Name: Une procédure de 1,5 heure pour lidentification des Enterococcus Espèces directement à partir dhémocultures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Apprenez une méthode rapide d'identification des espèces d'Enterococcus à partir d'hémocultures positives par hybridation in situ fluorescente à acide nucléique peptidique. Ce protocole PNA FISH permet un diagnostic rapide et spécifique pour la prise en charge de la sepsis.

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Des études ont été parrainées par AdvanDx.

1. Prélèvement et préparation <ol><li> Recueillir le sang veineux de patients soupçonnés d'infection et mis dans deux BACTEC (BD, Sparks, MD) flacons d'hémoculture, une aérobie et anaérobie une, ensemble comprenant un ensemble d'hémoculture. </li><li> Placez les bouteilles dans le BACTEC 9240 l'instrument à 35 ° C. </li><li> Incuber tant que l'instrument est déclenchée une alarme en raison de la croissance des organismes dans le flacon d'hémoculture. </li><li> Enlever la bouteille de l'instrument de la culture du sang. </li></ol> 2. Préparation des réactifs avant la coloration <ol><li> Préparer la solution de lavage en ajoutant 4 ml de solution de lavage 60x suivi par 240 ml d'eau déminéralisée ou distillée frais directement à l'antenne de coloration. </li><li> Mettez le plat dans la coloration de 55 ° C à bain d'eau tiède. </li><li> Stocker le concentré restant à 2-8 ° C. </li><li> Enlever le milieu de montage du réfrigérateur et à température ambiante. </li></ol> 3. La coloration de Gram <ol><li> Remuer doucement le flacon d'hémoculture. </li><li> En utilisant une aiguille et la seringue ou d'un appareil de repiquage, enlever le sang (environ 5 ml) de la bouteille et placer dans un tube à vis stériles plafonné. </li><li> En utilisant une pipette stérile, déposer une goutte de sang sur un grand une lame de microscope en verre. </li><li> L'air sec de la lame et fixer au méthanol pendant 10 secondes. </li><li> Laisser sécher à l'air glisser. </li><li> Effectuer une coloration de Gram sur le film de sang pour déterminer la morphologie de l'organisme en croissance dans le flacon d'hémoculture. </li><li> En utilisant un objectif à immersion d'huile, affichage des diapositives. Cocci à Gram positif en paires et de courtes chaînes observées sur la coloration de Gram est la plus compatible avec les espèces Enterococcus. </li><li> Ce résultat Gram entraîne alors le choix de la trousse appropriée ANP sonde FISH à utiliser pour l'identification bactérienne. Cette culture de sang seront colorées à l'aide de la E. faecalis / OE PNA FISH tache. </li></ol> 4. PNA FISH Stain <ol><li> Mélanger le tube contenant le sang doucement en remuant avant la préparation du frottis. </li><li> Déposer une goutte de solution de fixation sur le bien d'une diapositive ANP Microscope FISH. </li><li> Transfert 10 uL ou une petite goutte du tube avec l'hémoculture positive à la solution de fixation et mélanger délicatement pour émulsionner. </li><li> Fixer le frottis en les chauffant pendant 20 min. à 55 ° C sur une plaque chauffante. </li></ol> 5. Matériel de contrôle de qualité Une positive et négative d'une diapositive de contrôle de qualité doivent être testés avec chaque lot de lames pour la coloration. <ol><li> Utilisez E. faecalis / OE contrôle Diapositives acheté AdvanDx à cet effet ou préparer des frottis de cultures liquides des souches de référence de E. faecalis et E. faecium de contrôle positif, soit sur ​​des lames séparées ou mélangées sur une lame et Staphylococcus spp ou Streptococcus spp comme matériau de contrôle négatif. </li></ol> Les résultats du CQ devraient être capables de surveiller les conditions d'essai appropriées, en particulier ceux qui affectent la rigueur d'hybridation et la pénétration de la paroi cellulaire, puisque la méthodologie PNA est conçu pour optimiser la pénétration des parois cellulaires 6. Hybridation <ol><li> Ajouter une goutte de E. faecalis / OE PNA pour le bien sur la lame de microscope avec le frottis. </li><li> Ajouter lamelle. Eviter les bulles d'air. </li><li> Incuber pendant 30 ± 5 min. à 55 ± 1 ° C sur plaque chauffante </li><li> Après une incubation lieu les diapositives dans le support glisser </li></ol> 7. Lavez strictes <ol><li> Porteuse glisser Plongez dans la solution de lavage préchauffé à 55 ° C et retirer délicatement la lamelle. Souvent, la lamelle glisse par les agitant doucement la lame dans la solution de lavage. Occasionnellement, la lamelle doit être doucement poussés hors avec une pince. </li><li> Incuber dans la solution de