Name: Ion Beam ciblée de fraisage et de microscopie électronique à balayage du tissu cérébral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Apprenez la préparation et l'imagerie 3D de tissu cérébral enrobé de résine par microscopie électronique à balayage à faisceau d'ions focalisé. Cette méthode offre une résolution Z élevée pour l'analyse structurale détaillée.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Fixation des échantillons et résine d'enrobage <ol><li> Des échantillons de tissus frais et les cellules sont fixés pour au moins 2 heures dans du paraformaldéhyde à 2%, et 2,5% de glutaraldéhyde dans du tampon phosphate 0,1 M à un pH de 7,4. La taille de l'échantillon ne doit pas dépasser 0,150 mm d'épaisseur pour permettre une pénétration adéquate ou fixateur, et ne doit pas être laissé dans le correctif pour plus de 12 heures. </li><li> Placer les échantillons dans des flacons de 20ml à scintillation en verre et rincez-les trois fois, 5 minutes chacun, dans 0,1 M de tampon cacodylate. </li><li> Colorer à 1,5% (p / v) de potassium tétroxyde d'osmium ferrocyanure et 1% (p / v) dans 0,1 M de tampon cacodylate (0,1 M, pH 7,4) pendant 30 minutes. </li><li> Tache avec du tétroxyde d'osmium 1,0% (p / v) en tampon cacodylate 0,1 M pendant 30 minutes. </li><li> Rincer une fois avec de l'eau distillée double pour 3 minutes. </li><li> Colorer à 1% (p / v) d'acétate d'uranyle dans l'eau bidistillée pour 30 minutes. </li><li> Rincer les sections pendant 5 minutes dans de l'eau bidistillée, puis se déshydrater en série graduée d'alcool, à 2 min de chaque changement (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). </li><li> Intégrer dans des concentrations croissantes de résine mélangée à l'éthanol Durcupan, à 30 minutes chaque changement, à partir de Durcupan 50% dans l'éthanol, puis suivi par: 70%, 90%, 95%, puis à 100%. </li><li> Remplacez-le par Durcupan frais et agiter doucement pendant 4 heures. </li><li> Sections Place, en utilisant des bâtons cocktail de bois, sur des microscopes lames de verre recouvertes avec l'agent de la moisissure se séparer, et le placer dans le four à 65 ° C pendant 24 heures. </li></ol> 2. Préparation de l'échantillon pour le FIB / SEM <ol start="11"><li> Séparez la couche de résine, contenant les échantillons, de l'entre deux lames de microscope en verre et se laver soigneusement pour enlever toute moisissure agent de séparation. </li><li> En utilisant un microscope à lumière transmise avec les objectifs de faible puissance, ou loupe binoculaire avec éclairage transmis, pour identifier la région d'intérêt dans la tranche de la résine. </li><li> Coupez un petit (3 mm x 3 mm) carrés autour de la région d'intérêt en utilisant une lame de rasoir et coller ce au sommet du bloc de résine vierge avec de la colle acrylique (figure 1). Attendez 5 minutes pour que la colle durcisse, puis passez à l'étape suivante. </li><li> Fixer le bloc dans le titulaire de la ulramicrotome et, en utilisant le stéréomicroscope attachés, bordure autour de la région d'intérêt avec une lame de rasoir jusqu'à ce que seul une petite pyramide de vestiges matériels. </li><li> D'autres garnitures du bloc, en utilisant un couteau dans le verre fixe ultramicrotome, de sorte que la région d'intérêt peut être situé précisément en ce qui concerne les dimensions de la surface du bloc (figure 1). Couper un bord du bloc, à proximité de la région d'intérêt, de sorte qu'une étape perpendiculaire est coupé à travers l'échantillon (figure 1 et 2). Cette étape constitue la face d'imagerie (figure 2). </li><li> Retirez le bloc de la ultramicrotome et de photographier la région d'intérêt au sein du bloc, en utilisant un microscope à lumière transmise. </li><li> Couper le bloc coupé loin du talon de résine restante. Ceci est fait en utilisant scie de bijoutier et assure que seul un petit bloc est placé à l'intérieur du FIB / SEM. La hauteur totale de