Name: Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour létude vasculaire morphogenèse de branchement de lembryon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Découvrez l'immunohistochimie en montage entier pour analyser la vascularisation de la peau des membres embryonnaires de souris. Cette méthode combine microscopie confocale et marquages multiples pour étudier la morphogenèse vasculaire.

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Nous remercions K. Gill de l&#39;aide pour l&#39;élevage de souris et de soins et de gestion de laboratoire. Merci également à Mukoyama membres du laboratoire de l&#39;aide technique. Le financement a été fourni par le Programme de recherche intra-muros des Instituts Naitonal de la Santé.

1. Collecte peau Limb embryonnaires de souris (E13.5 E17.5 ~) <ol><li> Euthanasier branchée femelles par une procédure approuvée. Selon notre protocole animales approuvées, les femelles sont euthanasiés par le CO 2 d'exposition et ensuite assurée par dislocation cervicale. Lay l'animal sur son papier absorbant et les tremper complètement dans 70% EtOH / H 2 O à partir d'un flacon souple. </li><li> Disséquer l'utérus intact et le placer dans un plat de 100 x 15 mm de Petri contenant une solution glacée Hanks Balanced Salt (HBSS) pour laver le sang. </li><li> Séparée et disséquer l'embryon. Retirez l'amnios très mince de l'embryon. </li><li> (Option) Disséquer un seul embryon dans un plat de 35 x 10 mm de Petri, si chaque embryon doit être génotypés. La queue est disséqué transféré dans un tube de 0,2 ml par PCR pour le génotypage. </li><li> Coupez les pattes avant de l'embryon et le transfert des membres antérieurs par une pince à anneau en 24 plaques à puits contenant 2 ml de glace froide paraformaldéhyde à 4% frais (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Fixer les pattes avant avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, retirer la PFA et laver trois fois pendant 5 min dans 2 ml de PBS avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à température ambiante. </li><li> Transférer les pattes avant dans le méthanol à 100% (MeOH) et les stocker à -20 ° C l'enzyme congélateur (le congélateur avec contrôle de température critique et sans fonction de dégivrage automatique). Les anticorps primaires énumérées dans le tableau 1 du travail après le traitement MeOH 100%. </li><li> Peler la peau hors de la patte avant en utilisant une pince à épiler fine. La peau du membre, quand déshydraté, devrait se séparent facilement de la branche. Placez d'abord le membre avec la face ventrale (côté paume) vers le haut. Ensuite, en utilisant une pince à épiler fine, couper la peau comme le montre la vidéo. Suivant disséquer autour du membre entier, desquamation de la peau en douceur hors sans aucun dommage. </li></ol> 2. Whole-Mont coloration immunohistochimique de Skins Limb <ol><li> Réhydrater les peaux jambe en polypropylène à fond rond tube de 5ml en incubant à travers la série graduée de MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) pendant 5 min chacune. Notez que l'échange de solutions doit être prudent pour éviter d'endommager les peaux membre. </li><li> Laver deux fois pendant 5 min dans PBT avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à température ambiante. </li><li> Bloquer les peaux de chèvre soit membre avec 10% de sérum / PBS 0,2% TX100 tampon de blocage des anticorps secondaire de chèvre ou de 10% de sérum d'âne / PBS 0,2% TX100 tampon de blocage pour les anticorps secondaires âne pendant 2 heures en mélangeant doucement sur la table de mixage au Nutator la température ambiante. </li><li> Placez les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm de Pétri et le transfert par une pince à anneau dans 2ml-microcentrifugeuse tube avec 800μl d'anticorps primaire (dilution appropriée comme indiqué dans les tableaux) dans le tampon de blocage (soit 10% de sérum de chèvre / PBS 0,2 TX100% ou 10% de sérum d'âne / PBS 0,2% TX100). Incuber les peaux membre avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à 4 ° C pendant la nuit. Notez que plusieurs anticorps primaires provenant d'espèces différentes (par exemple, anticorps monoclonal de rat + anticorps polyclonal de lapin) peuvent être utilisés simultanément. </li><li> Le lendemain, place les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm et le transfert de Petri par une pince à anneau en polypropylène de 5 ml à fond rond tube avec 4 ml de tampon de lavage (soit 2% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 2 TX100 % âne sérum / PBS 0,2% TX100). </li><li> Lavez cinq fois pendant 15 min en mélangeant doucement sur la table de mixage Nutator à température ambiante. </li><li> Placez les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm de Pétri et le transfert par une pince à anneau dans 2ml-microcentrifugeuse tube avec 800μl d'anticorps secondaire dans le tampon de blocage (soit 10% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 10% TX100 âne sérum / PBS 0,2% TX100). Typiquement, nous utilisons des anticorps secondaires de Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 dilutions) ou Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 dilution). Filtrer la solution d'anticorps secondaire en utilisant les filtres 0.22μm PVDF seringue membrane pour éliminer les particules agrégées de l'anticorps secondaire. Incuber les peaux des membres dans l'obscurité ou enveloppés de papier d'aluminium pendant 1 heure avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à