Cellules Patterning sur des électrodes d'indium optiquement transparents Tin Oxide

Bonjour, je suis Isha. Je suis étudiante diplômante en deuxième année dans le laboratoire du Dr Zen. Nous sommes ici au Département de génie biomédical de l'Université de Californie à Davis.

Aujourd'hui, je vais vous montrer le contrôle d'Ian sur des électrodes en oxyde d'indium 10, microfabriquées et optiquement transparentes, dans le cadre d'efforts de génie tissulaire et de régénération visant à imiter le microenvironnement de l'organe. Afin de créer ce microenvironnement in vitro, il est essentiel d'isoler spatialement et temporellement les cellules sur un substrat. Nous nous intéressons à la conception de surfaces permettant de contrôler la localisation de différents types de cellules hépatiques.

Dans l'expérience d'aujourd'hui, nous allons utiliser la modification de surface, la microfabrication et l'électrochimie pour former une surface pouvant passer d'un état non adhésif pour les cellules à un état adhésif pour les cellules. La première étape est la photolithographie. Voici un diagramme des étapes de ce procédé.

Le bleu correspond à la lumière du verre, le vert est l'oxyde d'indium 10 qui est déposé sur la lumière du verre. Premièrement, nous allons appliquer par centrifugation une résine photosensible rouge, visible ici, sur le verre recouvert d'oxyde d'indium 10. Ensuite, nous ferons passer cet ensemble à travers un masque photolithographique sous lumière ultraviolette, et les régions exposées seront développées dans une solution de développement.

Les régions d'ITO non protégées par la résine photosensible seront éliminées lors de la gravure de l'ITO. Ensuite, toute la résine photosensible restante sera retirée à l'acétone afin de former nos électrodes en ITO. Voici le schéma synoptique des trois étapes restantes.

Tout d'abord, nous allons modifier la surface entière avec du peg cylin. Cela rendra la surface anti-adhésive, empêchant toute liaison de cellules ou de protéines. Ensuite, nous allons utiliser l'électrochimie pour absorber spécifiquement le peg cylin sur les électrodes I2 que nous avons fabriquées précédemment.

Et enfin, nous allons incuber des fibroblastes au-dessus de la surface, et ils se lieront de manière sélective uniquement aux régions en forme de bandes. Nous sommes donc maintenant prêts à commencer notre expérience. La première étape consiste en la photolithographie, qui sera réalisée dans une salle blanche.

Commençons donc par entrer dans la salle blanche. Nous voici maintenant dans notre salle blanche. Avant de commencer notre expérience, nous allons faire sécher nos échantillons recouverts d'oxyde d'indium-étain, ou ITO, à 200 °C dans notre four.

Ainsi, nous pouvons déshydrater toutes nos surfaces. Et après avoir chauffé à 200 °C, nous allons le placer sur notre machine de dépôt par centrifugation et appliquer effectivement la résine photosensible. Après avoir déshydraté notre substrat d'ITO, nous allons le prendre et le placer sur le mandrin de la machine de dépôt par centrifugation.

Ce mandrin est juste assez grand pour contenir un quart d'une plaque de verre. Ensuite, nous allons appliquer un vide. Après cela, nous appliquons une résine photosensible de type positif sur le substrat.

Après l'application de la résine photosensible, nous passons directement au démarrage. Cette procédure comprend deux étapes. La première est l'étalement, et la seconde est le dépôt par centrifugation lors de l'étape d'étalement.

Le mandrin tourne à 800 tr/min et répartit ainsi uniformément la résine photosensible sur toute la surface. Cependant, l'étape suivante est celle de rotation, qui s'effectue à 4 000 tr/min ; à cette vitesse, une couche très fine se forme. Par fine, j'entends environ un micromètre.

Si vous décomposez le mot « photo », « résist », cela donne « photo » et « résist ». Ce matériau est activé par la lumière. C’est pourquoi nous travaillons en salle blanche et utilisons une lumière filtrée afin que notre résine photosensible ne soit pas activée prématurément par la lumière. Elle est également résistante aux attaques chimiques, une propriété que nous exploiterons ultérieurement lors de la gravure.