ce bloc ne doit pas être supérieur à 5 mm. </li><li> Collez le bloc d'aluminium avec un talon pâte de carbone assurant que le côté à numériser est sur le bord extérieur (figure 1). </li><li> Après la colle séchée, recouvrir le bloc avec une fine couche d'or (&gt; 20 nm; système d'évaporation sous vide Cressington). </li></ol> 3. Imagerie dans la FIB / SEM <ol start="20"><li> A un faible grossissement, et en utilisant l'imagerie d'électrons secondaires (5 kV, 0,5 NAMP), orienter le bloc de sorte que la région choisie d'intérêt et le côté du bloc à imager est confronté l'opérateur (figure 2 c, d). </li><li> Orientez le bloc afin que le visage à imager est parallèle à la poutre de fraisage. Cela signifie que faisceau d'électrons est orienté à 54 ° par rapport à cette face (figure 2 b). </li><li> En utilisant un faisceau d'ions actuel de 13 à 27 à 30 kV Namps retirer une bande étroite de résine de l'avant de la région à imager. </li><li> Passer en mode d'imagerie rétrodiffusée pour voir la face fraisée qui recouvre la région d'intérêt. </li><li> Utilisation de la microscopie optique d'image de référence (prise à l'étape 16) et l'image du visage fraisé localiser la région exacte sur le bloc pour être broyé et imagées (Figure 2). </li><li> Dépôt d'une couche protectrice (environ 1 micron d'épaisseur) de carbone (ou en métal), en utilisant le système d'injection de gaz du microscope, sur la surface du bloc, au-dessus de la région d'intérêt (figure 2). </li><li> L'utilisation d'un courant de 700 picoAmps, moulin finement la région du bloc dans lequel les images finales seront prises. </li><li> Laisser le faisceau mouture complètement moulin à ce visage image jusqu'à pas d'artefacts de fraisage peut être vu sur le visage. Un moulin complet du visage est vérifiée en observant les changements dans chaque image subséquentes à travers le champ de vision. Fraisage inadéquat peut également considéré comme des stries blanches ou «rideaux» figurant Vertically dans l'image. </li><li> Laisser le microscope pendant au moins 2 heures pour tout changement thermique pour dissiper. Cela réduit le risque que la face du bloc va dériver pendant l'imagerie, aboutissant à des images alignées. </li><li> Sélectionnez les paramètres de microscope pour l'imagerie du visage en série. Assurez-vous que le faisceau d'électrons a une tension qui est assez bas pour l'image seule une très faible profondeur de matériel dans la face du bloc. Cela devrait également être beaucoup moins profonde que l'épaisseur de la face pour être enlevé. Les paramètres typiques de l'imagerie sont des tensions entre 1,2 à 2,0 kV avec des tailles de pixels compris entre 4 - 20 nm. Le pixel habitent besoin de temps pour être maintenu autour de 10 μsecs sorte que le temps total à l'usine sur le visage et l'acquisition d'une image est maintenue en dessous de 2 minutes (figure 3). </li></ol> 4. Secrets de la réussite Étape 1) s'assurer que les échantillons ne sont pas plus épais que 150 microns. Cela permettra une pénétration adéquate des taches différentes et de la résine dans le matériau. Ceci peut être réalisé en sectionnant les échantillons avec un vibratome immédiatement après la fixation. Cette épaisseur est appropriée pour le tissu cérébral. D'autres tissus doivent être testés pour garantir une fixation adéquate et la coloration. Étape 3) Les échantillons doivent être distribuée gratuitement dans toute la solution, et non groupées dans une partie du flacon tout ce fixateur secondaire est introduit. Cela permettra d'assurer une pénétration maximale de l'échantillon et à réduire l'échantillon devient déformée lors de ce processus de fixation. Ceci est réalisé en remuant doucement les échantillons dans le flacon immédiatement après que la solution est ajoutée. Étape 15) Assurez-vous que la région d'intérêt est située immédiatement au-dessous (&lt;30 microns) de la surface du bloc. Cela permettra de réduire la