température ambiante. Notez que différents anticorps secondaires conjugués fluorescents provenant d'espèces différentes peuvent être utilisées simultanément. </li><li> Placez les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm de Pétri et le transfert par une pince à anneau en polypropylène à fond rond tube de 5ml avec 4ml de tampon de lavage (soit 2% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 2% TX100 âne sérum / PBS 0,2% TX100). Lavez cinq fois pendant 15 min dans le noir ou enveloppés de papier d'aluminium en mélangeant doucement sur la table de mixage Nutator à température ambiante. </li><li> (Option pour une contre-coloration contre le noyau) Incuber les peaux membre avec 4ml de tampon de lavage (soit 2% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 2% TX100 âne sérum / PBS 0,2% TX100) avec A-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 dilution) dans le noir ou enveloppés de papier d'aluminium pendant 10 min en mélangeant doucement sur la table de mixage à la salle Nutator temre. Ensuite, laver trois fois pendant 5 min avec 4ml de tampon de lavage (soit 2% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 2% TX100 âne sérum / PBS 0,2% TX100) dans l'obscurité ou enveloppés par des feuilles d'aluminium en mélangeant doucement sur le le mélangeur Nutator à température ambiante. Notez que la coloration forte et spécifique pour les noyaux est observé pour TO-PRO-3 dans une émission spécifique (excitation HeNe nm 633). </li></ol> 3. Montage du Skins Limb à la diapositive <ol><li> Placez les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm de Pétri. Retirez les poussières, cristaux, fibres de la couche interne de la peau en utilisant une pince à épiler amende en vertu du stéréomicroscope avec éclairage basse pour éviter la photo blanchissement. </li><li> Transférer les peaux branche à lame de microscope par un adhésif pinces. Placez les peaux avec la couche interne couché à la hausse sur la diapositive (c'est à dire vers la lamelle). Aplatir les peaux attentivement l'aide de pinces fines et retirer le report du tampon de lavage par Kimwipe. </li><li> Monter dans les médias anti-fade montage sans bulles d'air. Nous utilisons 25 "x25" lamelle. Cure sur une surface plane dans l'obscurité (par exemple, les échantillons montés à l'aide de réactifs Prolongez l'or sont placés la nuit dans l'obscurité à température ambiante avant de visualisation). Pour stockage à long terme, sceller la lamelle sur la lame et stocker à 4 ° C. </li></ol> 4. Microscopie confocale <ol><li> Mettre en place des lasers appropriés pour les fluorophores. Nous utilisons Leica TCS SP5 microscope confocal avec trois sources laser Argon dont 488nm (pour Alexa Fluor 488 et GFP), DPSS 561nm (pour Alexa Fluor 568 et Cy3) et HeNe 633nm (pour Alexa Fluor 633, Cy5 et A-Pro-3) . </li><li> Utilisez l'outil de scan séquentiel pour éviter ou réduire la diaphonie dans lequel tous les colorants dans les échantillons de double ou triple-tachés seront excités au même moment. Dans le mode de scan séquentiel, les images seront enregistrées dans un ordre séquentiel. </li><li> Des informations plus générales sur les colorants fluorescents et des lasers pour l'excitation peut être créée en «microscopie confocale pour les biologistes» par Hibbs (2004) </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Whole montage de microscopie confocale triple label immnofluorescence chez la souris forelimb peau à E15.5 avec des anticorps pour le marqueur de cellules endothéliales pan-PECAM-1 (figure 1A-C, D bleu), le marqueur de neurofilaments 2H3 (figure 1A vert), et le bon marqueur de cellules musculaires αSMA (figure 1A, B rouge) a révélé un aspect caractéristique de branchement des artères + αSMA, aligné avec 2H3 + nerfs périphériques dans la peau des membres. En plus de ramifications des vaisseaux sanguins, ce modèle vascularisation des membres peau est utilisée pour étudier la structuration des vaisseaux lymphatiques de branchement en utilisant des anticorps dirigés contre le marqueur de cellules endothéliales lymphatiques LYVE-1 (figure 1D, E rouge) et Neuropilin2 (NRP2) (figure 1D, F verte ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. (Ca) Artères aligner avec les nerfs périphériques dans la peau membres de l'embryon. Whole montage triple label microscopie confocale immnofluorescence avec des anticorps pour le marqueur de cellules endothéliales pan-PECAM-1 (AC, bleu), le marqueur de neurofilaments 2H3 (A, vert), et la douceur des cellules musculaires marqueurs αSMA (A et B, rouge ) est montré. À E15.5, 2H3 + nerfs périphériques (flèches ouvertes) associer à des artères (flèches) qui sont couverts par αSMA + cellules musculaires lisses. Vascularisation lymphatique (DF) dans la peau membres de l'embryon. Triple-label microscopie confocale immnofluorescence avec des anticorps pour le marqueur de cellules endothéliales pan-PECAM-1 (D, bleu), le marqueur de cellules endothéliales lymphatiques LYVE-1 (D et E, rouge) et Neuropilin2 (NRP2) (D et F, vert ) est montré. Les vaisseaux lymphatiques sont visualisés par les deux LYVE-1 et NRP2, alors LYVE-1 est également exprimée par un sous-ensemble des macrophages (flèches ouvertes). Barre d'échelle: 100 microns.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

