Name: Les analyses concurrentielles Homing détude Gut tropisme migration des lymphocytes T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse concurrentielle pour étudier la migration des lymphocytes T gut-tropes vers l'intestin et les ganglions lymphatiques mésentériques chez la souris. Cette technique permet d'évaluer les propriétés migratoires des sous-populations cellulaires in vivo.

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CPA est soutenu par une bourse de la maladie de Crohn S &amp; Colitis Foundation of America (CCFA). JRM est soutenu par des subventions de CCFA, le Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (HGM), dans le Massachusetts Life Science Center (MLSC) et le Prix du directeur des NIH s Innovateur Nouvelle.

1. Génération ex vivo de cellules T gut-homing et de contrôle (voir Figure 1) <ol><li> Isoler splénocytes en écrasant une rate de souris de type sauvage. Resuspendre la suspension des cellules dans du PBS et centrifuger pendant 5 'à 400 x g. Enlever le surnageant et lyser les globules rouges par la remise en suspension du culot cellulaire dans 4 ml de tampon de lyse ACK pendant 2-3 minutes. Après cela, ajoutez 5 ml de PBS. Centrifuger pendant 5 'à 400 xg et retirer le surnageant. </li><li> Resuspendre splénocytes total à 1 x 10 6 / ml en IMDM + 10% de FBS + 50 mM de 2-mercaptoéthanol + pénicilline / streptomycine (IMDM complet). Séparer les cellules en deux groupes, dont l'un est complété par RA (ou synthétiques RAR-agonistes, tels que AM80 ou Am580) à une concentration finale de 100-200 Nm 3. Les cellules T activées en présence de la PR ou RAR-agonistes réguler positivement a4b7and CCR9 et deviendra l'intestin tropisme des cellules T, tandis que les cellules T activées, sans AR devenir des cellules T de contrôle. </li><li> Ajouter de 1,5 à 2,0 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 24 puits préalablement revêtu d'anti-CD3 (10 mg / ml) et anti-CD28 (10 mg / ml) et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 (pour le revêtement de la plaque ajouter 500 ml / puits d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28 dans le PBS et incuber pendant 2 heures à 37 ˚ C et puis laver deux fois avec 2 ml de PBS). </li><li> Afin d'éviter une stimulation excessive des cellules T, après 2-3 jours de transférer les suspensions de cellules dans un nouveau non couché de 24 puits à plaques. Incuber pendant 2-3 jours supplémentaires. Selon la densité cellulaire et la prolifération des médias pourrait devenir acide (jaune), auquel cas il pourrait être nécessaire de remplacer la moitié des médias avec IMDM complet frais. Récolter les cellules après 4-5 jours (à compter du jour 0). </li><li> Typiques rendements finaux sont 1-2 x 10 6 cellules T effectrices / puits. Par conséquent, un minimum de 9-12 puits de chaque cellules T gut-tropic et le contrôle des cellules T devrait être plaquées afin de se retrouver avec 10-20 x 10 6 cellules T par condition. </li></ol> 2. Analyse de l'intestin-homing récepteurs sur les cellules T activées Après 4-5 jours de culture, nous devrions observer une forte expression de récepteurs gut-homing a4b7and CCR9 sur les cellules T activées en présence d'agonistes de la PR ou RAR, tandis que le contrôle des cellules T devrait exprimer des niveaux très bas de ces quatre récepteurs. La cytométrie en flux (FACS) analyse. <ol><li> Recueillir entre 0,2 à 0,5 x10 6 cellules et centrifuger pendant 5 min à 300 g à 4 ° C. </li><li> Incuber avec l'anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) et anti-CD8-PerCP pendant 15 min à 4 ° C dans l'obscurité. </li><li> Après l'incubation, centrifuger pendant 5 min à 300 g à 4 ° C. Lavez et remettre en suspension les cellules dans du tampon coloration et d'analyser par FACS. </li></ol> 3. Marquage des cellules T avec des cellules CFSE trackers et CMTMR <ol><li> Gardez toutes les solutions à 37 ° C avant de