lavage pendant 30 ± 5 min. à 55 ± 1 ° C. </li><li> Retirez les diapositives de la solution de lavage </li><li> Laisser la lame sécher à l'air </li></ol> 8. Montage <ol><li> Ajouter une goutte de milieu de montage à chaque diapositive </li><li> Ajouter lamelle. Eviter les bulles d'air. </li><li> Examiner la lame sur un microscope à fluorescence dans les 2 heures. </li><li> Ne pas exposer les diapositives à la lumière directe du soleil ou d'autres sources de lumière forte, car cela pourrait conduire à l'extinction de fluorescence. </li></ol> 9. Interprétation des résultats Le microscope à fluorescence utilisé pour l'examen diapositive doit être équipé du filtre Dual Band AdvanDx et un objectif 60x ou 100x huile. Les diapositives doivent être examinées QC premier à confirmer que l'hybridation ne se produisent. E. faecalis doit apparaître comme un vert brillant fluorescent cocci dans de multiples domaines de vue et les E. faecium apparaîtra comme un rouge vif cocci. Lame de contrôle non-entérocoques devrait apparaître non fluorescent. Après avoir vérifié le système de contrôle, les diapositives des patients peuvent être examinés. Au début, le fil de sangm apparaîtra rouge mais le rouge vif et vert cocci sera tout à fait évident. <img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Des exemples représentatifs Figure 1. De vert-positif E. faecalis (à gauche), positif rouge E. faecium (au milieu), et les résultats des tests négatifs (à droite). 10. Les résultats représentatifs Trois institutions ont été inclus dans un essai clinique multicentrique évaluant ce PNA FISH taches et comparant un protocole 2,5 heures à l'heure raccourcie 1.5 du protocole qui vient d'être examiné. Un total de 152 cocci à Gram positif en paires de routine et des chaînes (GPC) flacons d'hémoculture positifs ont été inclus dans les études. Il était de 100% (152/152) accord entre les résultats de l'modifiée et la procédure de dosage original de E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 et 78/78 autres entérocoques GPC d'autres (tableau 1). Cette méthode de coloration a une sensibilité exquise et une spécificité au cours de cet essai clinique (tableau 2). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Méthodes de routine </td><td> E. faecalis / OE procédure standard ANP POISSONS </td><td> E. faecalis / OE procédure ANP POISSONS court </td></tr><tr><td> E. faecalis </td><td> 41 </td><td> 41 (Vert Positif) </td><td> 41 (Vert Positif) </td></tr><tr><td> E. faecium </td><td> 27 </td><td> 27 (Rouge Positif) </td><td> 27 (Rouge Positif) </td></tr><tr><td> E. casseliflavus </td><td> 2 </td><td> 2 (Rouge Positif) </td><td> 2 (Rouge Positif) </td></tr><tr><td> E. gallinarum </td><td> 2 </td><td> 2 (Rouge Positif) </td><td> 2 (Rouge Positif) </td></tr><tr><td> Autres Enterococcus spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (Rouge Positif) </td><td> 2 (Rouge Positif) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td> 17 </td><td> 17 (négatif) </td><td> 17 (négatif) </td></tr><tr><td> S. viridans </td><td> 33 </td><td> 33 (négatif) </td><td> 33 (négatif) </td></tr><tr><td> S. mitis </td><td> 1 </td><td> 1 (négatif) </td><td> 1 (négatif) </td></tr><tr><td> S. pyogenes </td><td> 3 </td><td> 3 (négatif) </td><td> 3 (négatif) </td></tr><tr><td> S. bovis </td><td> 2 </td><td> 2 (négatif) </td><td> 2 (négatif) </td></tr><tr><td> S. salivarius </td><td> 1 </td><td> 1 (négatif) </td><td> 1 (négatif) </td></tr><tr><td> S. sanguinis </td><td> 2 </td><td> 2 (négatif) </td><td> 2 (négatif) </td></tr><tr><td> S. agalagtae </td><td> 7 </td><td> 7 (négatif) </td><td> 7 (négatif) </td></tr><tr><td> Autres Streptococcus spp. </td><td> 7 </td><td> 7 (négatif) </td><td> 7 (négatif) </td></tr><tr><td> Abiotrophia spp. </td><td> 3 </td><td> 3 (négatif) </td><td> 3 (négatif) </td></tr><tr><td> Peptostrepococcus spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (négatif) </td><td> 2 (négatif) </td></tr><tr><td> Total des </td><td> 152 </td><td> 152/152 100% Accord </td><td> 152/152 100% Accord </td></tr></tbody></table> Listing Tableau 1. De bactéries testées en utilisant à la fois la norme (2.5hr) et rapide (1,5 h) protocole. <table border="1"><tbody><tr><td> Sensibilité E.faecalis </td><td> Sensibilité autres Enterococcus spp. </td><td> La spécificité </td></tr><tr><td> 100% (41/41) 95% (de 93,0 à 100) CI </td><td> 100% (33/33) 33/33 95% (de 91,3 à 100) CI </td><td> 100% (78/78) 95% (de 96,2 à 100) CI </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Sensibilité et spécificité du protocole de PNA FISH 1,5 heures.