Le système vasculaire est crucial pour le développement des organes pendant l&#39;embryogenèse ainsi que pour l&#39;entretien des organes et des fonctions de reproduction chez les adultes, car il fournit suffisamment d&#39;oxygène et de nutriments aux organes. Une bonne réseau vasculaire est bien établie avec des processus complexes et multi-étapes par l&#39;angiogenèse dans lequel pré-existante du réseau capillaire est réorganisée avec des structures très ramifiées et hiérarchique. Bien que de nombreux travaux ont démo...

Anticorps Marqueur des cellules endothéliales pan- <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Hamster arménien (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> Dilution 1:100 # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300 dilution </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 dilution </td></tr><tr><td> Le collagène IV </td><td> Lapin (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 dilution # 2 </td></tr></tbody></table> Artérielle marqueur des cellules endothéliales <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Lapin (P) </td><td> Le Kolodkin Alex Lab # 3 </td><td></td><td> 1:3000 dilution </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Chèvre (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> 1:200 dilution </td></tr></tbody></table> Marqueur de cellules endothéliales veineuses <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Chèvre (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> Dilution 1:100 </td></tr></tbody></table> Marqueur des cellules endothéliales lymphatiques <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Lapin (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Lapin (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> Dilution de 1:1000 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Chèvre (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> Dilution 1:50 </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Lapin (P) </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 3366 </td><td> 1, 100 de dilution </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Hamster syrien (M) </td><td> Hybridomes Bank </td><td> 8.1.1 </td><td> 1:200 dilution </td></tr></tbody></table> Lisse des cellules musculaires / péricytes marqueur <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Souris (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> 1:500 dilution # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Lapin (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Lapin (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> 1:200 dilution </td></tr></tbody></table> Anticorps pour rapporteur GFP <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Lapin (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 dilution </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai Tesque </td><td> 04404-84 </td><td> Dilution de 1:1000 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Chick (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 dilution </td></tr></tbody></table> Anticorps pour rapporteur LacZ <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Lapin (P) </td><td> MP Biomédical </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 dilution </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chèvre (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500 dilution </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chick (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> 1:200 dilution </td></tr></tbody></table> Anticorps pour axone périphériques <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Espèces </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Conditions de travail </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Souris (M) # 7 </td><td> Hybridomes Bank </td><td> 2H3 </td><td> 1:200 dilution </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Souris (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> 1:500 dilution </td></tr><tr><td> Périphérine </td><td> Lapin (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> Dilution de 1:1000 </td></tr></tbody></table> Anticorps pour la migration des cellules de Schwann <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Lapin (P) </td><td> Le laboratoire de Thomas Müller # 9 </td><td></td><td> 1:3000 dilution </td></tr></tbody></table> (P): anticorps polyclonal, (M): anticorps monoclonal # 1: chèvre anti-arménienne de hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) anticorps doit être utilisé comme anticorps secondaire. # 2: L&#39;anticorps de collagène IV peut être utilisé pour détecter des vaisseaux sanguins après l&#39;hybridation in situ. # 3: L&#39;anticorps Neuropilin1 est aimablement fourni par le laboratoire de l&#39;Kolodkin Alex à l&#39;Université Johns Hopkins. Sheep anticorps anti-humain Neuropilin1 est disponible en R &amp; D (AF3870), bien que nous n&#39;avons pas encore testé. # 4: Les anticorps LYVE-1 également détecter un sous-ensemble des macrophages dans la peau embryonnaire. # 5: L&#39;anticorps anti-IgG2a de souris αSMA est un anticorps monoclonal. # 6: L&#39;anticorps conjugué Cy3 αSMA est incubé pendant 1 heure à température ambiante avec s.Anticorps secondaires pour d&#39;autres anticorps primaires. # 7: 2H3 anticorps est la souris anticorps monoclonal IgG1 contre les neurofilaments. # 8: Tuj1 anticorps est IgG2a de souris d&#39;anticorps monoclonaux contre le neurone-spécifique de classe III bêta-tubuline. # 9: Le BFABP (cerveau-spécifiques d&#39;acides gras binding protein) antibody est aimablement fourni par le laboratoire de l&#39;Müller Thomas à Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.