commencer. Laver l'intestin tropisme des cellules T (a4b7 Haute CCR9 élevé) et le contrôle des cellules T (a4b7 Basse / Nég CCR9 Basse / Nég) à deux reprises avec du PBS pour éliminer le sérum. Ajuster la concentration de cellules T à 10-15 x 10 6 / ml dans le PBS. </li><li> Ajouter CFSE (carboxyfluorescéine succinimidyl ester) ou CMTMR (chlorométhyl-benzoyl-amino-tétraméthylrhodamine) fluorophores soit gut-tropic T et le contrôle des cellules T à une concentration finale de 5 mM et 10 mM, respectivement, doucement vortex et incuber pendant 20 min à 37 ° C. Il est recommandé d'échanger les marquages ​​dans le même ou dans une expérience séparée afin d'exclure les éventuels effets intrinsèques de fluorophores sur la migration des lymphocytes T. </li><li> Après l'incubation, éteindre avec 1 volume de FBS et incuber pendant 1-5 min à température ambiante. Diluer 10 fois avec PBS et centrifuger chaude pendant 5 min à 300 g. Laver deux fois avec du PBS et remettre en suspension dans IMDM complet. </li><li> Idéalement, 10-20 x 10 6 cellules T de chaque population doit être mélangé dans un rapport 1:1 et ensuite centrifugé à 300 xg pendant 5 min. Enfin, remettre en suspension les cellules dans 200 à 250 ml d'eau tiède PBS et injecter dans la veine de la queue. </li><li> Pour calculer le ratio d'entrée exacte (idéalement proche de 1) sauver 5-10 mL de la suspension cellulaire injecté et diluer avec 300 ml de PBS et d'analyser par FACS. </li></ol> 4. L'analyse des cellules T homing Bien que les souris peuvent être analysés à différents temps (entre 1 h et plusieurs jours après l'injection de cellules T), domiciliation des cellules T à tropisme intestinal sont les mieux documentées entre 12-24 h post-injection. Points de temps plus augmenter les effets potentiels des autres variables affectant la dernière cellule numéros / ratios, tels que l'apoptose des cellules T et la sortie des cellules T à partir des tissus. Après les souris sont euthanasiées, les suspensions de cellules de différents tissus doivent être isolés, sans délai, afin de diminuer la mort cellulaire, ce qui pourrait affecter les rendements finaux et les résultats. Les tissus d'intérêt sont l'intestin grêle, côlon, rate, ganglions lymphatiques, les plaques de Peyer, le foie, les poumons et le sang. Si lesont injecté des cellules T sont de bonne foi l'intestin tropisme des cellules T, ils devraient à domicile, en moyenne de 5-10 fois mieux (ou supérieur) à la muqueuse intestin grêle par rapport au contrôle des cellules T. Toutefois, d'autres tissus, tels que le sang et la rate, ne doit pas présenter une migration préférentielle des cellules T. Isolement des lymphocytes de la lamina propria intestinale et le compartiment intra-épithéliale a été décrit précédemment 5. <ol><li> Coloration FACS: Les échantillons sont remis en suspension en fonction du nombre de cellules recueillies, à une densité ne dépassant pas 3,0 x 10 6 cellules / ml. Si congéniques CD45.1 + ou + Thy1.1 souris ont été utilisés en tant que bénéficiaires, les cellules sont colorées avec le marqueur correspondant congéniques (par exemple, ou de CD45.2 Thy1.2) combiné avec quelques marqueurs lignée (par exemple, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> Lors de l'analyse FACS, les cellules sont déclenchées sur le marqueur congéniques (par exemple CD45.1) et ensuite sur les marqueurs de la lignée spécifique (par exemple CD4/CD8) et analysés pour les rapports entre les cellules CFSE CMTMR positif. </li><li> Les données sont généralement exprimés comme l'indice Homing (HI), qui est calculé comme le ratio de CFSE / CMTMR (ou CMTMR / CFSE) dans chaque tissu, divisé par le ratio d'entrée correspondant (voir ci-dessous). Si le ratio d'entrée est très proche de 1, alors les ratios de tissus sera équivalente à l'HI. </li></ol> HI CFSE = tissu / CMTMR tissus: CFSE entrée / CMTMR entrée Le sang doit également être analysée afin