<ol><li>Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, , (2002).</li>
<li>Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, , (2003).</li>
<li>Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, , (2005).</li>
<li>Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
<li>Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
</ol>

La production de cette vidéo a été parrainé par l&#39;article AdvanDx. Benjamin Crystal est un employé d&#39;AdvanDx, qui rend les outils et les réactifs utilisés dans cet article.

Le E. faecalis / OE test PNA FISH d&#39;entérocoques peuvent fournir une identification 2-3 jours plus tôt que les méthodes standard de culture. La procédure abrégée pour le dosage (1,5 hourr) permet une identification rapide qui peut être utilisé pour une meilleure approche de la thérapie antimicrobienne et les résultats des patients. Une étude à l&#39;appui de cette a été réalisée par Forrest et al. (6). Plus de deux années consécutives à partir de 2005, le laboratoire de microbiologie identifié cocci à Gram positif en paires et les chaînes de plus en plus par des flacons d&#39;hémoculture méthodes microbiologiques traditionnelles et en 2006, ajoutant le E. faecalis / OE PNA FISH. En outre, un algorithme de traitement élaboré par l&#39;équipe des institutions antimicrobiens (AMT) pour utiliser efficacement les données générées PNA FISH par le laboratoire dans les meilleurs délais. Principal résultat a été évaluée de temps à partir d&#39;hémocultures attirer l&#39;application de la thérapie antimicrobienne efficace avant et après PNA FISH a été institué dans le workflow des laboratoires. Gravité de la maladie, la localisation des patients et de traitement antimicrobien empirique ont été mesurés. Un total de 224 patients atteints de bactériémies nosocomiales à entérocoques ont été évalués à 129 dans la période d&#39;intervention pré-et 95 dans la période de PNA FISH. PNA FISH identifié E. faecalis trois jours plus tôt que les cultures conventionnelles (1,1 vs 4,1 jours, p &lt;0,001). PNA FISH identifié E. faecium une médiane de 2,3 jours plus tôt (1,1 vs 3,4 jours, p &lt;0,001) et a été associée à une réduction statistiquement significative du temps d&#39;entreprendre un traitement efficace (1,3 vs 3,1 jours, p &lt;0,001) et une diminution de 30 jours de mortalité (26% vs 45%, p = 0,04). Ce groupe a conclu que les E. faecalis / OE test PNA FISH en conjonction avec un algorithme de traitement AMT a entraîné un démarrage plus précoce du traitement empirique antimicrobien approprié pour les patients atteints acquises à l&#39;hôpital E. faecium bactériémie. <ol><li> Réactifs ne doit pas être utilisé après la date d&#39;expiration imprimée sur les étiquettes et les réactifs ne doivent pas être modifiés en aucune façon. Ils devraient rester dans le réfrigérateur lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé ou ils pourraient perdre de puissance. </li><li> Flacons d&#39;hémoculture doivent être mélangés avant l&#39;échantillonnage. </li><li> Il est important de ne pas permettre à l&#39;embout du flacon compte-gouttes toucher un frottis sanguin, car cela peut provoquer une contamination croisée du matériel entre les diapositives, ou provoquer une contamination du réactif. </li><li> Assurez-vous que l&#39;eau du bain et le bloc de chauffage sont maintenus à une constante de 55 ° C. </li><li> Ne pas utiliser d&#39;autres filtres que les filtres Dual Band ou les couleurs ne seront pas clairement discernées. </li><li> Ne pas utiliser des lames de microscope autres que les lames de microscope ou d&#39;hybridation ne se produira pas. </li><li> Il est important que le microscope fonctionne correctement. Assurez-vous que l&#39;ampoule microscope est dans le nombre d&#39;heures approuvées pour l&#39;utilisation. </li></ol><ul><li> Certaines espèces rares survenant Enterococcus ne sont pas détectés par la sonde PNA s&#39;hybrider avec les espèces Enterococcus autres, comme E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, saccharolyticus, E. solitarius et E . sulfureuse. </li><li> Moraviensis E. est identifié comme E. faecalis en raison de similarités de séquence. </li><li> Certaines souches de Streptococcus anginosus produire une fausse fluorescence verte positif en raison de similarités de séquence. </li><li> Bouteilles VersaTREK hémoculture n&#39;ont pas été évaluées au cours des études cliniques. La performance pour détecter E. faecalis et d&#39;autres Enterococcus spp. avec des bouteilles VersaTREK hémoculture est inconnue. </li><li> Faux positifs autofluorescence verte peut se produire si une norme filtre FITC est utilisé au lieu du filtre Dual Band. </li><li> Résultats faux négatifs peuvent se produire fréquemment en raison de la croissance mixte ou due à une erreur dans la technique de dosage. </li><li> Le type et l&#39;état de l&#39;instrumentation utilisée va influencer l&#39;aspect visuel de l&#39;image obtenue. La fluorescence peut varydue le type de microscope utilisé, la source lumineuse et le niveau de l&#39;ARNr dans les cellules </li><li> Isolement sur milieu solide est nécessaire de différencier la croissance mélangé avec d&#39;autres organismes et d&#39;identifier les hémocultures positives qui donne un résultat négatif. </li><li> Le produit n&#39;a pas été validée avec des échantillons autres que les cultures de sang. </li></ul>