whole-mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-Mont analyse immunohistochimique pour l&#39;imagerie du système vasculaire entier est essentielle pour la compréhension des mécanismes cellulaires de ramification morphogenèse. Nous avons développé le modèle de la vascularisation des membres de peau pour étudier le développement vasculaire dans lequel un pré-existante primitive plexus capillaire est réorganisée dans un réseau hiérarchiquement ramifiée vasculaire. Whole-Mont microscopie confocale avec étiquetage multiple permet pour l&#39;imagerie des vaisseaux sanguins robustes intactes ainsi que leurs composants cellulaires dont les cellules endothéliales, péricytes et cellules musculaires lisses, en utilisant des marqueurs fluorescents spécifiques. Les progrès dans ce modèle la vascularisation des membres peau avec des études génétiques ont permis d&#39;améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires du développement vasculaire et les motifs. Le modèle vascularisation des membres peau a été utilisée pour étudier comment les nerfs périphériques fournissent un modèle spatial pour la différenciation et la structuration des artères. Cet article décrit un protocole vidéo simple et robuste pour colorer les vaisseaux sanguins intacts avec des anticorps spécifiques et vasculaires anticorps secondaires fluorescents, qui est applicable pour les organes embryonnaires vascularisées où nous sommes en mesure de suivre le processus du développement vasculaire.

Nous introduisons une immunohistochimie toute monture et laser microscopie confocale à balayage avec un étiquetage multiple pour analyser la formation de complexes réseau vasculaire dans la peau de souris membres de l&#39;embryon.

Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

L'analyse immunohistochimique sur montage entier pour l'imagerie de l'ensemble du système vasculaire est essentielle pour comprendre les mécanismes cellulaires de la morphogenèse branchante. Nous avons développé le modèle de vascularisation cutanée du membre pour étudier le développement vasculaire, dans lequel un plexus capillaire primitif préexistant est réorganisé en un réseau vasculaire branché de manière hiérarchique. La microscopie confocale sur montage entier avec marquage multiple permet une imagerie robuste des vaisseaux sanguins intacts ainsi que de leurs composants cellulaires, notamment les cellules endothéliales, les péricytes et les cellules musculaires lisses, en utilisant des marqueurs fluorescents spécifiques. Les avancées de ce modèle de vascularisation cutanée du membre, associées à des études génétiques, ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires du développement et de la structuration vasculaires. Le modèle de vascularisation cutanée du membre a été utilisé pour étudier comment les nerfs périphériques fournissent un modèle spatial pour la différenciation et la structuration des artères. Cet article vidéo décrit un protocole simple et robuste pour colorer des vaisseaux sanguins intacts avec des anticorps spécifiques du système vasculaire et des anticorps secondaires fluorescents, lequel est applicable aux organes embryonnaires vascularisés où nous sommes en mesure de suivre le processus de développement vasculaire.