de déterminer si les deux populations de cellules T sont également représentés dans la circulation ou si une population de cellules T est diminué rapport à l'autre (par exemple, par le piégeage préférentiel dans les poumons / foie ou par la viabilité diminué). Cela peut arriver lorsque l'on compare naïfs ou lymphocytes T mémoire par rapport récemment activé les lymphocytes T effecteurs, puisque ces derniers pourraient être piégés dans une plus grande mesure dans les poumons. Si le HI dans le sang est significativement différente de 1, on peut normaliser HI dans les tissus par le HI dans le sang. Le sang peut être obtenu par ponction cardiaque chez la souris anesthésiée (avec l'euthanasie ou Avertin isofluorane préalable) et devrait être lysées à deux reprises avec le tampon ACK avant de l'utiliser pour la coloration FACS. La normalisation de sang = HI tissu / HI sang 5. Les résultats représentatifs Souris receveuses (Thy1.1 +) ont été par injection euthanized18h cellule post. Les suspensions cellulaires ont été générées à partir de la rate, ganglions lymphatiques périphériques (PLN), les ganglions mésentériques (MLN) et les petits propia lamina intestin (LP). Après que les cellules ont été colorées pour Thy1.2 et CD8 et ensuite analysées par FACS par gating sur les cellules viables Thy1.2 + + CD8, qui ont finalement été analysés pour le ratio entre les cellules + CMTMR (gut-tropic cellules T) et CFSE + cellules (contrôle des cellules T) divisé par le ratio d'entrée. Les résultats peuvent être affichés comme le montre la figure 2, dans lequel il peut être apprécié que gut-tropic et le contrôle des cellules T hébergés également à la rate (HI proches à1, indiqué par une ligne rouge). En revanche, l'intestin tropisme des cellules T migré environ 10 fois plus efficacement à la SEC par rapport au contrôle des cellules T. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure1:. Schéma montrant la production et l'étiquetage des boyaux à tropisme intestinal et non des cellules T Tropic cellules T sont isolés de souris de type sauvage et activé avec anti-CD3/anti-CD28 et dans la présence ou l'absence de tous les 100-200 nm - trans rétinoïque (RA). Après 4-5 jours de PR traités lymphocytes T acquièrent l'expression de l'intestin récepteurs homing CCR9 et a4b7. Ensuite, l'intestin et le contrôle à tropisme des cellules T sont différentiellement étiquetés avec CFSE ou CMTMR, lavés, mélangés dans un rapport 1:1 et injecté dans une souris receveuse via la veine de la queue. Certaines cellules marquées sont utilisées pour déterminer le ratio d'entrée CFSE / CMTMR (qui devrait être proche de 1). <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2:. Souris Exemple d'analyse de homing analysé 12-18 h après l'injection de lymphocytes T et des suspensions cellulaires simples sont obtenus à partir des organes de l'intérêt. Les cellules sont colorées avec des anti-Thy1.2 (marqueur congéniques) et anti-CD8 + et ensuite Thy1.2 cellules T CD8 + sont analysés pour le ratio de CMTMR + et + cellules CFSE dans chaque tissu par FACS. Le tissu CMTMR / CFSE ratios sont ensuite normalisés par l'entrée CMTMR / CFSE rapport pour obtenir les indices de homing (HI). Dans ce + CMTMR exemple et CFSE + sont des cellules intestinales et les cellules-tropique de contrôle T effecteurs, respectivement.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

Même si des expériences homing fournir des informations très précieuses sur la migration des populations de cellules au total dans tout tissu donné, il faut garder à l&#39;esprit que ces essais ne concernent pas directement l&#39;analyse d&#39;adhérence endothéliales et donc ne soient pas discriminatoires dans lequel l&#39;étape (s) de l&#39;adhésion à plusieurs étapes cascade (tethering / roulement, l&#39;activation ou de coller) un récepteur donné homing agit. L&#39;étalon-or pour définir le rôle spécifique des récept...