À présent, nous avons terminé le dépôt par centrifugation du photo-résist sur la surface, et nous allons simplement le retirer pour passer à l'étape suivante. Après avoir cuit l'échantillon pendant une minute et 45 secondes, nous allons le retirer de la plaque chauffante et le déplacer vers notre aligneur à masque dur. Ici, nous prenons le masque nécessaire, puis nous plaçons ce masque au-dessus de notre substrat afin d'obtenir une impression par contact entre notre substrat recouvert de photo-résist et le masque ; nous plaçons par-dessus une plaquette de verre de quatre pouces afin d'ajouter du poids.

Et une fois que nous avons terminé cela, nous remettons simplement l'obturateur en place, puis nous exposons l'échantillon à la lumière UV. Une fois l'exposition terminée, nous déplaçons le couvercle dans l'ordre inverse. Nous retirons notre tranche de verre, nous retirons notre masque, puis nous enlevons notre substrat et l'emportons pour le développement.

Après avoir exposé l'échantillon, nous le plaçons dans une solution de développement. Lorsque l'échantillon a été exposé à la lumière UV, des ions hydrogène se sont formés, lesquels ont été neutralisés par la base de la solution de développement et ont effectivement été éliminés de la surface. Il est donc maintenant essentiel de veiller, lors de la manipulation de l'échantillon, à agiter constamment le substrat.

Et lorsque vous faites cela, vous pouvez observer, durant la première minute ou minute et demie environ, que les régions exposées se développent effectivement et sont éliminées de la surface. Toutefois, pour que le développement soit complet, nous laissons l’échantillon dans la solution révélatrice pendant environ cinq minutes. Une fois le développement terminé, nous allons le retirer, le rincer à l’eau désionisée, puis le sécher à l’aide d’un pistolet à azote.

Une fois notre échantillon séché, nous allons l’observer au microscope. Ici, nous examinons l’échantillon au microscope. Nous venons de le retirer après un développement de cinq minutes.

Il existe deux régions que vous pouvez observer ici : une région plus foncée recouverte de résine photosensible et une région plus claire où la résine photosensible a été retirée. Par rapport au masque utilisé précédemment, les régions plus foncées sur le masque correspondent aux régions plus foncées que nous voyons actuellement au microscope, tandis que les régions claires que nous observons ici étaient transparentes sur le masque. L'un des motifs présentés ici correspond simplement à des réseaux de tailles différentes allant de 500 à 50 micromètres, alors que l'autre motif est constitué de cercles de 1000 micromètres simplement interconnectés.

Ici, nous avons un design différent qui a été réalisé à l’aide de la même procédure. Nous disposons d’électrodes individuellement adressables. Par là, j’entends que différentes régions d’ITO sont interconnectées et peuvent être activées de manière distincte.

Par exemple ici, les régions circulaires centrales sont reliées à une pastille électrique ici, tandis que les régions rectangulaires les plus externes sont reliées à une pastille électrique différente. De cette manière, nous pouvons stimuler ces deux surfaces distinctes à des moments différents. Après avoir examiné nos échantillons, l'étape suivante consiste à graver l'échantillon.

Toutes les régions qui ne sont pas protégées par la photorésine seront gravées lors du gravage de l'ITO. Avant cela, nous devons nous assurer de porter des vêtements appropriés, car le gravage de l'ITO contient des acides. Maintenant que j'ai enfilé ma blouse de protection contre les acides et mis mon écran facial, je vais verser du produit de gravage de l'ITO dans un bécher en verre.

La gravure de l'ITO est composée de 20 % d'acide chlorhydrique, de 5 % d'acide nitrique et le reste est de l'eau désionisée. Ensuite, je prends mon échantillon et je le place dans la solution de gravure. Précédemment, au microscope, nous avons observé qu'il existait certaines régions qui n'étaient pas protégées par les reliefs photo.

Les acides présents dans la gravure de l'ITO ont attaqué ces régions et ont provoqué l'élimination de l'ITO de ces zones. Lorsque l'ITO se dégrade lentement à partir de la surface, sa couleur change. Ici, vous pouvez observer qu'il est passé d'une teinte bleutée, qu'il avait initialement, à une teinte violacée, et qu'il évolue maintenant vers une teinte jaunâtre.

Le changement de couleur indique que l'ITO est en cours de gravure. Nous sommes maintenant à 15 minutes. Tout l'ITO est complètement gravé.

