Cellules Patterning sur des électrodes d'indium optiquement transparents Tin Oxide

Bonjour, je m’appelle Isha. Je suis une étudiante de deuxième année aux cycles supérieurs dans le laboratoire du Dr Zen. Nous sommes ici, au Département de génie biomédical de l’Université de Californie à Davis.

Aujourd’hui, je vais vous montrer le contrôle de Ian sur des électrodes d’oxyde d’indium 10 microfabriquées optiquement transparentes dans l’ingénierie tissulaire et des efforts de régénération ont été faits pour imiter le microenvironnement de l’organe. Afin de créer ce microenvironnement in vitro, il est essentiel d’isoler spatialement et temporellement les cellules sur un substrat. Nous nous intéressons à la conception de surfaces où nous pouvons contrôler l’emplacement de différents types de cellules hépatiques.

Dans l’expérience d’aujourd’hui, nous utiliserons la modification de surface, la microfabrication et l’électrochimie pour former une surface qui peut être commutée d’une cellule non adhésive à une cellule adhésive. La première étape est la photolithographie. Voici un schéma de la façon dont ce processus va être mis en œuvre.

Le bleu est la lumière du verre, le vert est de l’oxyde d’indium 10 qui est recouvert sur la lumière du verre. Tout d’abord, ce que nous allons faire, c’est faire tourner la couche photo rouge montrée ici au-dessus de la lumière en verre revêtue d’oxyde d’indium 10. Ensuite, nous allons passer cela à travers un masque photo à la lumière ultraviolette et les régions exposées seront développées dans une solution en développement.

Les régions ITO qui ne sont pas protégées par la résine photosensible seront supprimées dans l’utilisation informatique. Et enfin, toute la résine photosensible restante sera éliminée dans de l’acétone pour former nos électrodes ITO. Voici le schéma de déroulement des trois étapes restantes.

Tout d’abord, nous allons modifier toute la surface avec du peg cylin. Cela rendra la surface non salissante et aucune cellule ou protéine ne s’y liera. Ensuite, nous allons utiliser l’électrochimie pour absorber spécifiquement la cyline peg des deux électrodes I que nous avons fabriquées plus tôt.

Et enfin, nous allons incuber des fibroblastes sur le dessus de la surface et ils se lieront sélectivement uniquement aux régions de la bandelette. Nous sommes donc maintenant prêts à commencer notre expérience. La première étape concerne la photolithographie, qui va être réalisée dans une salle blanche.

Alors, allons-y et entrons dans la salle blanche. Alors maintenant, nous sommes ici dans notre salle blanche. Avant de commencer notre expérience, nous allons faire cuire nos échantillons enrobés d’oxyde d’indium et d’étain ou d’ITO à 200 °C dans notre four.

De cette façon, nous pouvons déshydrater toutes nos surfaces. Et après l’avoir cuit à 200 ° C, c’est à ce moment-là que nous allons le placer sur notre technologie de spin et appliquer la résine photo. Donc, après avoir déshydraté notre substrat ITO, nous allons le prendre et le placer sur le mandrin de la technologie de spin.

Ce mandrin est juste assez grand pour contenir un quart de lumière en verre. Ensuite, nous allons, nous allons appliquer le vide. Après cela, nous appliquons un ton positif, une résine photo sur le substrat.

Après l’application de la résine photo, nous allons de l’avant et commençons. Cela implique deux étapes. Le premier est l’étalement, et le second est le revêtement par centrifugation dans l’étape d’étalement.

Le mandrin tourne à 800 tr/min, ce qui permet de répartir uniformément la résine photo sur toute la surface. Cependant, la suivante est l’étape de rotation, qui est à 4 000 RPN et à 4 000 RPM, elle forme une couche très fine. Par mince, je veux dire environ un micron.

Si vous séparez le mot photo, résistez, il se transforme en photo et résistez. Il est activé par la lumière. Par conséquent, nous travaillons dans la salle blanche et nous utilisons une lumière filtrée afin que la résistance de notre porte photo ne soit pas activée par la lumière et qu’elle résiste aux actifs, que nous utiliserons plus tard lorsque nous ferons de la gravure.