quantité de mouture par le faisceau d'ions pendant la phase d'acquisition d'image. Etape 22) Le temps de balayage du faisceau d'ions doit être adequte pour s'assurer que le visage entier, est complètement blanchi. Fraisage inadéquat sera affiché comme des stries blanches, ou «rideaux» figurant à la verticale sur le visage d'imagerie. Etape 26) Le visage finale moulu doit être plus grand que le visage qui est imagé. C'est parce que la résine broyée est éjecté du bloc et redépose sur la surface du bloc dans le voisinage immédiat. Cette redéposition peut empiéter sur le champ de vue de l'imagerie, et est évité par fraisage d'une zone beaucoup plus grande que ce qui est imagé. Pour une fenêtre d'imagerie qui est de 20 microns de large, la face du bloc usiné est supérieure à 30 microns de large. Étape 29) Il est essentiel que les paramètres du faisceau d'électrons est telle que l'image est générée par des électrons qui émergent à partir de seulement les premiers nanomètres quelques de la surface du bloc. Cette une acheved en minimisant la tension en dessous de 2 kV et veiller à ce qu'aucun électrons pénètrent trop loin. Ceci est aussi aidé par l'utilisation d'une tension de grille sur le détecteur de sorte que seul l'électron avec les plus hautes énergies contribuent à l'image finale. Typiquement, une tension de grille de 1,3 kV est utilisé pour une tension de 1,5 kV imagerie. 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Préparation du bloc de résine. Une résine) embarqué coupe coronale (80 microns d'épaisseur) grâce à un cerveau de rat adulte affiché dans un steromicroscope. L'image montre clairement les différentes régions du cerveau qui peut être coupé de la section (b) en utilisant une lame de scalpel. Ici, un carré de 1 mm du cortex est retirée et (c) collé à un bloc de résine vierge. D) Le bloc de résine est ensuite ébarbé avec un couteau de verre monté dans un ultramicrotome, et une fois le bloc a été réduit à seulement quitter le région d'intérêt (e), une étape est coupée perpendiculairement à la surface avant du matériel embarqué. f) Cette région entière taillée est alors coupé du reste de la résine et montée sur un talon en aluminium prête pour le revêtement de métal et de l'imagerie dans le microscope électronique à balayage. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Préparation de la face du bloc pour FIB / SEM imagerie. A) et b) montrent les illustrations du bloc et le bord qui est moulu pour créer le visage d'imagerie (indiquée avec le noir double flèche). La position du faisceau d'ions (blanc) est indiqué parallèlement à la face d'imagerie, et le faisceau d'électrons (en gris) est montré frapper le visage à 54 ° au faisceau d'ions. C) montre une vue du bloc de prise avec le faisceau d'électrons et imagé avec les électrons secondaires. Le long de ce côté du bloc sombre une région (indiqué par boîte blanche pointillée) montre une partie du visage qui a été grossièrement moulu (illustré avec double têteed flèche noire) pour révéler l'échantillon sous-jacent. d) Lorsque cette région est imagée en utilisant uniquement les électrons rétrodiffusés le tissu embarqué peut être vu. Ici, la largeur de la section de tissu incorporé est indiquée par une flèche à double tête blanche. La barre d'échelle en C) est de 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Imagerie du volume des tissus du cerveau avec les voxels isotropes. A) Inversion contraste de l'image rétrodiffusée de la face du bloc montrant l'ultrastructure dans une région du cerveau du rat. Toutes les membranes sont visibles ainsi que des structures macromoléculaires. B) Un total de 1600 images ont été recueillies à 5 nm d'espacement résultant en une pile d'images avec les voxels isotropes. C) Cette pile peut être captée dans n'importe quel plan avec la même résolution. Cette image montre que la seule connexion synaptique est imagé dans le plan xy et le plan yz.