Et ce que vous voyez actuellement, ce sont des photos de régions ITO protégées. Ainsi, après la gravure, il reste encore quelques acides à la surface. Pour éliminer ces acides, nous allons les placer dans une solution de carbonate de sodium, qui neutralisera tout l'acide.

Après avoir neutralisé les acides, nous allons le retirer et le nettoyer avec de l’eau DI, puis le sécher à l’azote. Nous avons donc terminé la gravure à l’acide. Plus d’acide ; je retire ma blouse thermique.

Nous allons le retirer, le transférer et l'observer au microscope. Nous examinons maintenant l'échantillon au microscope. Ceci correspond à l'étape suivant la gravure de l'ITO.

Dans ce cas, les zones plus foncées sont des régions de verre d'où l'ITO a été gravé. Et les zones plus claires correspondent à l'ITO protégé par une résine photosensible dans ce cas précis. Encore une fois, il s'agit de réseaux allant de 500 à 50 micromètres, et dans l'autre cas, nous avons nos cercles interconnectés de mille micromètres chacun.

Nous venons donc d'observer au microscope qu'il y avait des zones en verre et des zones en ITO, mais les zones en ITO étaient protégées par une résine photosensible. Nous devons maintenant éliminer cette résine photosensible. Pour cela, nous allons simplement prendre notre substrat, le placer dans de l'acétone, puis mettre ceci dans un bain ultrasonique et effectuer une sonication pendant 10 minutes.

Cela garantit que toute la résine photosensible est éliminée ; vous pourriez l'utiliser telle quelle comme tons, mais grâce au traitement par ultrasons, qui utilise des ondes sonores pour frapper, ce qui assure que la résine photosensible est correctement retirée. Après l'avoir sortie du bain ultrasonore, elle est rincée à l'eau désionisée, séchée à nouveau à l'azote, et vous pouvez maintenant voir clairement les motifs sur le substrat en verre. Ce sont les motifs qui étaient initialement protégés par la résine photosensible.

Maintenant que nous avons examiné nos échantillons et créé ou révélé nos motifs d'ITO, nous allons entamer la deuxième phase de l'expérience. Cette phase consiste à modifier la surface à l'aide d'une monocouche auto-assemblée de cycline PEG. Mais avant cela, nous devons nous assurer que la surface est réactive.

Pour ce faire, nous le plaçons dans un nettoyeur à plasma. Cela introduit des groupes hydroxyles à la surface et rend ainsi celle-ci réactive. Pour ce faire, nous plaçons simplement notre échantillon dans le nettoyeur à plasma, puis nous mettons en marche notre pompe à vide.

Nous activons l'oxygène, puis nous mettons sous tension l'alimentation principale. Cette énergie sert à convertir le gaz d'oxygène en plasma, qui est ensuite introduit et forme ainsi les sillons hydroxyles. Une fois l'alimentation activée, nous lançons le processus en appuyant sur démarrer.

Une fois le processus terminé, nous retirons notre substrat, le stockons dans une boîte de Pétri et quittons la salle blanche en suivant la procédure de déshabillage, puis passons à l'étape suivante. Maintenant que nous avons quitté la salle blanche et terminé notre motif idéal, nous allons modifier la surface que nous venons de structurer à l’aide de polyéthylène glycol, CYLIN ou PEG Cylin. Il est essentiel de savoir que le PEG Cylin est réactif à l’humidité.

Par conséquent, tout ce que nous utilisons en bois doit être exempt d'humidité. Le matériel en verre que nous avons utilisé ici, les boîtes de Pétri, ont été placés au four à 100 °C pendant toute une nuit. Et le solvant que nous allons utiliser est également anhydre.

Il ne contient pas d'humidité. Je vais donc verser du toluène anhydre dans ces deux haut-parleurs en verre, dont l'un contient notre échantillon. Nous devons utiliser deux boîtes de Pétri, car l'une d'elles servira à effectuer la modification.

Et l'autre sera utilisée ultérieurement, une fois la modification terminée, pour rincer effectivement notre substrat. Après avoir placé nos plats en verre, je vais simplement les transférer vers la chambre d'éclusage située ici dans la boîte à gants. Une fois la chambre d'éclusage fermée, nous allons introduire de l'azote dans la chambre.

