et les modèles de cette activité varie 1. Les mutations génétiques p...

<table><tbody><tr><td>Tuyau en PTFE à paroi fine (petit tuyau)</td><td>Zeus</td><td>36AWG</td><td>0.005&amp;#8221;ID x 0.003&amp;#8221; d'épaisseur (petites pièces). Également disponible de 0.003&amp;#8221; à 0.006&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Grand tuyau (0,86 mm (0,34&amp;#8221;))</td><td>BD Biosciences</td><td>427420</td><td>0,86 mm (0,34&amp;#8221;) de diamètre extérieur, 1,27 mm (0,050&amp;#8221;)</td></tr><tr><td>Corps de l'électrode</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif</td><td>JB Weld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhésif : mastic au silicone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Étain à souder et fer à souder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fil d'argent : 0,010&amp;#8221;</td><td>A-M Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Épingles pour insectes : Austerlitz 0,1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Narishige International</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>Miniboard (tête d'amplification)</td><td>Grass Technologies</td><td>F-15EB/B1</td><td></td></tr><tr><td>Unité adaptateur Polyview</td><td>Grass Technologies</td><td>PVA 8</td><td></td></tr><tr><td>Système amplificateur bipolaire portable Physiodata</td><td>Grass Technologies</td><td>15LT</td><td></td></tr><tr><td>CARTE ANALOGIQUE À NUMÉRIQUE</td><td>National Instruments</td><td>6035E</td><td></td></tr><tr><td>Table anti-vibrations ; Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la moelle épinière électrophysiologie ii: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Développement des circuits de neurones et la locomotion peut être étudiée à l&#39;aide de la moelle épinière des rongeurs néonatale centrale générateur de pattern (CPG) de comportement. Nous démontrons une méthode pour fabriquer des électrodes d&#39;aspiration qui sont utilisés pour examiner l&#39;activité CPG, ou de la locomotion fictive, dans les cordons de rongeurs disséqué épinière. Les cordons de rongeurs épinière sont placés dans le liquide céphalorachidien artificiel et les racines ventrales sont entraînés dans l&#39;électrode d&#39;aspiration. L&#39;électrode est construit en modifiant une électrode d&#39;aspiration disponible commercialement. Un fil plus lourd argent est utilisé au lieu du fil standard donné par l&#39;électrode disponibles commercialement. La pointe de verre sur l&#39;électrode commercial est remplacé par un embout en plastique pour une durabilité accrue. Nous préparons la main électrodes dessinés et fabriqués à partir d&#39;électrodes spécifiques tailles de tubes, ce qui permet la cohérence et la reproductibilité. Les données sont recueillies au moyen d&#39;un amplificateur et un logiciel d&#39;acquisition neurogram. Les enregistrements sont effectués sur une table de l&#39;air intérieur d&#39;une cage de Faraday pour éviter les interférences électriques et mécaniques, respectivement.

Une démonstration de la fabrication et l&#39;utilisation d&#39;une électrode extracellulaire aspiration utilisés pour mesurer des enregistrements électrophysiologiques des cordons de rongeur néonatal épinière<em&gt; In vitro</em

La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Le développement des circuits neuronaux et de la locomotion peut être étudié à l'aide du comportement du générateur central de rythme (CPG) de la moelle épinière de rongeurs néonataux. Nous démontrons...