Animaux: souris C57BL / 6 sont couramment utilisés pour l&#39;isolement de lymphocytes T. En outre, CD45.1 et Thy1.1 souches congéniques sont disponibles par le biais de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Milieux de culture: IMDM (milieu Iscove Dulbecco modifié par + L-glutamine + HEPES) majoré de 10% de la chaleur de FBS inactivé (sérum de veau fœtal, l&#39;endotoxine bas, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine (antibiotiques HyClone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / amphotéricine B (Gibco), et 50 mM b-mercaptoéthanol. ACK tampon lyse des globules rouges (RBC, 10 mM de KHCO3, 150 mM de NH 4 Cl, EDTA 0,1 mM, pH 8,0), ajuster le pH à 7.2 à 7.4 et stocker à température ambiante). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). La cytométrie en flux (FACS) médias (PBS ou IMDM + 2% de FBS + EDTA 5 mM). Lorsque coloration utilisant la sélectine-Fc chimères, des médias avec 2 mM de Ca + + doit être utilisé dans toutes les étapes (y compris l&#39;acquisition FACS). IMDM est recommandé dans ce cas. Marquage des cellules T et le transfert adoptif: CFSE (diacétate de carboxyfluorescéine, succinimidyl ester), CMTMR ((5 - (et-6 )-((( 4-chlorométhyl) benzoyl) amino) tétraméthylrhodamine) de Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1000 x stocks doit être faite dans le DMSO (5 CFSE mm, 20 mm CMTMR) et conservés à -20 ° C. Polyclonaux activation des cellules T: 24-puits ou plaques de 96 puits (de culture de tissus traités, polystyrène, fond plat avec couvercle, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) sont incubées pendant 2 heures à 37 ° C avec 50 ml de PBS, respectivement , contenant des anti-CD3 et anti-CD28 (10 mg / ml chacun). Ensuite, des plaques de culture sont lavées deux fois avec du PBS et utilisées immédiatement pour la culture cellulaire T. Alternativement, Dynabeads recouvert d&#39;anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) peut être utilisé pour l&#39;activation des cellules T au lieu de la plaque liée anticorps. La cytométrie en flux (FACS) coloration: activation polyclonale: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing récepteurs: CCR9 purifiée (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, Californie), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype contrôle (IgG2a, k). Peau-homing récepteurs: la P-sélectine-Fc (purifiée souris P-sélectine - protéine de fusion IgG, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-sélectine-Fc (E-Selectin/Fc recombinant de souris chimère, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) et correspondante F secondaires de chèvre réactif (ab &#39;) 2 anti-IgG humaine R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Acide tout-trans rétinoïque (Sigma, St. Louis, MO) est remis en suspension dans l&#39;éthanol absolu ou le DMSO en utilisant une ampoule jaune ou une source indirecte de la lumière lors de la préparation. Aliquotes Conserver dans des flacons en verre à -80 ° C et protégé de la lumière à tout moment. RAR-agonistes synthétiques: AM80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

les analyses concurrentielles homing d&#39;étude gut tropisme migration des lymphocytes t

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Afin d&#39;exercer leur fonction de lymphocytes besoin de quitter le sang et migrent dans les différents tissus de l&#39;organisme. L&#39;adhérence des lymphocytes aux cellules endothéliales et l&#39;extravasation des tissus est un processus en plusieurs étapes contrôlées par des molécules d&#39;adhérence différentes (récepteurs homing) exprimée sur les lymphocytes et leurs ligands respectifs (adressines) affiché sur les cellules endothéliales 1 2. Même si la fonction de ces récepteurs d&#39;adhésion peut être partiellement étudiée ex vivo, le test ultime pour leur pertinence physiologique est d&#39;évaluer leur rôle au cours de l&#39;adhérence des lymphocytes in vivo et la migration. Deux stratégies complémentaires ont été utilisés à cette fin: la microscopie intravitale (IVM) et des expériences homing. Bien IVM a été essentielle pour définir la contribution précise de récepteurs d&#39;adhésion spécifiques lors de la cascade d&#39;adhérence en temps réel et dans différents tissus, l&#39;IVM prend du temps et de main-d&#39;oeuvre, il faut souvent le développement de techniques sophistiquées de chirurgie, il a besoin d&#39;isolement avant d&#39;homogénéité populations de cellules et il permet l&#39;analyse d&#39;un seul tissu / organe à un moment donné. En revanche, la compétitivité des expériences homing permettre la comparaison directe et simultanée dans la migration de deux (ou même plus) sous-ensembles de cellules dans la même souris et ils permettent également l&#39;analyse de nombreux tissus et d&#39;un nombre élevé de cellules dans la même expérience. Nous décrivons ici les classiques du protocole concurrentiel homing utilisé pour déterminer l&#39;avantage / désavantage d&#39;un type cellulaire donné à la maison à des tissus spécifiques par rapport à une population de cellules de contrôle. Nous avons choisi d&#39;illustrer les propriétés migratoires des intestins à tropisme intestinal par rapport aux non-tropique des cellules T, parce que la muqueuse intestinale est la plus grande surface du corps en contact avec l&#39;environnement extérieur et il est aussi le tissu extra-lymphoïdes avec les exigences mieux définies migrateurs . Par ailleurs, des travaux récents ont établi que le métabolite de la vitamine A acide tout-trans rétinoïque (RA) est le principal mécanisme moléculaire responsable de l&#39;induction récepteurs d&#39;adhésion intestinale spécifique (récepteur de chimiokine intégrine a4b7and CCR9) sur les lymphocytes. Ainsi, nous pouvons facilement générer un grand nombre d&#39;ex vivo tropisme intestinal et non gut-tropic lymphocytes T en activant les cellules en présence ou en absence de RA, respectivement, ce qui peut être finalement utilisés dans les expériences décrites ici concurrentiel homing.