La chambre principale est désormais déjà remplie d'azote. Nous ne voulons donc pas ouvrir cette chambre à moins qu'elle ne soit remplie d'azote. Une fois que les deux chambres contiennent de l'azote, nous allons transférer tous nos échantillons accompagnés d'une pipette.

Nous allons disposer d'une broche et d'une pince que nous utiliserons ultérieurement pour transférer les échantillons. Nous allons donc mettre nos gants, ouvrir la chambre ici et sortir lentement et soigneusement tout ce que nous avons dans notre sas d'entrée, puis le placer dans la chambre principale. Il s'agit de la boîte de Pétri contenant notre substrat et de la boîte de Pétri contenant uniquement du toluène que nous utiliserons pour le lavage.

Le pxi présent a été conditionné sous azote et vous ne devez pas ouvrir ce flacon à moins d'être dans un environnement d'azote. Ainsi, une fois que vous souhaitez prélever l'échantillon, vous le remettez dans le sac. Vous sortez donc votre cylin, et la concentration que nous allons utiliser est de 2 % dans le toluène.

Vous le retirez, le placez dans le grand récipient, puis vous mélangez. Vous introduisez également la chambre et vous assurez qu’il est bien mélangé, puis vous laissez l’échantillon incuber dans du Toin pendant deux heures. Maintenant que les deux heures sont écoulées, notre échantillon a séjourné dans du Pxi ; nous allons sortir l’échantillon et le transférer vers une solution fraîche de toin, où nous allons le rincer brièvement, le faire tourner doucement, puis le déplacer vers notre chambre d’éclusage.

Une fois dans notre chambre d'éclusage, nous allons simplement ouvrir la chambre et en sortir notre surface modifiée, puis la transporter à l’aide du pistolet à azote. Nous la plaçons à nouveau dans une boîte de Petri propre et sèche, puis la mettons dans une étuve à cent degrés C pendant deux heures supplémentaires. Maintenant que les échantillons ont été chauffés dans l’étuve à cent degrés C pendant deux heures, nous allons prendre et connecter nos fils aux électrodes que nous avons préparées.

Nous procédons en réalisant un mélange un pour un de résine époxy argentée et d'un agent durcisseur. Voici donc la résine époxy argentée, et maintenant nous y ajoutons une quantité équivalente de durcisseur. Nous devons bien mélanger, puis nous utiliserons ce mélange pour fixer nos fils.

Nous plaçons donc notre fil sur les électrodes que nous souhaitons utiliser, puis nous l'encodons. Le soudage ne fonctionne pas sur l'ITO, nous devons donc utiliser de l'époxy argenté et l'agent de durcissement. Ensuite, nous procédons à une cuisson afin d'éliminer tout l'agent de durcissement utilisé précédemment, ce qui permet au matériau de durcir et de pouvoir être utilisé comme électrode.

À présent que nous avons terminé deux phases, nous allons entamer la troisième phase d'une expérience, qui consiste à réaliser la partie électrochimie. Pour ce faire, nous allons prélever un échantillon et le placer dans notre cellule électrochimique. Après avoir placé l'échantillon dans notre cellule électrochimique, nous allons simplement positionner un joint torique au-dessus.

Cela va isoler la région où aura lieu l'électrochimie, puis nous allons simplement sceller la cellule. J'ai donc placé mon échantillon, auquel est relié mon fil, dans la cellule électrochimique. Maintenant, je suis prêt à utiliser le potentiostat pour appliquer la tension.

Donc, le fil blanc, je vais l'attacher ici à l'électrode de référence, le fil rouge à l'électrode contre-électrode, puis enfin le fil vert que je vais relier à notre électrode de travail. Une fois toutes ces électrodes fixées, je vais simplement ajouter une solution 1 x de tampon phosphate salin ou PBS à la cellule électrochimique elle-même. Pour clarifier ce point, le fonctionnement est le suivant : toute la surface, telle qu'elle est actuellement, est modifiée avec du pxi.

Ainsi, toutes les électrodes, y compris les régions vitreuses environnantes, sont modifiées avec du pxi. Une fois que j'applique la tension partout où l'ITO est présent, c’est-à-dire sur les motifs d'électrodes que nous avons créés, l'îlot de peg va se détacher uniquement de ces surfaces, tandis que les régions environnantes ne seront pas affectées. Par conséquent, nous retirons sélectivement l'îlot de peg de notre substrat.