Réactifs E. faecalis / OE PNA FISH est composé des composants du kit suivantes: <ul><li> Solution de fixation Fixation Solution 3 ml tampon phosphate salin avec du détergent. </li><li> E. faecalis / OE ANP E. faecalis / OE ANP 1,5 mL sondes PNA dans l&#39;hybridation. solution. Contient 30% de formamide. </li><li> Lavez 60x Solution Solution de lavage 60x 50 mL de Tris-solution saline tamponnée avec un détergent </li><li> Milieu de montage Montage inhibiteur ml Moyen 3 photoblanchiment dans le glycérol </li><li> Lames de contrôle de la qualité </li><li> <a href="http://www.advandx.com">AdvanDx</a> </li></ul>

une procédure de 1,5 heure pour l&#39;identification des enterococcus espèces directement à partir d&#39;hémocultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Les entérocoques sont une cause fréquente de bactériémie à E. faecalis étant l&#39;espèce prédominante suivie par E. faecium. Parce que la résistance à l&#39;ampicilline et à la vancomycine dans E. faecalis est encore rare comparée à la résistance de E. faecium, le développement de tests rapides permettant la différenciation entre les espèces entérocoques est important pour un traitement approprié et la surveillance de la résistance. Le E. faecalis OE test PNA FISH (AdvanDx, Woburn, MA) utilise des espèces spécifiques d&#39;acides nucléiques peptides (PNA) des sondes dans une fluorescence en format hybridation in situ et offre un temps de résultat de 1,5 heures et le potentiel de fournir des informations importantes pour les espèces spécifiques traitement. Études multicentriques ont été effectuées pour évaluer la performance de l&#39;1,5 heures E. faecalis / OE procédure de PNA FISH par rapport à la procédure de dosage 2,5 heures original et aux méthodes de la bactériologie standard pour l&#39;identification des entérocoques directement d&#39;un flacon d&#39;hémoculture positive.

Un protocole rapide pour l&#39;identification directe de Enterococcus faecalis et Enterococcus autre d&#39;une hémoculture positive en utilisant un acide nucléique peptidique fluorescentes test d&#39;hybridation in situ (FISH ANP).