Concurrentiels expériences homing permettent d&#39;évaluer directement les propriétés migratoires des deux populations cellulaires différentes dans une seule souris. Ici, nous illustrons cette procédure en comparant la migration des ex vivo généré gut-tropic versus non-intestinale des cellules T tropiques.

Les analyses concurrentielles Homing d&#39;étude Gut tropisme migration des lymphocytes T

Afin d'exercer leur fonction, les lymphocytes doivent quitter le sang et migrer vers différents tissus de l'organisme. L'adhésion des lymphocytes à l'endothélium...

L'objectif général de cette procédure est de comparer les capacités migratoires spécifiques aux tissus de deux sous-ensembles cellulaires ou plus chez un même receveur murin, permettant ainsi l'analyse de nombreux tissus et cellules dans une seule expérience. Nous présentons ici une méthode permettant de comparer les capacités migratoires de lymphocytes T générés in vitro ayant une tropisme intestinal et de lymphocytes T contrôles chez une souris receveuse de type sauvage. Cette méthode peut être utilisée, par exemple, pour déterminer la capacité des lymphocytes T à tropisme intestinal à migrer vers les ganglions lymphatiques mésentériques intestinaux, les ganglions lymphatiques périphériques et la rate.Par rapport aux lymphocytes T témoins, il faut d'abord générer in vitro des lymphocytes T effecteurs guttotaux et des lymphocytes T témoins. Ensuite, les lymphocytes T expérimentaux et témoins doivent être marqués avec des colorants différents et mélangés selon un rapport de un pour un. Puis, le mélange cellulaire, à l'exception d'un petit échantillon d'Eloqua utilisé pour confirmer le rapport d'entrée, est injecté dans la souris receveuse.Enfin, la souris est sacrifiée 18 heures après le transfert adoptif et les organes d'intérêt sont analysés pour la présence de lymphocytes T gut-tropes et de lymphocytes T témoins par cytométrie en flux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le transfert adoptif d'une population cellulaire unique, est qu'une combinaison de différents sous-types est injectée chez les mêmes souris receveuses, réduisant ainsi considérablement la variabilité associée à l'injection intraveineuse ou à l'utilisation de souris receveuses différentes. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des maladies associées à une infiltration massive de leucocytes, telles que la maladie inflammatoire de l'intestin.Par exemple, cela nous permet de déterminer combien de molécules sont nécessaires pendant la migration normale ainsi que pendant la migration des lymphocytes vers l'intestin. De plus, cette procédure nous permet d'évaluer l'efficacité de médicaments conçus pour bloquer le trafic des leucocytes. Étiquetez chaque puits d'une plaque de 24 puits avec 500 microlitres de PBS contenant 10 milligrammes par millilitre d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28. Incubez la plaque pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone, pendant que les puits sont en cours de revêtement.Sacrifiez une souris de type sauvage et disséquez la rate, en la plaçant dans un tube de 50 millilitres contenant du milieu. Isolez les PLE cytes en plaçant la rate entre deux lames de microscope et en l'écrasant au-dessus d'une boîte de Pétri. Resuspendez les cellules dans du PBS, pipetez la suspension cellulaire dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et centrifugez pendant cinq minutes.