Nous en avons maintenant terminé avec le revêtement de rotation, la résine photo sur la surface, et nous allons simplement le retirer et passer à l’étape suivante. Ainsi, après avoir cuit l’échantillon pendant une minute et 45 secondes, nous allons le retirer de la plaque chauffante et le déplacer vers notre doublure de masque de canon. Ici, nous prenons un masque dont nous avons besoin, puis nous plaçons le masque sur le dessus de notre substrat afin d’avoir une impression de contact entre notre substrat avec résistance au port et le masque, nous le plaçons avec une plaquette de verre de quatre pouces juste pour lui ajouter du poids.

Et une fois que nous avons terminé, il suffit de remettre l’obturateur en place, puis d’exposer l’échantillon à la lumière UV. Une fois l’exposition terminée, il suffit d’éloigner le couvercle dans l’ordre inverse. Nous sortons notre plaquette de verre, nous sortons notre masque, puis nous retirons notre substrat et le reprenons pour le développement.

Après avoir exposé l’échantillon, nous le plaçons dans une solution de développement. Lorsque l’échantillon a été exposé à la lumière UV, il y avait des ions hydrogène, qui se sont neutralisés avec la base et la solution de révélateur et sont en fait éliminés de la surface. Alors maintenant, vous voulez vous assurer que lorsque vous faites l’échantillon, vous déviez constamment du substrat.

Et lorsque vous faites cela, vous pouvez voir dans environ la première minute ou la première minute et demie, les régions exposées sont en fait développées et retirées de la surface. Mais pour que le développement soit terminé, nous le laissons reposer dans la solution de développement pendant environ cinq minutes. Une fois le développement terminé, nous allons le sortir, nous allons le laver et l’eau puis le sécher à l’aide d’un pistolet à azote.

Une fois que nous avons séché notre échantillon, nous allons le prendre en charge et le visualiser au microscope. Ici, nous regardons l’échantillon au microscope. Nous l’avons simplement sorti après l’avoir développé pendant cinq minutes.

Il y a deux régions que vous pouvez voir ici, une région plus sombre qui est couverte par la résine photo et la région plus claire où la résine photo a été supprimée. En ce qui concerne le masque que nous avons utilisé précédemment, les régions les plus sombres du masque étaient les régions les plus sombres que nous voyons actuellement au microscope, tandis que les régions claires que nous voyons ici étaient transparentes sur le masque. L’un des modèles présentés ici n’est constitué que de réseaux de différentes tailles allant de 500 à 50 microns, tandis que l’autre conception est constituée de cercles de 1000 microns qui sont simplement interconnectés.

Nous avons donc ici un design différent qui a été réalisé en utilisant la même procédure. Ici, nous avons des électrodes adressables individuellement. Ce que je veux dire par là, c’est que différentes régions de l’ITO sont interconnectées et qu’elles peuvent être activées différemment.

Par exemple, ici, les régions circulaires centrales, elles sont connectées à un coussin électrique ici, tandis que les régions rectangulaires les plus extérieures, elles sont connectées à un coussin électrique différent. De cette façon, nous pouvons stimuler ces deux surfaces différentes à des moments différents. Après avoir examiné nos échantillons, l’étape suivante consiste à graver l’échantillon.

Toutes les régions qui ne sont pas protégées par les photos vont être gravées dans une gravure ITO. Avant de faire cela, nous devons nous assurer que nous mettons des vêtements appropriés car la gravure ITO contient des acides. Et maintenant, après avoir enfilé ma blouse de protection contre l’acide, mis mon écran facial, je vais verser un peu de gravure ITO dans un bécher en verre.

La gravure ITO est composée de 20 % de chlorure d’hydrogène, de 5 % d’acide nitrique et le reste est de l’eau DI. Ensuite, apportez mon échantillon et placez-le dans la gravure. Plus tôt au microscope, nous avons vu qu’il y avait certaines régions qui n’étaient pas protégées par des photo-reliefs.

Les acides contenus dans la gravure de l’ITO ont attaqué ces régions et ont provoqué la gravure de l’ITO de ces régions. Au fur et à mesure que l’ITO se dégrade lentement de la surface, il change de couleur. Ici, vous pouvez voir qu’il est passé d’un changement bleuâtre qu’il avait à l’origine à ce changement violacé et qu’il passe maintenant à l’échange jaune.