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

La technique du FIB / SEM fonctionne de manière optimale lorsque la région d&#39;intérêt n&#39;est pas trop grand. La limite supérieure pour un volume imagé dépend du faisceau d&#39;ions et de la région qu&#39;elle peut constamment moulin à plusieurs reprises pendant plusieurs heures. Jusqu&#39;à présent, ce qui a été fait avec des zones d&#39;environ 60 x 60 microns, cependant, l&#39;imagerie de cette surface n&#39;est pas possible avec une résolution d&#39;image convenable, principalement en raison du facteur temps dans la collecte d&#39;une telle image de grande taille. À titre d&#39;exemple, une image 4 kx 4 k avec un pixel temporisation à 10 microsecondes prendrait 2 minutes et 40 secondes à acquérir, et pour un champ de vision de 60 microns cela ne ferait que donner une taille de pixel de 15 nm. Pour l&#39;imagerie de l&#39;ultrastructure des cellules et des tissus, une plus petite taille des pixels est plus approprié, généralement entre 4 et 10 nm / pixel. Pour une surface de 60 x 60 microns, l&#39;image serait acquise en 10 heures, même si le microscope avait cette capacité. Pour ces raisons, le microscope est un outil idéal pour des volumes de l&#39;image de l&#39;ordre de 10 x 10 x 10 microns, ou des régions importantes de cellules entières. Cela peut facilement être fait dans un délai de 48 heures sur des échantillons qui sont bien en contraste avec cette procédure. Jusqu&#39;ici le protocole a été utilisé principalement avec les tissus du cerveau, ainsi que différents types de cellules de mammifères cultivées adhérant à lamelles. Toutefois, la procédure de fixation et de coloration peut être utilisé avec de nombreux autres types de matériel biologique, y compris les matières végétales pour produire aussi des piles d&#39;images bien contrastées. Par conséquent, le principal avantage de cette technique est sa capacité à volumes d&#39;image avec les voxels isotropes. Piles d&#39;images de ce type permettent d&#39;analyser le volume 3D en utilisant des images prises à n&#39;importe quel plan dans la pile. L&#39;avantage de cela est de permettre à l&#39;observateur de caractéristiques de l&#39;image de la série d&#39;images de n&#39;importe quelle direction et en fournissant un détail plus grande image (figure 3).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Colle cyanoacrylate </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Allemagne </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan de résine </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suisse </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM microscope (Zeiss, Nvision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Verre d&#39;histologie diapositives </td><td> Menzel-Glaser, Allemagne </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Coutelier de verre: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Allemagne </td><td></td></tr><tr><td> Flacons à scintillation en verre (20ml) </td><td> EMS, USA </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde </td><td> EMS, USA </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Joaillier vu </td><td> EMS, USA </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Agent de moisissure séparant </td><td> GLOREX, Suisse </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Tétroxyde d&#39;osmium </td><td> EMS, USA </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> EMS, USA </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Sels de phosphate pour un tampon phosphate </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suisse </td><td> 71642 et 71496 </td></tr><tr><td> Cacodylate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suisse </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter Coater avec l&#39;objectif d&#39;or </td><td> Cressington, USA </td><td></td></tr><tr><td> Tris base (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suisse </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotome: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Allemagne </td><td></td></tr><tr><td> Acétate d&#39;uranyle </td><td> EMS, USA </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

ion beam ciblée de fraisage et de microscopie électronique à balayage du tissu cérébral

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Ce protocole décrit comment échantillons biologiques, comme les tissus du cerveau, peut être imagée en trois dimensions à l&#39;aide du microscope ions porté par faisceau d&#39;électrons / balayage (FIB / SEM). Les échantillons sont fixés avec des aldéhydes, taché métaux lourds utilisant le tétroxyde d&#39;osmium et de l&#39;acétate d&#39;uranyle. Elles sont ensuite déshydratées avec de l&#39;alcool et infiltré avec de la résine, qui est ensuite durci. En utilisant un microscope optique et ultramicrotome avec des couteaux de verre, un petit bloc contenant l&#39;intérêt région proche de la surface est faite. Le bloc est ensuite placé à l&#39;intérieur du FIB / SEM, et le faisceau d&#39;ions utilisées pour environ moulin à une face verticale sur un côté du bloc, à proximité de cette région. En utilisant les électrons rétrodiffusés à l&#39;image des structures sous-jacentes, un petit visage est ensuite broyé avec un faisceau d&#39;ions plus fine et la surface examinée de plus près afin de déterminer la zone exacte du visage à imager et broyé. Les paramètres du microscope sont alors définies de sorte que le visage est à plusieurs reprises broyé et imagée afin que les images de série sont collectées grâce à un volume du bloc. La pile de l&#39;image contient généralement voxels isotropes ayant des dimensions aussi petites nm 4 une dans chaque direction. Cette qualité d&#39;image dans n&#39;importe quel plan d&#39;imagerie permet à l&#39;utilisateur d&#39;analyser ultrastructure cellulaire à n&#39;importe quel angle dans la pile d&#39;images.

Ce protocole décrit comment le tissu cérébral de résine intégrés peuvent être préparés et imagée dans les trois dimensions dans le faisceau d&#39;ions focalisé, microscope électronique à balayage.

Ion Beam ciblée de fraisage et de microscopie électronique à balayage du tissu cérébral

Ce protocole décrit comment des échantillons biologiques, tels que du tissu cérébral, peuvent être imagés en trois dimensions à l'aide du faisceau d'ions focalisé/microscope électronique à balayage...

