Rejet de fond de fluorescence de résonance et spontanée microspectroscopie Raman

Le but de cette procédure est de construire une démarche entièrement optique qui laisse passer la lumière diffusée Raman tout en rejetant les signaux fluorescents. Ceci est accompli en excitant et en polarisant d’abord la diffusion Raman. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer le faisceau de la pompe pour faire fonctionner la vanne.

Troisièmement, la pompe, le vérin et les impulsions doivent être ajustés de manière à ce qu’ils se chevauchent. La dernière étape de la procédure consiste à acquérir des spectres temporels. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent une quantification et une classification biochimiques par l’analyse des signaux de ramen avec des rapports signal/bruit élevés.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la suppression logicielle du fond de fluorescence, est que le bruit de tir produit par la fluorescence est considérablement réduit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines biologiques et biomédicaux, telles que la caractérisation non invasive de la composition chimique du fluor endogène dans les cellules et les tissus bactériens, la compréhension des processus cellulaires et des maladies telles que le cancer, les maladies vasculaires ou neurodégénératives à l’aide de marqueurs intrinsèques. Cette méthode peut également aider au développement de nouvelles sondes qui pourraient être utilisées à la fois comme marqueurs de fluorescence et de RAM, ainsi que pour des capteurs médicaux non invasifs pour l’analyse du sang.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des systèmes biologiques pour l’ingénierie biomédicale. Il peut également être appliqué à d’autres domaines tels que les biocarburants, la recherche ou l’industrie des télécommunications. Les échantillons biologiques sont généralement placés sur une lamelle d’épaisseur numéro un montée dans une chambre cellulaire ATO Fluor.

Les échantillons liquides, en particulier ceux toxiques pour l’homme, sont placés dans une petite bouteille en verre avec une lamelle cimentée à l’ouverture au moyen de silicone époxy, qui est ensuite inversé pour la mesure, placez les échantillons sur la platine secondaire montée au-dessus de la platine du microscope qui a sa propre commande de mise au point indépendante afin de prendre des spectres de ramen à fonction temporelle, Tout d’abord, le faisceau d’excitation doit être correctement préparé. Commencez par la lumière émergeant d’un laser saphir GI pulsé accordable de 2,4 watts. Chaque impulsion dans le train d’impulsions de 80 mégahertz doit avoir une énergie de 30 nanojoules, une largeur temporelle de 140 femtosecondes et un spectre centré à 808 nanomètres avec une bande passante spectrale d’environ six nanomètres pour empêcher les rétroréflexions de rentrer dans la cavité laser, la lumière doit passer à travers un emplacement d’isolateur de Faraday, une plaque d’une demi-onde avant l’isolateur de Faraday pour permettre un réglage continu de la puissance totale envoyée dans la cavité laser. système.

Parce que six nanomètres est une bande passante trop large pour résoudre la plupart des modes ramen, le faisceau est envoyé à travers un filtre passe-bande très étroit. Envoyez-le à 808 nanomètres. Ensuite, utilisez un doublet aromatique pour concentrer la lumière sur un alésage de baryum bêta de cinq millimètres.

Huit cristaux à la moitié de la longueur d’onde de 808 nanomètres à 404 nanomètres. Placez le cristal de bate de baryum bêta dans une monture avec des commandes d’embout et d’inclinaison montées sur une platine de translation. Pour maximiser l’efficacité de la conversion de longueur d’onde, le cristal doit être placé précisément symétriquement par rapport au foyer du doublet et avec son axe cristallin aligné sur la polarisation du faisceau entrant.

Étant donné que l’efficacité de la conversion de longueur d’onde dépend de la polarisation, le contrôle de la quantité de lumière envoyée à l’échantillon peut être obtenu en plaçant une deuxième demi-plaque d’onde après l’isolateur de Faraday. En faisant pivoter cette plaque d’onde, l’intensité de la lumière envoyée à l’échantillon peut être ajustée indépendamment de l’intensité envoyée dans le faisceau de la pompe. La lumière convertie en longueur d’onde est ensuite recollimatée par un second doublet aromatique choisi de telle sorte que le faisceau d’excitation soit suffisamment grand pour remplir l’ouverture arrière de l’objectif du microscope et dirigé vers un microscope inversé au moyen de deux miroirs directeurs.

L’objectif du microscope définit l’axe optique permettant d’aligner le faisceau d’excitation sur cet axe. Placez un miroir dans le plan d’échantillonnage du microscope. Les deux rétroviseurs de direction sont ensuite réglés de manière itérative tout en observant le faisceau laser réfléchi par l’arrière sur une caméra CCD fixée au port d’imagerie du microscope.