Le changement de couleur indique que l’ITO est en cours de gravure. Nous voici donc maintenant à 15 minutes. Tout l’ITO, c’est complètement gravé.

Et ce que vous voyez en ce moment, ce sont des photos protégées des régions ITO. Ainsi, une fois la gravure terminée, il reste encore quelques acides à la surface. Pour éliminer ces acides, nous allons le placer dans une solution de carbonate de sodium, qui va neutraliser tout l’acide.

Après avoir neutralisé les acides, nous allons le retirer et le nettoyer avec de l’eau DI, puis le sécher avec l’azote. Nous en avons donc fini avec la gravure à l’acide. Plus d’acide, je suis sorti de ma robe chaude.

Nous allons le retirer, le transférer et le visualiser sous notre microscope. Nous observons donc l’échantillon au microscope. C’est après que nous avons effectué la gravure ITO.

Dans ce cas, les régions les plus sombres sont des régions de verre à partir desquelles ITO a été gravé. Et les régions les plus claires sont des ITO qui sont protégées par une résine photosensible dans ce cas. Encore une fois, il s’agit de réseaux de 500 à 50 microns et dans l’autre cas, nous avons nos cercles interconnectés de milliers de microns chacun.

Nous avons donc regardé au microscope et nous avons vu qu’il y avait des régions de verre et des régions ITO, mais les régions ITO étaient protégées par une résine photosensible. Maintenant, nous devons retirer cette résine photosensible. Donc, tout ce que nous allons faire, c’est prendre notre substrat, le mettre dans de l’acétone, puis le placer dans le sonicate et simplement le sonicate pendant 10 minutes.

Cela garantit que toute la résistance photo enlevée, vous pouvez l’utiliser comme tonalité par elle-même, mais par frappe sonique, qui utilise des ondes sonores pour frapper et qui garantit que la résine photo est correctement éliminée. Après l’avoir sorti de l’air sonique, il est lavé dans de l’eau DI, séché à nouveau dans de l’azote, et maintenant vous pouvez voir clairement les motifs sur le substrat en verre. Ce sont ces motifs qui ont été initialement protégés par la résine photo.

Maintenant que nous avons examiné nos échantillons et trouvé ou créé nos modèles ITO, nous allons commencer notre deuxième phase de l’expérience. Cette phase implique la modification de la surface avec une monocouche auto-assemblée de cycline PEG. Mais avant de faire cela, nous devons nous assurer que la surface est réactive.

Pour ce faire, nous le plaçons dans un nettoyeur plasma. Cela introduit des groupes hydroxyles à la surface et le rend ainsi réactif. Pour ce faire, il suffit de placer notre échantillon dans le nettoyeur plasma, puis d’allumer notre pompe à vide.

Nous allumons l’oxygène, nous allumons l’alimentation principale. Cette puissance est utilisée pour convertir l’oxygène gazeux en plasma, qui est ensuite introduit et forme ainsi les sillons hydroxyles. Et une fois que nous allumons l’alimentation, nous allons de l’avant et appuyons sur le bouton de démarrage.

Une fois le processus terminé, nous sortons notre substrat, le stockons dans un plat et sortons de la salle blanche et passons à l’étape suivante. Alors maintenant que nous sommes sortis de la salle blanche et que nous avons terminé notre motif idéal, nous allons modifier la surface que nous venons de modeler avec du polyéthylène glycol, du CYLIN ou du PEG Cylin. Il est essentiel de savoir que le peg cylin est réactif à l’humidité.

Par conséquent, tout ce que nous utilisons du bois doit être exempt d’humidité. La verrerie que nous avons utilisée ici, les plats pour animaux de compagnie, ils ont été cuits à cent °C pendant la nuit. Et le thon que nous allons utiliser comme solvant est également anhydre.

Il ne contient pas d’humidité. Alors maintenant, je vais verser du tolu anhydre dans ces deux haut-parleurs en verre, dont l’un contient notre échantillon. Maintenant, nous devons utiliser deux boîtes de Pétri car l’une d’entre elles est l’endroit où nous allons apporter la modification.

Et l’autre que nous utiliserons plus tard, lorsque la modification sera terminée, pour laver notre substrat. Donc, après avoir mis nos plats à pizza en verre, je vais juste le prendre en charge et le transférer dans notre sas ici dans la boîte à gants. Après avoir fermé la chambre du sas, nous allons introduire de l’azote dans la chambre.