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une analyse immunohistochimique en montage entier afin d'obtenir une image de l'ensemble du système vasculaire dans la peau en développement du membre. Cela est réalisé en prélevant d'abord quatre membres à partir de l'embryon, en fixant ces quatre membres dans du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS, puis en les déshydratant dans du méthanol 100 %. La deuxième étape consiste à utiliser de fines pincettes pour détacher la peau à la base du membre.Suivez les lignes pointillées bleues et détachez la peau dans une boîte contenant du méthanol à 100 %. Retirez la peau du membre. Ensuite, une coloration immunohistochimique avec des anticorps primaires spécifiques des vaisseaux sanguins et des anticorps secondaires fluorescents est réalisée sur la peau du membre.Enfin, la microscopie confocale sur prélèvement entier avec marquage multiple permettra une imagerie robuste de l'ensemble du réseau vasculaire de la peau du membre, ce qui constitue un avantage par rapport aux méthodes existantes telles que l'analyse histologique par comptage en coupe transversale. Contrairement au sectionnement embryonnaire, l'analyse immunohistochimique sur prélèvement entier du réseau vasculaire de la peau du membre nous permet non seulement d'imagée l'ensemble du réseau vasculaire, y compris ses composants cellulaires, mais aussi d'étudier les processus de différenciation et le dessin structural des cellules des vaisseaux sanguins ainsi que la ramification des vaisseaux lymphatiques. Nous démontrons ici la procédure conjointement avec DA, postdoctorante de mon laboratoire. Les peaux embryonnaires de membre sont prélevées chez des souris femelles gestantes.Après avoir retiré et lavé l'utérus, travaillez sous un microscope stéréoscopique pour séparer et disséquer les embryons. Une fois les embryons disséqués, l'étape suivante consiste à retirer les quatre membres des embryons à l'aide de fines pinces. Coupez les quatre membres au niveau de l'épaule, puis utilisez une pince en anneau pour transférer les quatre membres dans une plaque de 24 puits contenant de la glace.Placer deux pattes dans deux millilitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS, frais et froid, par puits. Fixer les pattes à 4 % de PFA avec un mélange doux sur un agitateur rotatif à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, retirer le PFA de chaque puits et ajouter deux millilitres de PBS.Laver les échantillons pendant cinq minutes avec un mélange doux sur le mélangeur rotatif à température ambiante. Répéter ce lavage deux fois pour un total de trois lavages. Ensuite, transférer les quatre membres dans un tube conique en polypropylène de cinq millilitres contenant du méthanol à 100 %, puis stocker à moins 20 degrés Celsius dans un congélateur à température contrôlée, sans fonction de dégivrage automatique. Après une nuit de stockage à moins 20, la peau peut être décollée du tissu sous-jacent.Ceci est l'un des aspects les plus critiques de cette procédure, car la réussite des étapes ultérieures de coloration et d'imagerie dépend de la préservation intacte des peaux. La peau du membre se détache facilement du membre lorsqu'elle est déshydratée de cette manière, permettant ainsi de retirer la peau des quatre membres. Placez d'abord le membre avec le côté ventral vers le haut.Ensuite, à l’aide de fines pinces, disséquer la peau près de la base du membre en direction de la patte selon une ligne droite. Puis, disséquer tout autour du membre, en retirant la peau au fur et à mesure que vous tournez le membre. Une fois que la peau a été entièrement retirée.Les quatre membres commencent la coloration immunohistochimique en montage complet des peaux des membres à préparer au préalable. Préparez trois tubes de 50 millilitres contenant respectivement du méthanol à 75 %, 50 % et 25 % dans du PBT pour la réhydratation. Les peaux, c’est-à-dire les peaux des membres, sont réhydratées par incubation dans une série progressive de méthanol, en passant des concentrations les plus élevées à celles les plus faibles, pendant cinq minutes chacune.Pour commencer, transférez la peau du membre dans un tube conique en polypropylène de cinq millilitres contenant du méthanol à 75 % dans du PBT. Après cinq minutes sur le mélangeur agitateur, aspirez soigneusement le méthanol à 75 % et remplissez à nouveau avec du méthanol à 50 % dans du PBT. Cinq minutes plus tard.Remplacer le méthanol à 50 % par du méthanol à 25 % et du PBT. À la fin de l'incubation finale, aspirer soigneusement le mélange méthanol 25 % PBT et le remplacer par du PBT.Laver les peaux des membres pendant cinq minutes avec un mélange doux sur le mélangeur mutator à température ambiante. Répéter ce lavage une fois. Veiller à ne pas endommager les peaux des membres lors du changement des solutions.Une fois les peaux des membres réhydratées, les bloquer avec le tampon de blocage approprié. Incuber pendant deux heures avec un mélange doux sur le