L'objectif de cette procédure est d'acquérir des images en série à travers une région spécifique d'un tissu cérébral à l'aide d'un microscope électronique à balayage équipé d'un faisceau d'ions focalisés. Cette acquisition est réalisée en découpant d'abord le cerveau en tranches qui sont ensuite contrastées et incluses dans une résine. La deuxième étape consiste à prélever la région d'intérêt à partir de la section cérébrale incluse et à la monter sur un bloc de résine vierge.La troisième étape consiste à tailler le bloc de résine à l'aide d'un ultramicrotome et à utiliser le faisceau d'ions du microscope pour isoler uniquement la région à imager. L'étape finale consiste à acquérir en série des images d'une face du bloc de résine en utilisant le faisceau d'ions pour retirer de façon répétée des couches fines avant chaque prise d'image. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des images en série à travers une région d'intérêt.La série d'images est collectée automatiquement et le jeu de données comporte généralement des voxels isotropes, ce qui permet d'observer les structures de l'image sous n'importe quel angle dans la pile. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie électronique en transmission sur sections séries, est qu'elle permet d'atteindre une résolution en Z nettement supérieure. Par ailleurs, comparée à la tomographie électronique, elle permet d'imaginer des volumes beaucoup plus grands avec une résolution optimale pour les échantillons inclus en résine.La procédure commence par la dissection du cerveau fixé d'un rat perfusé anesthésié. Incorporez le cerveau dans de l'aérosol à 5 % chaud dans un moule en plastique, orientez le cerveau selon l'angle correct avant que l'aérosol ne durcisse, puis fixez le bloc d'aérosol contenant le cerveau sur un porte-échantillon à l'aide d'une tranchanteuse vibrante. Découpez des sections coronales de 80 micromètres, en réalisant autant de sections que nécessaire pour inclure la région d'intérêt.Placez ensuite les échantillons dans des vials en verre de 20 millilitres. Placez jusqu'à 10 sections par vial. Rincez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun dans du tampon K coate 0,1 molaire.Ensuite, colorer les échantillons avec du cyanure de potassium à 1,5 % et du tétraoxyde d'osmium à 1 % dans un tampon K coate 0,1 molaire pendant 30 minutes. Poursuivre la coloration des échantillons avec du tétraoxyde d'osmium à 1 % dans un tampon K coate 0,1 molaire pendant 30 minutes. Après cela, rincer une fois avec de l'eau doublement distillée pendant trois minutes, puis colorer avec de l'acétate d'aluminium à 1 % dans de l'eau doublement distillée pendant 30 minutes.Ensuite, rincez les sections pendant cinq minutes dans de l'eau doublement distillée, puis déshydratez-les dans une série alcoolique progressive, en prévoyant deux minutes pour chaque changement. L'étape suivante consiste à inclure les sections dans des concentrations croissantes de résine Duran mélangée à de l'alcool, en laissant 30 minutes entre chaque changement. Commencez avec un mélange éthanol-résine de 50 à 50, puis passez à 30 à 70, ensuite à 10 à 90, et enfin immergez complètement les sections dans de la résine à 100 % pendant 30 minutes.Ensuite, remplacez le milieu par de la résine Duran fraîche à 100 %. Agitez lentement pendant une heure sur le mélangeur rotatif. Après l'inclusion, utilisez un bâtonnet en bois pour placer les sections sur des lames de microscope en verre préalablement recouvertes d'agents de séparation de moule.Placez autant de sections que possible sur les lames, mais veillez à ne pas surcharger les lames. Assurez-vous qu'une étiquette d'identification est également placée entre les lames de microscope. Placez les lames dans un four à 65 degrés Celsius pendant 24 heures.Le lendemain, retirez les échantillons du four. Poussez délicatement une lame de rasoir entre les lames de verre pour microscopie et retirez la couche de résine contenant les échantillons située entre les lames, en tenant la couche de résine avec les doigts. Rincez délicatement l'échantillon à l'eau courante.Pour éliminer tout agent de séparation des moules, placez l'échantillon sous un microscope stéréo avec éclairage transmis en utilisant un objectif de faible puissance. Marquez la région d'intérêt à l’aide