Maintenant, la chambre principale ici est déjà remplie d’azote. Par conséquent, nous ne voulons pas ouvrir cette chambre à moins qu’elle ne soit remplie d’azote. Une fois que les deux chambres sont à l’azote, nous allons transférer tous nos échantillons avec une pipette.

Nous allons avoir notre cheville et une pince à épiler que nous allons utiliser plus tard pour transférer les échantillons. Nous allons donc mettre nos gants, ouvrir la chambre ici et retirer lentement et soigneusement tout ce que nous avons dans notre sas et le placer dans la chambre principale. Il s’agit de la boîte de Pétri avec notre substrat et de la boîte de Pétri uniquement avec du toluène que nous allons utiliser pour le lavage.

Le pxi présent a été emballé sous azote et vous ne devez pas ouvrir cette bouteille à moins que vous ne soyez dans un environnement d’azote. Par conséquent, une fois que vous souhaitez retirer l’échantillon, vous le remettez dans le sac. Donc, vous retirez votre cylin et la concentration que nous allons utiliser est de 2 % de toluène.

Alors vous le sortez, vous le mettez dans le haut, nous le mélangeons. Eh bien, aussi, chambrez et assurez-vous qu’il est bien mélangé, puis laissez l’échantillon incuber à Toin pendant deux heures. Donc, maintenant que deux heures se sont écoulées, que notre échantillon est dans Pxi, nous allons retirer l’échantillon et le transférer dans une solution fraîche où nous allons brièvement le laver, le faire pivoter et le déplacer vers notre chambre de sas.

Une fois qu’il est dans notre sas, nous allons simplement ouvrir notre chambre et retirer notre surface modifiée et nous pouvons conduire à l’aide du pistolet à azote. Nous le plaçons à nouveau dans une boîte de Pétri propre et sèche et le plaçons dans un four à cent degrés C pendant deux heures de plus. Alors maintenant que les échantillons ont été cuits au four à cent °C pendant deux heures, nous allons prendre et attacher nos fils aux électrodes que nous avons préparées.

Pour ce faire, nous fabriquons un mélange individuel d’époxy d’argent et d’un agent de durcissement. Il s’agit donc de l’époxy argenté, et maintenant nous y ajoutons la même quantité de durcissement. Nous voulons bien le mélanger, puis nous allons le prendre et l’utiliser pour attacher nos fils.

Nous plaçons donc notre fil sur les électrodes que nous voulons utiliser, puis nous le codons. La soudure ne fonctionne pas sur l’ITO, nous devons donc utiliser de l’époxy d’argent et l’agent de durcissement. Ensuite, nous cuisons de manière à ce que tout l’agent de durcissement que nous avons utilisé précédemment soit éliminé et qu’il durcisse et que nous puissions l’utiliser comme électrode.

Maintenant que nous avons terminé deux phases, nous allons commencer la troisième phase d’une expérience, qui consiste à effectuer la partie électrochimie. Pour ce faire, nous allons prélever un échantillon et le placer dans notre cellule électrochimique. Après l’avoir placé dans notre cellule électrochimique, nous allons simplement placer un joint torique dessus.

Cela va isoler la région où l’électrochimie va se produire, puis nous allons simplement sceller la cellule. J’ai donc placé mon échantillon avec mon fil attaché dans la cellule électrochimique. Maintenant, je suis prêt à utiliser la statistique potentielle pour appliquer la tension.

Donc, le fil blanc, je vais le fixer ici même à l’électrode de référence, le rouge, la contre-électrode, puis enfin le vert que je vais attacher à notre électrode de travail. Une fois que toutes ces électrodes sont fixées, je vais simplement ajouter une solution x de phosphate phosphate tampon salin ou PBS à l’électrochimique lui-même. Maintenant, juste pour clarifier cela, la façon dont cela va fonctionner est que toute la surface est modifiée avec pxi.

Ainsi, toutes les électrodes, y compris les régions de verre environnantes, sont modifiées avec pxi. Une fois que j’applique la tension partout, là où l’ITO est présent, c’est-à-dire les conceptions d’électrodes que nous avons faites, l’îlot de chevilles ne se détachera que de ces surfaces et rien ne sera affecté dans les régions environnantes. Par conséquent, nous retirons sélectivement l’îlot de chevilles de notre substrat.

Alors maintenant, je vais appuyer sur play et cela démarrera et appliquera une tension de moins 1,4 volt à notre électrode de travail. Lorsque la tension est appliquée, il y a un changement de couleur que vous pouvez voir sur les électrodes. Il change du bleu verdâtre transparent que nous devions brunir.

Nous soupçonnons qu’il pourrait y avoir une réaction d’oxydation qui pourrait se produire au niveau des électrodes et qui les fait brunir. C’est aussi l’un des indicateurs que le pxi de la surface a effectivement été retiré de la surface. Et encore une fois, partout où vous voyez du brun, c’est là que l’île de cheville a été retirée.

Et les régions vitrées environnantes ont toujours du PXI assemblé dessus. Nous appliquons donc une tension de moins 1,4 watts pendant 60 secondes. Cela donne suffisamment de temps pour retirer tous les pxi qui étaient présents sur les électrodes.

Nous pouvons également utiliser cette méthode pour décaper les électrodes qui sont adressées individuellement. Dans ce cas, il y avait trois rangées de cercles qui allaient être dénudés. Nous pouvons sélectionner ce que nous voulons dénuder en utilisant les trois électrodes différentes.

Nous avons donc terminé avec succès notre troisième partie de l’électrochimie où nous avons éliminé sélectivement le silage PG de nos électrodes ITO. Je l’ai lavé brièvement, lavé avec de l’eau PBS et DI, j’ai retiré le fil et j’ai placé les échantillons dans des plaques à six puits. Maintenant, nous allons passer à autre chose et cultiver des cellules sur ces électrodes.

Nous voici donc maintenant dans la salle de culture tissulaire. Pour la phase finale de l’expérience, nous allons utiliser des fibroblastes aujourd’hui, trois cellules T. La concentration que nous utilisons pour ensemencer les cellules se situe entre 0,5 et 1,5 million de cellules par mil.

Après avoir ensemencé les cellules, nous les laissons sur notre échantillon pendant environ 20 minutes. Cela lui donnerait amplement le temps de l’attacher aux régions dénudées. Nous allons donc le placer dans l’incubateur.

Cela fait maintenant 20 minutes et nous sommes prêts à examiner les cellules qui ont des motifs sur les régions dénudées d’ITO, les régions brunes que nous avons vues plus tôt, et elles ne se lient spécifiquement qu’à ces régions et ne se fixent nulle part en dehors de ces régions. Ici, vous pouvez voir que les régions brunes étaient des régions ITO qui ont été dépouillées de pxi. En utilisant l’électrochimie, les cellules ne se sont attachées qu’à ces régions brunes et non aux régions de verre environnantes.

Dans cette autre image, une fois de plus, nous voyons de l’eau de Seltz se fixer aux régions dénudées. Ce sont les régions brunes, mais au-dessus de ces régions brunes, vous pouvez à peine voir et la conception ITO PEG n’a pas été supprimée de cette conception ITO, donc aucune cellule n’y est attachée. D’accord, c’est tout.

Nous en avons terminé avec le protocole et les cellules ont un motif sur les électrodes ITO et c’est exactement ce que nous voulions. Je viens de vous montrer le contrôle de l’adhésion cellulaire sur des électrodes d’oxyde d’indium 10 micro-fabriquées optiquement transparentes. Aujourd’hui, je vous ai montré comment modeler trois fibroblastes sur ces électrodes.

Nous avons également utilisé la même procédure pour modéliser les cellules de l’hépatite G sur deux cellules, les cellules satellites et les cellules primaires du rat. Les techniques actuelles de structuration cellulaire ne permettent que l’assemblage de deux types de cellules à la surface. La flexibilité de cette technique permettra l’assemblage de plusieurs types de cellules à la surface qui seront spatialement isolées à l’avenir.

Nous prévoyons d’utiliser cette technique pour isoler spatialement trois types de cellules hépatiques différents sur le substrat ITO afin d’imiter le microenvironnement in vivo. Ce faisant, nous pouvons isoler spatialement des cellules immatures ou des cellules souches avec des cellules matures et des cellules de soutien. Cela créera un environnement instructif pour la croissance et la différenciation des cellules immatures.