En supposant que l’image sur la caméra est centrée sur le champ de vision du microscope, le faisceau est dans l’axe. Lorsque le point focal est centré sur la puce du microscope et que la translation de l’objectif le long de l’axe Z ne change pas. Le point central de la diffusion des ramen du faisceau défocalisé se produit lorsque l’échantillon est placé dans le plan de l’échantillon et est irradié par une lumière laser.

Un filtre dichroïque placé sous l’objectif du microscope sépare l’onde décalée. Les ramen diffusent la lumière du faisceau d’excitation en dirigeant la lumière diffusée des ramen vers l’orifice latéral du microscope. Le microscope a été modifié pour supprimer toutes les lentilles se trouvant dans ce trajet, de sorte que la lumière de signal émerge du revêtement du microscope car le faisceau de signal sortant du microscope est plus grand que l’ouverture libre de la presse-étoupe.

Les polariseurs Thompson, un télescope de 0,47 fois construit de deux doublets aromatiques, sont utilisés pour réduire le faisceau. Le signal lumineux est ensuite polarisé par un polariseur Thompson orienté à zéro degré par rapport à la verticale dans le cadre du laboratoire et dirigé vers un miroir dichroïque où il est recombiné avec le faisceau de la pompe. Le faisceau de la pompe est envoyé dans une ligne à retard composée de deux miroirs perpendiculaires l’un à l’autre, tous deux placés sur une platine de translation linéaire qui peut être réglée pour assurer le chevauchement temporel des impulsions de la pompe et du signal.

Après la ligne à retard, le faisceau est envoyé à travers une plaque à mi-chemin et un polariseur orienté à 45 degrés par rapport à la verticale dans le cadre du laboratoire. Cela garantit le bon état de polarisation du faisceau de la pompe lorsqu’il atteint le milieu non linéaire. La lumière est ensuite réfléchie par deux rétroviseurs de direction, l’un avec des commandes piézoélectriques, qui doivent être utilisés pour ajuster enfin la position du faisceau de la pompe de manière à ce qu’il chevauche spatialement le faisceau de signal.

Pour obtenir ce chevauchement, observez les faisceaux de pompe et de signal à deux endroits, l’un proche et l’autre éloigné du miroir dichroïque où les faisceaux sont combinés en utilisant le premier miroir directeur pour chevaucher les deux faisceaux au point proche et le miroir pizo pour chevaucher les faisceaux au point éloigné, le faisceau de la pompe peut être fait exactement coaligné avec les faisceaux de signal. Ensuite, le carton ondulé et le système de collecte doivent être configurés pour maximiser le signal temporel collecté. Pour ce faire, la pompe et les faisceaux de signal sont d’abord passés à travers un filtre diique qui a un diamètre extérieur de six à 404 nanomètres pour empêcher toute lumière d’excitation résiduelle d’exciter et de se diffuser dans le milieu non linéaire.

La pompe et les faisceaux de signal sont ensuite focalisés par un doublet aromatique dans un quartz d’une longueur d’un centimètre contenant le matériau non linéaire, tout matériau non linéaire, ayant un indice non linéaire suffisamment élevé et une réponse temporelle suffisamment courte peut être utilisé. Ici. Pour ces expériences, nous utilisons du sulfure de carbone. La lumière est ensuite recollimatée par un second doublet de distance focale identique au premier.

Les faisceaux sont ensuite passés à travers un analyseur de presse-étoupe Thompson sur une monture rotative, puis à travers un ensemble de filtres d’absorption et d’interférence qui, combinés, ont un diamètre extérieur de 10 à 808 nanomètres. Enfin, la lumière de signal est focalisée par un doublet aromatique dans une fibre optique multimode de 50 microns, où la fibre est montée dans un étage qui permet la traduction en X, Y et Z. La fibre est ensuite couplée à un spectrographe imageur commercial avec une caméra CCD attachée pour aligner le système de collecte afin de maximiser le signal collecté, réglez l’analyseur à zéro degré et placez un échantillon de test de toluène dans le plan de l’échantillon, optimisez le signal Raman collecté en ajustant les commandes X, Y et Z de la monture de fibre pour assurer un chevauchement spatial et temporel correct de la pompe et des faisceaux de signaux. Placez un miroir dans le plan d’échantillonnage du microscope.