À 400 Gs et à température ambiante, retirez le surnageant et lysez les globules rouges en resuspendant le culot cellulaire dans quatre millilitres de tampon de lyse actif pendant deux à trois minutes. Arrêtez la lyse avec cinq millilitres de PBS, centrifugez à nouveau la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 400 Gs et à température ambiante, puis jetez le surnageant. Resuspendez le culot obtenu à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre dans du milieu complet refroidi sur glace.Partager également la suspension cellulaire obtenue dans deux tubes distincts, en ajoutant à l'un des tubes de l'acide rétinoïque tout-trans ou RA à une concentration finale de 100 à 200 nanomolaires au cube. Protéger le tube de la lumière directe afin d'éviter la dégradation de l'acide rétinoïque tout-trans. Retirer la plaque à 24 puits de l'incubateur et laver chaque puits deux fois avec deux millilitres de PBS.Ajouter de 1,5 à deux millilitres de la suspension cellulaire enrichie en RA à une moitié de la plaque 24 puits. Ensuite, ajouter la même quantité de cellules témoins dans chaque puits de la seconde moitié de la plaque 24 puits et replacer la plaque dans l’incubateur. Après deux à trois jours, transférer les suspensions cellulaires dans une nouvelle plaque 24 puits non revêtue.Pour éviter une surexcitation des cellules T, incuber les cellules pendant deux à trois jours supplémentaires. Si le milieu devient jaune en raison de la densité cellulaire ou de la prolifération, ajouter 500 microlitres de milieu IMDM frais à chaque puits afin d'obtenir un volume final d'un millilitre par puits. Pour récolter les cellules, recueillir le surnageant au jour quatre ou cinq, le jour où les cellules ont été mises en culture étant considéré comme le jour zéro.Les rendements finaux typiques sont de un à deux fois 10 puissance six cellules T effectrices par puits. Par conséquent, un minimum de neuf à douze puits de chacun des types de cellules T tropiques pour l'intestin et des cellules T contrôlées doivent être ensemencés afin d'obtenir de 10 à 20 fois 10 puissance six cellules T par groupe. Pour vérifier les niveaux d'expression d'alpha quatre, de bêta sept et de CCR neuf sur ra.Les lymphocytes T activés et contrôlés collectent entre 0,2 et 0,5 fois 10e6 des cellules expérimentales et témoins fraîchement récoltées dans des tubes FACS de quatre millilitres et centrifugent les tubes pendant cinq minutes à 300 ×g à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans 100 microlitres de tampon de marquage, puis incuber avec l'anti-CD4 FSE, l'anti-CD4β7 PE, l'anti-CCR9 APC et l'anti-CD8 PerP pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière.Après l'incubation, laver les cellules avec du PBS pendant cinq minutes à 300 ×g et 4 °C, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans le tampon de marquage. Analyser par cytométrie en flux au début de cette étape. Préchauffer un flacon de milieu IMDM et un flacon de PBS à 37 °C pour une utilisation ultérieure dans le protocole de marquage.Après avoir confirmé les phénotypes d'homing des lymphocytes T pour les deux cultures cellulaires par cytométrie en flux comme décrit à l'étape précédente, centrifuger les populations fraîchement récoltées de lymphocytes T guttropes (alpha quatre, bêta sept, CCR neuf élevé) et de lymphocytes T contrôle (alpha quatre, bêta sept, CCR neuf faible ou négatif) à 300 g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, laver les cellules deux fois supplémentaires avec du PBS pour éliminer le sérum, puis ajuster la concentration en lymphocytes T pour chaque groupe à 10 à 15 × 10⁶ cellules par millilitre. Ajouter du CFSE ou du colorant C-M-T-M-R au PBS, soit aux lymphocytes T guttropes, soit aux lymphocytes T contrôle.Ici, le CFSE est ajouté à la population cellulaire témoin et le C-M-T-M-R est ajouté aux cellules T tropicales du tube digestif à des concentrations finales respectives de cinq millimolaire et 10 millimolaire. Vortexer doucement les cellules pendant cinq secondes, puis incuber les tubes pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. À la fin de l'incubation, arrêter la coloration par l'ajout de cinq millilitres de FPS et incuber pendant une à cinq minutes à température ambiante.Diluer 10 fois avec le PBS tiède et centrifuger pendant cinq minutes à 300 Gs à température ambiante. Éliminer le surnageant et laver deux fois supplémentaires avec du PBS, puis resuspendre les cellules dans du IMDM complet. Idéalement, de 10 à 20 fois 10e des six cellules de chaque population