d’une aiguille fine. Utilisez une lame de rasoir pour découper un petit carré de trois millimètres sur trois millimètres autour de la région d’intérêt.Utilisez de la colle acrylique pour fixer le petit bloc de résine sur le dessus d'un bloc de résine vierge. Ensuite, serrez le bloc dans le porte-échantillon du microtome ultramince. En regardant à travers le microscope stéréo fixé, utilisez une lame de rasoir pour tailler autour de la région d'intérêt jusqu'à ce qu'il ne reste qu'une petite pyramide de matériau.Coupez le bord du bloc près de la région d'intérêt selon un angle par rapport à la surface supérieure du bloc à l'aide d'un couteau en verre fixé au microtome ultramicrotome. Ajustez davantage le bloc afin que la région d'intérêt puisse être localisée précisément par rapport aux dimensions de la surface du bloc. Retirez le bloc du microtome ultramicrotome et placez-le sous un microscope à lumière transmise.Photographiez la région d'intérêt. Utilisez une scie de bijoutier pour découper le bloc taillé et le séparer du reste du support en résine à l’aide de peinture au carbone. Fixez le bloc SA sur un porte-échantillon de MEB et orientez-le de manière à ce que la face à imager soit tournée vers le bord le plus externe.Une fois la colle sèche, transférez la préparation vers un système d'évaporation sous vide en forme de croissant et recouvrez le bloc d'une fine couche d'or de plus de 20 nanomètres. Le bloc de tissu inclus dans la résine est désormais prêt à être observé au microscope électronique à balayage à faisceau d'ions focalisés. Insérez l'échantillon dans son porte-objet dans le microscope à faible grossissement et, à l'aide de l'imagerie par électrons secondaires, orientez le bloc de manière à ce que la région d'intérêt et le côté du bloc à observer soient bien face à l'appareil.L'opérateur oriente le bloc de manière à ce que la face à imager soit parallèle au faisceau de fraisage. Cela positionne le faisceau d'électrons à un angle de 54 degrés par rapport à cette face, en utilisant un courant de faisceau d'ions compris entre 13 et 27 nanoampères, à 30 kilovolts.Retirez une bande étroite de résine à l'avant de la région à imager. Ensuite, passez en mode d'imagerie d'électrons rétrodiffusés pour visualiser la surface usinée qui recouvre la région d'intérêt. À l'aide de l'image de référence en microscopie optique prise précédemment et de l'image de la surface usinée, localisez la région exacte du bloc à usiner et à imager à l'aide du système d'injection de gaz du microscope.Déposez une couche protectrice d'environ un micron d'épaisseur en carbone ou en métal sur la surface du bloc au-dessus de la région d'intérêt en utilisant un courant de 700 picoampères. Enfin, fraisez la région du bloc dans laquelle les images finales seront prises. Laissez le faisceau de fraisage fraiser complètement cette face d’image jusqu’à ce qu’aucun artefact de fraisage ne soit visible sur la surface.Sélectionnez les paramètres du microscope pour l’imagerie en série de la face. Les paramètres typiques sont des tensions comprises entre 1,2 et deux kilovolts, avec des tailles de pixel comprises entre quatre et 20 nanomètres. Le temps de séjour par pixel doit être d’environ 10 microsecondes afin que le temps total nécessaire pour usiner la face et acquérir une image soit inférieur à deux minutes.Laisser le microscope reposer pendant au moins deux heures pour permettre toute stabilisation thermique. Pour dissiper les variations thermiques, commencer le processus de microtome ionique à faisceau focalisé (FIB) et d’imagerie afin d’acquérir des images en série à travers la région d’intérêt. Cette figure montre une image en électrons rétrodiffusés à contraste inversé de la surface du bloc, révélant l’ultrastructure au sein d’une région du cerveau enveloppé.Toutes les membranes sont visibles, ainsi que les grandes structures macromoléculaires. Cette figure est composée d'un total de 1 600 images recueillies avec un espacement de cinq nanomètres, ce qui donne un empilement d'images avec des voxels isotropes. Cet empilement peut être imagé dans n'importe quel plan avec la même résolution.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des tissus cérébraux pour l'imagerie en série à l'aide du microscope électronique à balayage par faisceau focalisé.