Bonjour. Je m'appelle Resh Gary Dory, et je suis assistant de recherche au laboratoire faf de l'Institut Salk pour les études biologiques. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment fabriquer des électrodes de succion extracellulaires en utilisant deux méthodes. Ces électrodes peuvent être utilisées pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques de moelles épinières in vitro.Utilisez une lampe à alcool comme source de chaleur pour ramollir le tube en plastique PE 90 jusqu'à l'obtention de la largeur souhaitée. Tenez le tube au-dessus de la flamme allumée et retirez-le dès qu'il commence à fondre, puis écartez doucement les extrémités, en prenant soin de ne pas rompre le milieu. Ce processus est montré à nouveau.Retirez le tube au fur et à mesure qu’il ramollit et fond, et tirez doucement sur les extrémités pour les séparer. Coupez le tube avec une lame de rasoir bien aiguisée à un endroit correspondant à la largeur approximative de l’échantillon à mesurer à l’extrémité la plus épaisse du tube. Effectuez une incision à un angle de 45 degrés.Une bague torique et un écrou feral doivent maintenant être installés sur l'extrémité épaisse. Insérez cette extrémité du tube à travers l'ouverture hexagonale de l'écrou feral. Ensuite, insérez l'extrémité du tube dans la bague torique en caoutchouc.Ce dispositif sera vissé à l'avant de l'électrode. Coupez un morceau de un centimètre de tube fin Zeus à l’aide d’une lame de rasoir bien aiguisée et examinez les extrémités pour vérifier qu’elles sont proprement coupées et que le canal est ouvert. Coupez un morceau de dix centimètres de tube PE 90 à l’aide d’une lame de rasoir bien aiguisée. Déposez une goutte de colle JB Weld au milieu du petit tube à l’aide d’une aspiration buccale.Insérez le petit tube et la soudure dans l'alésage du grand tube et laissez ce montage durcir toute la nuit. Bien qu'il ne soit pas illustré, une coupe à 45 degrés doit être effectuée à l'extrémité épaisse de ce tube, et un raccord conique et un joint torique doivent être installés sur cette extrémité, de la même manière que précédemment indiqué.Démontez une électrode de succion standard en dévissant le ferral de l'extrémité avant de l'électrode et le connecteur BNC de l'arrière. Un orifice latéral inférieur incliné doit maintenant être réalisé sur le côté du barillet de l'électrode. Chauffez un morceau de métal à l'aide d'un bec Bunsen.Appuyez le métal chauffé dans le trou existant sur le côté du baril selon un angle faible. Retirez le fil argenté du connecteur BNC en tirant sur le fil au niveau de son raccordement au connecteur. Faites tremper le connecteur BNC dans le xylène pendant une heure afin d'éliminer la cire.Une fois la cire retirée, rincez le connecteur à l'eau et séchez-le avec du papier essuie-tout. Coupez un morceau de fil d'argent d'une longueur de 15 centimètres. Faites tremper le fil dans de l'eau de Javel pendant 15 minutes.Ensuite, rincez et séchez avec des serviettes en papier. Soudez le fil d'argent au connecteur BNC. Insérez le fil d'argent dans l'extrémité arrière du barillet de l'électrode de succion, en laissant suffisamment d'espace pour que le connecteur BNC reste sur le côté.Insérez le tube d'aspiration dans le port latéral sur environ trois centimètres. Injectez du scellant en silicone dans l'ouverture arrière de l'électrode d'aspiration tout en empêchant qu'il ne s'écoule par le port latéral en le bouchant avec votre doigt. Injectez le scellant sur environ deux à trois centimètres à l'intérieur du corps de l'électrode.Une fois l'opération échouée, vissez fermement le connecteur BNC en place, ce qui fera avancer le scellant. Laissez le scellant durcir toute la nuit. Vissez le ferraillage du tube créé par la méthode de la pointe tirée ou de la pointe coupée à l'avant du redressement de l'électrode.Le tube facilitera le passage du fil d'argent à l'intérieur de l'électrode, qui est désormais terminé. Le dispositif d'enregistrement est placé dans une cage de Faraday afin de réduire les interférences extérieures. Notre dispositif est également installé sur une table anti-vibrations pneumatique pour éliminer les interférences mécaniques.Les électrodes sont montées sur des micromanipulateurs équipés de supports magnétiques et placées près de la cuve d'enregistrement. Les câbles coaxiaux BNC sont reliés à un étage d'entrée qui est connecté à un amplificateur. L'amplificateur est câblé à un adaptateur poly view, lui-même relié à l'ordinateur.Ce montage est montré en gros plan. Les câbles coaxiaux BNC sont reliés à un étage de tête. L'étage de tête est connecté à l'amplificateur.La sortie de l'amplificateur quitte la cage de Faraday et est reliée à un adaptateur polyvalent. L'adaptateur polyvalent est connecté à l'ordinateur sur lequel un logiciel d'enregistrement approprié est installé. L'ensemble du dispositif doit être correctement mis à la terre.Une mise à la terre externe est établie en reliant la cage de Faraday et la table pneumatique à une terre. Une mise à la terre interne est établie en connectant électriquement le plat de dissection à l'étage de tête. Il est également nécessaire de relier les portes de la cage au corps principal. Avec le dispositif adéquat, les données peuvent désormais être collectées. Merci d'avoir regardé cette vidéo et de l'utiliser pour vous aider dans vos expériences futures.

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