de lymphocytes T doivent être mélangées ensemble dans des tubes fax de quatre millilitres selon un rapport de un à un.Pour calculer le rapport d'entrée exact, prélevez cinq à 10 microlitres de la suspension cellulaire injectée, appelée échantillon d'entrée, et conservez-la à quatre degrés Celsius. Centrifugez le mélange cellulaire à injecter à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante. Resuspendez les cellules à injecter dans 250 à 300 microlitres de PBS chaud. Chargez une seringue d'insuline d'un cc équipée d'une aiguille de calibre 28 avec les cellules destinées à l'injection.Injecter 250 microlitres du mélange cellulaire par la veine de la queue. Enfin, analyser les cellules d'entrée par cytométrie en flux afin d'obtenir le pourcentage de cellules positives à CFSE et C-M-T-M-R qui ont été préalablement injectées. Ce pourcentage correspondra au ratio d'entrée utilisé.Dans le calcul final de l'indice de migration. Nous suspendons les échantillons cellulaires provenant des tissus pour l'analyse de l'homing des lymphocytes T à une densité n'excédant pas trois fois dix puissance six cellules par millilitre. Si des souris congéniques sont utilisées comme receveuses pour cette expérience, les cellules CD45.1 positives sont marquées à l'aide du marqueur congénique approprié combiné à un marqueur d'origine cellulaire (lineage marker) lors de l'analyse en cytométrie en flux ; on sélectionne d'abord les cellules exprimant le marqueur congénique choisi, puis celles exprimant le marqueur de lignée spécifique CD8, et l'on analyse les rapports entre les cellules CMTMR et les cellules positives au CFSE.Les données sont ensuite exprimées sous forme d'indice de migration (homing index ou hi), qui est calculé comme le rapport entre les deux colorants différents dans chaque tissu, divisé par le rapport d'entrée correspondant. Le rapport d'entrée correspond au rapport entre les cellules positives à la CFSE et les cellules positives au CMTM TMR dans la seringue avant l'injection, calculé à partir d'un aliquot de cinq à dix microlitres de suspension cellulaire mis de côté et analysé par cytométrie en flux à cet effet. Si le rapport d'entrée est très proche de un, les rapports tissulaires seront alors équivalents au hi.Si l'indice d'homéotypie (HI) et le sang diffèrent significativement de un, l'HI dans les tissus analysés peut être normalisé par l'HI dans le sang en calculant le rapport de l'HI dans les tissus divisé par l'HI dans les suspensions cellulaires obtenues à partir de la rate, des ganglions lymphatiques périphériques ou des ganglions mésentériques (MLN), ou de la lame propre (LP) de l'intestin grêle 18 heures après l'injection. Ont été analysés pour l'expression de C-M-T-M-R et de CFSE sur les cellules CD8 positives et CD45,1 positives sélectionnées, activées RA, exprimant alpha4, bêta7 et CCR9. Les cellules T C-M-T-M-R positives se dirigent vers la rate en nombres équivalents par rapport aux cellules témoins CFSE positives, mais montrent une augmentation marquée de l'homing vers l'intestin et les tissus lymphatiques associés à l'intestin. Le calcul de l'HI pour chaque tissu a confirmé davantage que les cellules T tropiques pour l'intestin et les cellules T témoins se dirigent également vers la rate, mais, en revanche, les cellules T tropiques pour l'intestin migrent environ 10 fois plus efficacement vers la LP par rapport aux cellules T témoins après maîtrise de la procédure.L'utilisation de souris congéniques au lieu de la normalisation par colorant peut être effectuée afin d'évaluer la capacité migratoire de types cellulaires supplémentaires, tels que les cellules dendritiques ou les microphages. Étant donné que ces types cellulaires ont tendance à perdre le colorant une fois injectés dans les souris receveuses, l'utilisation d'animaux congéniques permet un meilleur traçage des cellules et sur des périodes beaucoup plus longues après le transfert adoptif.

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