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Prenez une section fixe de tissu cérébral cortical de souris présentant des axones et des dendrites neuronaux. Les dendrites possèdent des protubérances, appelées épines dendritiques, qui forment des synapses avec des axones. Incuber le tissu avec du ferrocyanure d’osmium, qui se lie aux lipides, suivi d’une autre application d’osmium, qui améliore le contraste structurel pour l’imagerie. Teinture avec un composé de métal lourd qui se lie aux macromolécules et améliore le contraste. Déshydrater...

Microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés pour la reconstruction 3D de neurones liés synaptiquement

Cette vidéo présente une méthode permettant d’étudier les lésions cérébrales des larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie électronique à transmission à balayage (STEM) à grande échelle, une technique qui combine des éléments de la microscopie électronique à balayage (MEB) et de la microscopie électronique à transmission (MET) pour produire des images à haute résolution. Il décrit les étapes de la préparation des échantillons et de l’acquisition d’images STIM à haute résolution pour...

Étude d’une lésion cérébrale d’une larve de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie électronique à transmission à balayage à grande échelle

La microscopie électronique (EM) 2D à grande échelle, ou nanotomie, est l’application à l’échelle tissulaire de la résolution EM à l’échelle nanométrique. Nous décrivons ici une méthode universelle de nanotomie appliquée pour étudier le cerveau des larves de poisson-zèbre en bonne santé et lors de lésions cérébrales non invasives.

Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

La visualisation et l’analyse mitochondriales à partir de tissus cérébraux de mammifères constituent une tâche difficile. Ici, nous décrivons comment l’analyse de reconstruction tridimensionnelle (3D) de la microscopie électronique à balayage en série (SBFSEM) peut être utilisée pour mieux comprendre l’analyse morphologique et volumétrique de cet organite générateur d’énergie critique.

Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage

Cet article décrit une méthode simple pour préparer des petits cerveaux animaux pour l’imagerie micro-CT, dont les lésions peuvent être quantifiées et électrodes situés avec une grande précision dans le cadre de tout le cerveau.

Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit

Ici, nous présentons un protocole pour combiner efficacement la face de bloc de série et la microscopie électronique focalisée de faisceau d'ions pour cibler une zone d'intérêt. Cela permet une recherche efficace, en trois dimensions, et la localisation d'événements rares dans un grand champ de vision.

Études ciblées utilisant le visage de bloc en série et la microscopie électronique focalisée de faisceau d'ion

Nous avons montré que la gravure de nano-architecture dans des dispositifs intracortical de microélectrode peut réduire la réponse inflammatoire et a le potentiel d'améliorer des enregistrements électrophysiologiques. Les méthodes décrites ci-contre décrivent une approche pour équerler les nano-architectures à la surface des microélectrodes intracorticales non fonctionnelles et fonctionnelles de silicium à tige unique.

Lithographie focalisée de faisceau d'ion à Etch Nano-architectures dans des microélectrodes

Nous présentons ici un pipeline pour le fraisage par faisceau d’ions focalisés corrélatifs 3D sur le guidage de la préparation d’échantillons cellulaires pour la cryo-tomographie électronique. La position 3D des protéines d’intérêt marquées par fluorescence est d’abord déterminée par cryo-microscopie à fluorescence, puis ciblée pour le broyage. Le protocole convient aux cellules de mammifères, de levures et de bactéries.

Préparation d’échantillons par fraisage par faisceau d’ions focalisé corrélatif 3D pour la cryotomographie électronique haute résolution

Ce flux de travail permet la production de lamelles ciblant des structures biologiques marquées par fluorescence qui sont petites (&lt;1 μm d’étendue axiale) et rares (1 copie par cellule) à l’aide d’une plateforme d’imagerie cryogénique tri-coïncidente. Cette plate-forme intègre la microscopie à fluorescence, le broyage par faisceau d’ions focalisés et la microscopie électronique à balayage à une seule position focale et permet la microscopie à fluorescence simultanée pendant le broyage.

Flux de travail à l’aide d’un microscope cryogénique à fluorescence coïncidente, à faisceau d’électrons et d’ions pour le broyage ciblé de cellules

Nous avons introduit une nouvelle technique d’imagerie appelée tomographie par interférence optique multicouche (OMLIT), qui permet l’imagerie impartiale de toutes les cellules dans des échantillons cérébraux à l’échelle mésoscale et peut être intégrée sans effort au flux d’imagerie de la microscopie électronique à balayage en série sur ruban sur le même échantillon.

Une méthode d’imagerie optique compatible avec la microscopie électronique à balayage pour la cartographie céraire mesoscopique de toutes les cellules

Apprenez la préparation et l'imagerie 3D de tissu cérébral enrobé de résine par microscopie électronique à balayage à faisceau d'ions focalisé. Cette méthode offre une résolution Z élevée pour l'analyse structurale détaillée.

Ion Beam ciblée de fraisage et de microscopie électronique à balayage du tissu cérébral

Explorer plus de vidéos