Une procédure de 1,5 heure pour l&#39;identification des Enterococcus Espèces directement à partir d&#39;hémocultures

Les entérocoques sont une cause courante de bactériémie, *E. faecalis* étant l'espèce prédominante, suivie d' *E. faecium*. En raison de la résistance à l'ampicilline et...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier rapidement les espèces d'entérocoques à partir de bouteilles de culture sanguine positives en utilisant une hybridation fluorescente par acide nucléique peptidique et C deux. Une fois les cultures sanguines préparées et testées au Gram pour confirmer la présence d'entérocoques en culture, les échantillons sont fixés sur des lames de microscope PNA FISH. Les lames sont ensuite incubées avec des sondes PNA spécifiques aux organismes d'intérêt.Une fois que les sondes se sont hybridées, des lavages rigoureux sont effectués pour éliminer l'excès de sonde non hybridée. Un milieu de montage est ajouté sur les lames, qui sont ensuite scellées avec des lamelles. Les espèces d'entérocoques présentes dans l'échantillon peuvent être identifiées par microscopie à fluorescence.Ce protocole d'identification PNA Fish est unique en offrant une méthode rapide et spécifique pour l'identification d'entérocoques provenant d'une paralysie. Incubez deux flacons d'hémoculture, un aérobie et un anaérobie contenant du sang veineux prélevé sur un patient suspecté de sepsis, dans un appareil automatisé d'hémoculture à 35 degrés Celsius. Dès que l'appareil indique avoir détecté une croissance microbienne, retirez le flacon et remuez doucement les flacons d'hémoculture afin de resuspendre uniformément les bactéries.Ensuite, à l’aide d’une seringue stérile et d’une aiguille, transférer aseptiquement environ cinq millilitres de sang de chaque flacon dans un tube séparé à bouchon vissé. Une fois que tous les échantillons ont été répartis, utiliser une pipette stérile pour transférer une goutte de sang de chaque tube sur une lame de microscope en verre distincte. Laisser sécher la lame à l’air pendant environ 15 minutes.Ensuite, une fois que la lame est complètement sèche, plongez-la dans du méthanol pour fixer l'échantillon. Après la fixation des lames, rincez-les et réalisez une coloration de Gram standard afin de déterminer la morphologie des organismes présents dans chaque hémoculture. Examinez les lames colorées au microscope à l'aide d'un objectif à immersion huileuse.Saisir une espèce de caucase apparaîtra sous forme de coques gram-positifs généralement assemblés en paires ou en courtes chaînes. Déposer une goutte de solution de fixation dans la cavité d'une lame de microscope à poissons. Mélanger doucement le tube de culture sanguine à tester.Ensuite, transférez 10 microlitres de culture sur la goutte de solution de fixation et aspirez et expulsez plusieurs fois pour émulsifier l'échantillon. Placez les lames sur une plaque chauffante à 55 degrés Celsius pendant 20 minutes afin de fixer les frottis pour chaque test. Veillez à inclure des lames témoins positives et négatives pour l'évaluation de la qualité du dosage.Des lames-témoins de calus peuvent être achetées auprès d'un fournisseur Van DX ou préparées à l'aide de cultures de référence. Une fois la frottis prêt, déposer une goutte de EFI calus O-E-P-N-A dans la cavité contenant l'échantillon de culture sanguine, ainsi que dans les cavités témoins positive et négative. Afin d'éviter toute contamination de la solution mère de la sonde, veiller à ne pas laisser la pointe du compte-gouttes toucher le frottis sanguin.Placez une lame couvre-objet sur l'échantillon en prenant soin de ne pas créer de bulles d'air. Incubez ensuite la lame sur un bloc chauffant à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour permettre l'hybridation de la PNA après l'incubation, placez les lames dans un porte-lame.Immerger le porte-lame chargé dans une boîte de coloration contenant de la solution de lavage préchauffée à 55 degrés Celsius. Pour éliminer l'excès de PNA présent sur l'échantillon, retirer délicatement la lamelle en agitant la lame dans le tampon ou à l’aide de pinces. Incuber la lame à 55 degrés Celsius dans la solution de lavage pendant 30 minutes.Ensuite, retirez la lame du bac de coloration et laissez-la sécher à l'air libre. Une fois la lame sèche, ajoutez une goutte de milieu de montage à température ambiante sur la lame et posez délicatement une lamelle sur l'échantillon. Examinez les lames au microscope à fluorescence en utilisant un filtre double bande dans les deux heures suivant la préparation.Grâce à cette méthode, iffy, calleux, représenté en vert à gauche, peut être distingué d'eum en rouge. Dans le panneau central à l'extrême droite, on observe un résultat négatif. Trois points à retenir pour obtenir des résultats concluants : les températures de l'appareil doivent être maintenues aux valeurs prédéfinies.Vous devez suivre très attentivement la procédure de coloration telle que décrite dans la notice du kit. Enfin, vous devez disposer d'un lecteur expérimenté qui effectue une lecture minutieuse de la lame. Ce protocole est utile pour prendre des décisions thérapeutiques dans le traitement de la septicémie provoquée par l'entérocoque.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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