Retirez ensuite le filtre nanométrique 404 du système. Faites pivoter l’analyseur à 90 degrés de sorte que le faisceau rétroréfléchi de 404 nanomètres soit envoyé au spectrographe avec l’intensité ajustée de manière à ne pas saturer la caméra. Maintenant, avec le faisceau de la pompe éteint, tournez l’analyseur pour minimiser le signal de 404 nanomètres transmis.

Ensuite, rallumez le faisceau de la pompe et ajustez lentement l’étape de retard jusqu’à ce que la transmission de la lumière nanométrique de 404 commence à augmenter. Ensuite, tournez itérativement l’étage de retard, le miroir piézoélectrique et les commandes X, y et Z de la fibre pour maximiser le signal, car le faisceau rétro-réfléchi de 404 nanomètres et la lumière diffusée Raman peuvent prendre des chemins légèrement différents à travers le système. Effectuez les derniers ajustements en plaçant un diffuseur Raman puissant tel que le toluène sur l’étage d’échantillonnage, en remplaçant le filtre Raman et en modifiant légèrement l’alignement en changeant le miroir électrique pizo de l’étage de retard et les commandes X, Y et Z de la fibre pour optimiser le signal Raman.

Le système est maintenant prêt à collecter des spectres. Cela nécessite d’abord l’acquisition de plusieurs courbes d’arrière-plan pour corriger les artefacts du système. Tout d’abord, avec l’analyseur réglé à zéro degré, le faisceau d’excitation allumé et le faisceau de pompe éteint.

Obtenez un spectre non spécifié, puis réglez l’analyseur à 90 degrés et collectez un spectre de fond représentant la lumière parasite s’échappant à travers les polariseurs. Ensuite, avec l’analyseur restant à 90 degrés, éteignez le faisceau de ramen et allumez le faisceau de pompe. Prélevez un deuxième spectre de fond représentant la quantité de lumière de la pompe qui s’échappe à travers les filtres dichroïques.

Enfin, avec tous les lasers éteints, collectez un spectre sombre de base représentant le niveau de courant d’obscurité de la caméra et de l’électronique. Enfin, allumez tous les faisceaux et collectez un spectre fermé. Pour obtenir le vrai spectre de la lumière à travers la porte, les deux spectres de fond et le spectre sombre doivent être soustraits de ce spectre porte.

Ici, nous voyons un schéma du système d’ondulation. La trajectoire du faisceau de la pompe est représentée par une ligne rouge continue, tandis que la trajectoire du SHG est représentée par une ligne marine continue. Le chemin où les ramen et la fluorescence se chevauchent est indiqué en vert.

Alors que le chemin où la fluorescence a été temporairement filtrée est indiqué en jaune. Ici, nous voyons les spectres bruts de coumarine dissoute dans de l’huile d’immersion. La courbe rouge montre le spectre pris avec la porte maintenue ouverte et la courbe noire montre le spectre pris avec l’analyseur aligné pour une transmission minimale et un faisceau de pompe appliqué.

La courbe bleue montre le spectre prélevé avec l’analyseur aligné pour une transmission minimale et aucun faisceau de pompe appliqué, et la courbe verte montre le spectre pris avec uniquement le faisceau de pompe appliqué. Tous les spectres ont été lisses avec un filtre KY gole de troisième ordre à 11 points. Les lignes magenta pointillées indiquent la région spectrale illustrée dans le graphique suivant.

Ici, nous voyons des spectres de coumarine dissoute dans l’huile d’immersion après soustraction du fond de fluorescence. La courbe rouge est le spectre avec la porte maintenue ouverte, et la courbe bleue est le spectre fermé. Le spectre à portes montre clairement le nombre d’onde élevé alambiqué, pic caractéristique des huiles.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que le laser doit d’abord avoir suffisamment d’énergie d’impulsion pour piloter le ga, et que le système nécessite un chevauchement spatial et temporel exquis des deux impulsions. Après avoir regardé cette vidéo et lu le protocole ci-joint, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de séparer le faisceau laser en un faisceau d’excitation et de courbe. Comment superposer ces deux faisceaux, à la fois spatialement et temporellement.

Comment enregistrer un signal ramen via un spectrographe et C, c, D, et aussi comment visualiser et analyser le signal ramen. N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de lunettes laser doivent toujours être prises lors de cette procédure. Des règles de sécurité supplémentaires s’appliquent pour l’utilisation du matériau non linéaire et pour l’utilisation de votre échantillon spécifique.