Je vais maintenant appuyer sur lecture, ce qui démarrera l'application d'une tension de -1,4 volt à notre électrode de travail. Lorsque la tension est appliquée, une modification de la couleur apparaît sur les électrodes. Elle passe de la teinte verte-bleu transparente que nous avions au marron.

Nous soupçonnons qu'une réaction d'oxydation pourrait se produire aux électrodes, provoquant leur brunissement. C'est également l'un des indicateurs que le pxi à la surface a effectivement été retiré de la surface. Et une fois encore, chaque zone présentant une coloration brune correspond à un endroit où l'îlot de peg a été enlevé.

Et les régions de verre environnantes possèdent encore du PXI assemblé dessus. Nous appliquons donc une tension de moins 1,4 watts pendant 60 secondes. Cela permet suffisamment de temps pour éliminer tout le PXI présent sur les électrodes.

Nous pouvons également utiliser cette méthode pour dénuder des électrodes individuellement adressées. Dans ce cas, il y avait trois rangées de cercles qui allaient être dénudées. Nous pouvons sélectionner lesquelles nous voulons dénuder en utilisant les trois électrodes différentes.

Nous avons donc terminé avec succès la troisième partie de notre étude en électrochimie, au cours de laquelle nous avons retiré sélectivement le PG silane de nos électrodes ITO. J'ai effectué un rinçage rapide avec du PBS et de l'eau DI, retiré le fil et placé les échantillons dans des plaques standard à six puits. Nous allons maintenant passer à l'étape suivante, qui consiste à cultiver des cellules sur ces électrodes.

Nous voici maintenant dans la salle de culture tissulaire. Pour la phase finale de l'expérience, nous allons utiliser aujourd'hui des fibroblastes, des cellules 3T3. La concentration utilisée pour ensemencer les cellules se situe entre 0,5 et 1,5 million de cellules par mL.

Après avoir semé les cellules, nous les laissons sur notre échantillon pendant environ 20 minutes. Cela leur permettra suffisamment de temps pour s'attacher aux régions décapées. Nous les placerons donc dans l'incubateur.

Il s'est maintenant écoulé 20 minutes et nous sommes prêts à observer les cellules qui se sont organisées sur les régions décapées de l'ITO, les régions brunes que nous avons vues précédemment, et qui se lient spécifiquement uniquement à ces régions sans s'attacher ailleurs. Ici, vous pouvez voir les régions brunes correspondant aux zones d'ITO dont le pxi a été retiré. Grâce à l'électrochimie, les cellules se sont fixées uniquement sur ces régions brunes et non sur les régions avoisinantes en verre.

Dans cette autre image, nous observons à nouveau du seltz qui s'attache aux régions décapées. Ce sont les régions brunes, mais au-dessus de ces régions brunes, on distingue à peine un motif ITO recouvert de PEG qui n'a pas été enlevé de ce motif ITO, et par conséquent aucune cellule ne s'y est attachée. Bon, c'est tout.

Nous avons terminé le protocole et les cellules présentent un motif sur les électrodes ITO, ce qui correspond exactement à ce que nous voulions. Je viens de vous montrer le contrôle de l'adhésion cellulaire sur des électrodes en oxyde d'indium étain, transparentes optiquement et microfabriquées. Aujourd'hui, je vous ai montré comment créer un motif de fibroblastes THREET trois sur ces électrodes.

Nous avons également utilisé la même procédure pour dessiner des motifs de cellules Hep G deux, de cellules satellites et de cellules primaires de rat. Les techniques actuelles de dessin de motifs cellulaires permettent uniquement l'assemblage de deux types cellulaires sur la surface. La souplesse de cette technique permettra à l'avenir l'assemblage de plusieurs types cellulaires sur la surface, spatialement isolés les uns des autres.

Nous prévoyons d'utiliser cette technique pour isoler spatialement trois types cellulaires hépatiques différents sur le substrat ITO afin de reproduire le microenvironnement in vivo. Ce faisant, nous pouvons isoler spatialement des cellules immatures ou des cellules souches ainsi que des cellules matures et des cellules de soutien. Cela créera un environnement instructif permettant aux cellules immatures de croître et de se différencier.