mélangeur nutator à température ambiante. Après deux heures, placer les peaux des membres dans une boîte de Pétri de 35 par 10 millimètres. Ensuite, utiliser une pince en anneau pour transférer les peaux dans un tube Eppendorf de deux millilitres contenant 800 microlitres d'anticorps primaires dilués dans le tampon de blocage approprié.Ici, plusieurs anticorps primaires provenant d'espèces différentes peuvent être utilisés simultanément. Incubez les peaux de membres avec un mélange doux sur le mélangeur rotatif à quatre degrés Celsius pendant la nuit ; le jour suivant, placez les peaux de membres dans une boîte de Pétri de 35 par 10 millimètres. Transférez les peaux dans un tube conique en polypropylène de cinq millilitres contenant quatre litres du tampon de lavage approprié.Laver cinq fois pendant 15 minutes chacun avec un mélange doux sur le mélangeur agitateur à température ambiante. Remplacer soigneusement le tampon utilisé par du tampon neuf à chaque lavage pendant les étapes de lavage. Préparer les anticorps secondaires pour éliminer les particules agrégées des anticorps secondaires.Utilisez un filtre à seringue à membrane en PVDF de 0,22 micron pour filtrer la solution d'anticorps secondaire dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez l'échantillon filtré à 15 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin d'éliminer les particules et les bulles d'air. Récupérez la solution d'anticorps filtrée dans un tube Eppendorf micro de deux millilitres.Une fois les cinq lavages terminés, placer les peaux de membres dans une boîte de Pétri de 35 par 10 millimètres et les transférer dans un tube microfuge de deux litres contenant 800 microlitres d'anticorps secondaires dans le tampon de blocage. Différents anticorps secondaires conjugués à des fluorochromes, provenant d'espèces différentes, peuvent être utilisés simultanément lors de cette étape. Incuber les membres et les peaux à l'abri de la lumière pendant une heure, avec un mélange doux sur le mélangeur mutator, à température ambiante.Après une heure d'incubation, placer les peaux de membres dans une boîte de Pétri de 35 par 10 millimètres et les transférer dans un tube conique en polypropylène de cinq millilitres contenant quatre millilitres de tampon de lavage approprié. Laver cinq fois pendant 15 minutes chacun, à l'abri de la lumière, avec un mélange doux sur le mélangeur Tator à température ambiante pour l'imagerie par microscopie confocale. Les peaux de membres doivent être montées sur une lame après la coloration immunohistochimique.Pour commencer cette procédure, placez les peaux de membres colorées dans une boîte de Pétri de 35 par 10 millimètres, en travaillant sous un microscope stéréo avec un éclairage faible. Afin d'éviter un blanchiment photo excessif, utilisez de fines pinces pour retirer les cristaux de poussière et les fibres de la couche interne des peaux. Transférez les peaux de membres sur une lame de microscopie adhésive.Placer les peaux avec la couche interne vers le haut sur la lame, face au coverslip. Ensuite, aplatir soigneusement les peaux à l'aide de pinces fines. Éliminer le tampon de lavage résiduel à l'aide d'un essuie-tout Kim.Ajouter le milieu de montage Antifa sur les peaux et placer une lame couvre-objet de 25 par 25 sur les spécimens. Veiller à ne pas introduire de bulles d'air et laisser durcir sur une surface plane à l'abri de la lumière à température ambiante pour un stockage à long terme des spécimens. Sceller la lame couvre-objet sur la lame porte-objet avec du vernis à ongles et conserver à quatre degrés Celsius.Le dessin des nerfs et des vaisseaux sanguins chez la souris au niveau de la peau des membres à E15,5 est illustré par ces résultats représentatifs d'une microscopie confocale triple marquage en immunofluorescence sur préparation entière. Le marqueur pan-endothélial pcam est en bleu. Le marqueur des neurofilaments 2H3 est en vert, et le marqueur des cellules musculaires lisses α-SMA est en rouge. Ces images révèlent un schéma de branchement caractéristique des artères positives pour α-SMA, indiqué par une flèche blanche, alignées avec les nerfs périphériques marqués par 2H3, indiqués par des flèches creuses, en plus du branchement des vaisseaux sanguins.Ce modèle de vascularisation de la peau des membres peut également révéler le schéma de ramification des vaisseaux lymphatiques en utilisant le marqueur des cellules endothéliales lymphatiques LYVE-1, en rouge, et Neuropiline-2, en vert. Les vaisseaux lymphatiques sont visualisés par LYVE-1 et NRP-2, tandis que LYVE-1 est également exprimé par un sous-ensemble de macrophages, indiqué par les têtes de flèches ouvertes. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs en biologie vasculaire pour explorer les processus complexes de schématisation et de différenciation de la vascularisation au cours du développement tissulaire, de la réparation tissulaire et dans les conditions pathologiques.

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