Name: Piège chromosomes associés pour identifier les interactions ADN à longue distance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Découvrez la méthode ACT pour identifier les interactions ADN à longue distance dans les cellules de leucémie promyélocytaire humaine. Cette technique révèle l'architecture nucléaire et la régulation de l'expression génique.

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Nous remercions Adelle Murell et Wolf Reik beaucoup pour le partage de leur protocole 3C. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense et le Service de recherche du ministère des Anciens Combattants.

1. Fixation de formaldéhyde des interactions chromatine longue portée <ol><li> Lignée cellulaire humaine Culture HL-60 au milieu RPMI1640 avec 15% de FBS et 1 x pénicilline / streptomycine à 80-90% de confluence dans un incubateur fourni avec 5% de CO 2 à 37 ° C. </li><li> Recueillir les cellules dans un tube de 50 ml Nunc, centrifuger à 1200 rpm pendant 15 minutes, puis retirez le support par aspiration </li><li> Ajouter 5 ml de milieu de culture pour remettre les culots cellulaires, et de compter les cellules en utilisant un hématimètre. Prenez environ 1 x 10 7 cellules pour un volume de 40 ml avec FBS RPMI1640 / 10%, puis ajouter 1,7 ml de formaldéhyde à 37% de fixer la chromatine diluer. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 10 minutes en remuant doucement, puis trempe avec 2,4 ml de 2M glycine. Centrifuger pendant 15 minutes à 1200 rpm à 4 ° C, et retirer le surnageant. Laver le culot une fois avec 40 ml PBS glacé, puis le culot spin bas et retirer le CPE. </li></ol> 2. La lyse cellulaire à isoler les noyaux <ol><li> Resuspendre les cellules dans 40 ml de tampon de lyse de la glace froide (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, NaCl 10 mM, 0,2% NP-40) avec des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutée (1:500 dilution) et 0,1 mM PMSF. Incuber dans une chambre froide avec une rotation de 90 minutes, centrifuger à 2500 rpm pendant 15 minutes, et retirer le surnageant. </li></ol> 3. La digestion par enzyme de restriction avec Bgl II <ol><li> Resuspendre les noyaux dans 0,5 ml d'une mémoire tampon x ONE 3, et ajouter 15 μlof SDS à 10%. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure en agitant, puis ajouter 45 ul de 20% de Triton X-100 pour séquestrer le SDS. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure avec agitation. </li><li> Utilisez une aliquote de 1 x 10 6 noyaux (environ 15 mg, soit un dixième des cellules d'origine) pour la digestion des enzymes de restriction. Sortez 55 pi de solution de noyaux de l'étape 3.1 et compléter à 500 ul avec 433 ul de 1 x ONE tampon 3 et 12 pl d'Bgl II (50U/ul). Incuber à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 4. La ligature des segments d'ADN interagissant <ol><li> Inactiver les enzymes de restriction en ajoutant 95 ul de 10% de SDS, et dénaturer par chauffage à 65 ° C pendant 20 minutes dans un bain d'eau. </li><li> Ajouter 7 ml de tampon de ligation 1 x (30 mM Tris-HCI, pH 8,0, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM) et 360 ul de 20% de Triton X-100 et incuber à 37 ° C pendant 1 heure . </li><li> Baisser la température à 16 ° C et ajouter 50 l de 400 U / ul ADN ligase T4. Incuber l'échantillon à 16 ° C pendant 4 heures puis à température ambiante pendant 30 minutes. </li></ol> 5. Purification d'ADN <ol><li> Ajouter 300 ug de la protéinase K, et incuber à 65 ° C pendant la nuit. </li><li> Ajouter 5 ug de RNase A et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes </li><li> Purifier l'ADN par extraction au phénol / chloroforme, et précipiter l'ADN dans l'isopropanol. Dissoudre l'ADN dans 150 ul d'eau distillée stérile. </li></ol> 6. Digestion avec Msp I et ligature avec des lieurs oligonucléotidiques <ol><li> Incuber 2μg d'ADN purifié avec 5 unités de Msp I à 37 ° C pendant 4-6 heures. Inactiver j'ai Msp à 65 ° C pendant 10 minutes, puis précipiter l'ADN dans de l'éthanol avec 1 pi de 5 mg / ml de glycogène. Dissoudre le culot d'ADN dans 50 ul d'eau distillée stérile. </li><li> Mélanger 50 pl de Msp I-traitée ADN avec 2 pi d'un L 20 uM oligonucléotidiques linker (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 pl d'une 20 oligonucléotidiques uM S (5'-cggtgaatc-3'), 1 pl de l'eau distillée stérile et 6 pl d'ADN de 10 x tampon ligase T4. Couvrir le mélange avec de la cire liquide. </li><li> Oligonucléotides Dénaturer à 50 ° C pendant 1 minute et laisser refroidir progressivement à 10 ° C dans un 0,5 ° C / minute gradient dans un cycleur thermique. </li><li> Ajouter 1 l de 400 U / ul ADN ligase de T4 et incuber à 15 ° C pendant la nuit. Purifier l'ADN linker-ligaturés en utilisant un kit QIAquick PCR Purification, et éluer dans 50 ul d'eau distillée stérile. </li></ol> 7. Amplification par PCR et analyse de séquences <ol><li> Choisissez une amorce pour la région spécifique de l'ADN que vous voulez examiner pour interactions à longue portée (c'est à dire, le «appât»). Dans cet exemple, nous utilisons ABL-1. </li><li> Prendre 1 pl de l'ADN purifié pour effectuer le premier tour de PCR utilisant 1 pl de 20 pM ABL -1 amorces spécifiques # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 pl de 20 pM linker amorces spécifiques # 2963 (5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3μl de 3 x Klen Taq polymérase ADN I cocktail et 3 ul d'eau distillée stérile. Deux ul de 32 P-dCTP est ajouté à 100 ul de 3 x Klen Taq ADN polymérase I cocktail avant l'amplification par PCR. Le cycle thermique pour un démarrage à chaud PCR est de 72 ° C pendant 2 min, 95 ° CFOR 2 minutes, 18 cycles de 95 ° C pendant 20 secondes, 65 ° C pendant 40 secondes, et 72 ° C pendant 1 minute; l'extension finale est effectué à 72 ° Cpendant 5 minutes. </li><li> Purifier le premier tour des produits de PCR utilisant un kit QIAquick PCR Purification, et l'ADN éluer dans 30 ul d'eau distillée stérile. </li><li> Prendre 1 l de 100 x diluée premier produit de PCR pour effectuer un deuxième tour de PCR utilisant des amorces imbriquées en ajoutant 1 pl de 20 pM ABL-1 amorces spécifiques # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (figure 1a), 1 pl de 20 uM d'amorces spécifiques linker # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 pi de 3 x Klen Taq polymérase ADN I cocktail et 3 ul d'eau distillée stérile. Le calendrier des cycles thermiques est de 25 cycles de 95 ° C pendant 20 secondes, 67 ° C pendant 40 secondes, et 72 ° C pendant 1 minute, puis par extension à 72 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Visualisez les produits de PCR en exécutant un 5% d'urée-PAGE sur gel et la numérisation de l'écran exposé dans un Phosphoimager (figure 1b). