Rejet de fond de fluorescence de résonance et spontanée microspectroscopie Raman

L'objectif de cette procédure est de concevoir un dispositif optique complet pour la marche qui transmette la lumière diffusée Raman tout en rejetant les signaux fluorescents. Cela est réalisé en premier lieu en excitant et en polarisant la diffusion Raman. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer le faisceau pompe afin de faire fonctionner la porte.

Troisièmement, la pompe, le faisceau et les impulsions doivent être ajustées de manière à ce qu'elles se superposent. La dernière étape de la procédure consiste à acquérir des spectres avec une fenêtre temporelle. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant une quantification et une classification biochimiques grâce à l'analyse des signaux Raman avec des rapports signal sur bruit élevés.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la suppression logicielle du fond de fluorescence, réside dans la réduction significative du bruit de grenaille produit par la fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans les domaines biologique et biomédical, telles que la caractérisation non invasive de la composition chimique de fluorogènes endogènes dans les cellules bactériennes et les tissus, ou la compréhension des processus cellulaires et des maladies telles que le cancer, les affections vasculaires ou neurodégénératives, grâce à l'utilisation de marqueurs intrinsèques. Cette méthode pourrait également contribuer au développement de nouvelles sondes pouvant être utilisées à la fois comme marqueurs fluorescents et Raman, ainsi qu'à la conception de capteurs médicaux non invasifs destinés à l'analyse sanguine.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les systèmes biologiques en ingénierie biomédicale, elle peut également être appliquée à d'autres domaines tels que la recherche sur les biocarburants ou l'industrie des télécommunications. Les échantillons biologiques sont généralement placés sur une lame de couverture d'épaisseur numéro un montée dans une chambre à cellules ATO Fluor.

Des échantillons liquides, en particulier ceux qui sont toxiques pour l'humain, sont placés dans un petit flacon en verre dont l'ouverture est scellée par une lame de couverture fixée à l'aide d'une colle époxy silicone. Ce flacon est ensuite inversé pour la mesure. Placez les échantillons sur la platine secondaire montée au-dessus de la platine du microscope, laquelle dispose d'un contrôle de mise au point indépendant. Afin d'obtenir des spectres Raman résolus en temps, il est tout d'abord nécessaire de préparer correctement le faisceau d'excitation. Commencez avec la lumière émise par un laser pulsé accordable en saphir GI de 2,4 watt. Chaque impulsion de la trame d'impulsions à 80 mégahertz doit posséder une énergie de 30 nanojoules, une largeur temporelle de 140 femtosecondes et un spectre centré à 808 nanomètres avec une largeur spectrale d'environ six nanomètres. Pour éviter que les réflexions arrière ne réintègrent la cavité laser, faites passer la lumière à travers un isolateur de Faraday. Placez une lame demi-onde avant l'isolateur de Faraday afin de permettre un réglage continu de la puissance totale envoyée dans le système.

Étant donné que six nanomètres représentent une largeur de bande trop importante pour résoudre la plupart des modes Raman, le faisceau est envoyé à travers un filtre passe-bande très étroit. Envoyez-le à 808 nanomètres. Ensuite, utilisez un doublet aromatique pour focaliser la lumière sur un borate de baryum béta de cinq millimètres.

Huit cristaux pour la moitié de la longueur d'onde, allant de 808 nanomètres à 404 nanomètres. Placer le cristal de baryum béta (BBO) dans un support doté de commandes d'inclinaison et de basculement monté sur une platine de translation. Afin de maximiser l'efficacité de la conversion de longueur d'onde, le cristal doit être positionné de manière précisément symétrique par rapport au foyer du doublet, et son axe cristallin doit être aligné avec la polarisation du faisceau incident.

Étant donné que l'efficacité de la conversion de longueur d'onde dépend de la polarisation, un contrôle précis de la quantité de lumière envoyée vers l'échantillon peut être obtenu en plaçant une seconde lame demi-onde après l'isolateur de Faraday. En tournant cette lame, l'intensité de la lumière dirigée vers l'échantillon peut être ajustée indépendamment de l'intensité du faisceau de pompe. La lumière dont la longueur d'onde a été convertie est ensuite recollimatée par un second doublet aromatique choisi de manière à ce que le faisceau d'excitation soit suffisamment large pour remplir l'ouverture arrière de l'objectif du microscope, puis est dirigée vers un microscope inversé à l'aide de deux miroirs de guidage.

L'objectif du microscope définit l'axe optique afin d'aligner le faisceau d'excitation sur cet axe. Placer un miroir dans le plan de l'échantillon du microscope. Les deux miroirs de guidage sont ensuite ajustés itérativement tout en observant le faisceau laser réfléchi en retour sur une caméra CCD reliée au port d'imagerie du microscope.

En supposant que l'image sur la caméra soit centrée sur le champ de vision du microscope, le faisceau est aligné sur l'axe. Lorsque le point focal est centré sur la puce du microscope et que la translation de l'objectif le long de l'axe Z ne change pas. Le point central de la diffusion Raman défocusée se produit lorsque l'échantillon est placé dans le plan de l'échantillon et est irradié avec de la lumière laser.

Un filtre dichroïque placé sous l'objectif du microscope sépare les ondes décalées. La lumière diffusée Raman est séparée du faisceau d'excitation, dirigeant la lumière diffusée Raman vers la sortie latérale du microscope. Le microscope a été modifié afin d'éliminer toutes les lentilles situées dans ce trajet, de sorte que la lumière du signal émerge du microscope recouvert, car le faisceau de signal sortant du microscope est plus large que l'ouverture claire du joint.

Des polariseurs de Thompson, ainsi qu'un télescope de 0,47 fois constitué de deux doublets aromatiques, sont utilisés pour rétrécir le faisceau. La lumière du signal est ensuite polarisée par un polariseur de Thompson orienté à zéro degré par rapport à la verticale dans le repère du laboratoire, puis dirigée vers un miroir dichroïque où elle est recombinée avec le faisceau pompe. Le faisceau pompe est envoyé dans une ligne à retard composée de deux miroirs placés perpendiculairement l'un par rapport à l'autre, tous deux fixés sur une platine de translation linéaire qui peut être ajustée afin d'assurer un recouvrement temporel des impulsions pompe et signal.

Après la ligne à retard, le faisceau traverse une lame demi-onde et un polariseur orientés à 45 degrés par rapport à la verticale dans le repère du laboratoire. Cela garantit l'état de polarisation adéquat du faisceau pompe lorsqu'il atteint le milieu non linéaire. La lumière est ensuite réfléchie par deux miroirs de guidage, dont l'un est équipé d'un contrôle piézoélectrique, qui doit être utilisé pour ajuster finalement la position du faisceau pompe afin qu'il coïncide spatialement avec le faisceau signal.

Pour obtenir ce recouvrement, observez les faisceaux pompe et signal en deux endroits, l'un proche et l'autre éloigné du miroir dichroïque où les faisceaux sont combinés, en utilisant le premier miroir de guidage pour superposer les deux faisceaux au point proche et le miroir piézo pour superposer les faisceaux au point éloigné, ce qui permet de rendre le faisceau pompe exactement colinéaire au faisceau signal. Ensuite, le système de collimation et de collecte doit être configuré de manière à maximiser le signal collecté en fonction du temps. Pour ce faire, les faisceaux pompe et signal sont d'abord transmis à travers un filtre dicroïque ayant une densité optique (OD) de six à 404 nanomètres, afin d'empêcher toute lumière d'excitation résiduelle d'exciter ou de se diffuser dans le milieu non linéaire.

Les faisceaux pompe et signal sont ensuite focalisés par un doublet aromatique dans une cuve en quartz d'une longueur de trajet d'un centimètre contenant le matériau non linéaire ; tout matériau non linéaire possédant un indice non linéaire suffisamment élevé et une réponse temporelle suffisamment courte peut être utilisé ici. Pour ces expériences, nous utilisons le disulfure de carbone. La lumière est ensuite recollimatée par un second doublet dont la distance focale est identique à celle du premier.

Les faisceaux traversent ensuite un analyseur de gland Thompson monté sur un support rotatif, puis un ensemble de filtres d'absorption et d'interférence dont la densité optique combinée est de 10 à 808 nanomètres. Enfin, la lumière du signal est focalisée par un doublet aromatique dans une fibre optique multimode de 50 microns, la fibre étant montée sur un dispositif permettant des translations selon les axes X, Y et Z. La fibre est ensuite couplée à un spectrographe d'imagerie commercial équipé d'une caméra CCD afin d'aligner le système de collecte pour maximiser le signal recueilli, de régler l'analyseur à zéro degré et de placer un échantillon-test de toluène dans le plan de l'échantillon. Optimisez le signal Raman recueilli en ajustant les commandes X, Y et Z du support de fibre afin de garantir un recouvrement spatial et temporel adéquat des faisceaux pompe et signal. Placez un miroir dans le plan de l'échantillon du microscope.

Ensuite, retirez le filtre de 404 nanomètres du système. Tournez l'analyseur à 90 degrés afin que le faisceau rétro-réfléchi de 404 nanomètres soit dirigé vers le spectrographe, en ajustant l'intensité de manière à ne pas saturer la caméra. Maintenant, avec le faisceau pompe éteint, tournez l'analyseur pour minimiser le signal transmis de 404 nanomètres.

Ensuite, réactivez le faisceau de pompe et ajustez lentement le dispositif de retard jusqu'à ce que la transmission de la lumière à 404 nanomètres commence à augmenter. Puis, de manière itérative, ajustez le dispositif de retard, le miroir piézoélectrique et les commandes X, Y et Z de la fibre pour maximiser le signal, car le faisceau rétro-réfléchi à 404 nanomètres et la lumière diffusée Raman peuvent emprunter des trajets légèrement différents à travers le système. Effectuez les réglages finaux en plaçant un échantillon fortement diffusant Raman, tel que le toluène, sur la platine d'échantillonnage, en remplaçant le filtre Raman et en affinant légèrement l'alignement en modifiant le dispositif de retard, le miroir piézoélectrique, ainsi que les commandes X, Y et Z de la fibre afin d'optimiser le signal Raman.

Le système est désormais prêt à collecter des spectres. Cela nécessite d'abord l'acquisition de plusieurs courbes de fond afin de corriger les artefacts du système. Tout d'abord, avec l'analyseur réglé à zéro degré, le faisceau d'excitation activé et le faisceau pompe désactivé.

Obtenez un spectre non filtré, puis réglez l'analyseur à 90 degrés et enregistrez un spectre de fond représentant la lumière parasite qui traverse les polariseurs. Ensuite, avec l'analyseur restant à 90 degrés, éteignez le faisceau Raman et allumez le faisceau de pompe. Enregistrez un second spectre de fond représentant la quantité de lumière de pompe qui traverse les filtres dichroïques.

Enfin, avec tous les lasers éteints, enregistrez un spectre sombre de référence représentant le niveau de courant d'obscurité de la caméra et de l'électronique. Ensuite, allumez tous les faisceaux et enregistrez un spectre de déclenchement. Pour obtenir le spectre réel correspondant uniquement à la lumière passant par la porte, il faut soustraire de ce spectre de déclenchement les deux spectres de fond et le spectre sombre.

Ici, nous observons un schéma du système ondulé. Le trajet du faisceau pompe est représenté par une ligne rouge continue, tandis que le trajet de la génération de seconde harmonique (SHG) est représenté par une ligne bleu marine continue. Le trajet où la diffusion Raman et la fluorescence se superposent est indiqué en vert.

Alors que le trajet où la fluorescence a été temporairement filtrée est indiqué en jaune. Ici, nous observons les spectres bruts de la coumarine dissoute dans l'huile à immersion. La courbe rouge montre le spectre obtenu avec la porte maintenue ouverte, tandis que la courbe noire montre le spectre obtenu avec l'analyseur aligné pour une transmission minimale et un faisceau pompe appliqué.

La courbe bleue montre le spectre obtenu avec l'analyseur aligné pour une transmission minimale et sans faisceau pompe appliqué, et la courbe verte montre le spectre obtenu avec uniquement le faisceau pompe appliqué. Tous les spectres ont été lissés à l'aide d'un filtre KY gole d'ordre trois sur 11 points. Les lignes pointillées magenta indiquent la région spectrale affichée dans le graphique suivant.

Ici, nous observons les spectres de la coumarine dissoute dans de l'huile d'immersion après soustraction du fond de fluorescence. La courbe rouge correspond au spectre obtenu avec la porte ouverte, et la courbe bleue représente le spectre enregistré en mode porté. Le spectre en mode porté montre clairement le pic superposé à haut nombre d'onde, caractéristique des huiles.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que le laser doit d'abord disposer d'une énergie d'impulsion suffisante pour exciter le ga, et que le système exige un recouvrement spatial et temporel précis des deux impulsions. Après avoir visionné cette vidéo et lu le protocole joint, vous devriez bien comprendre comment séparer le faisceau laser en un faisceau d'excitation et un faisceau probe, ainsi que la manière de superposer ces deux faisceaux, à la fois spatialement et temporellement.

Comment enregistrer un signal Raman à l'aide d'un spectrographe et de C, c, D, ainsi que la manière de visualiser et d'analyser le signal Raman. N'oubliez pas que le travail avec des lasers peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de lunettes de protection laser doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure. Des règles de sécurité supplémentaires s'appliquent à l'utilisation du matériau non linéaire et à l'utilisation de votre échantillon spécifique.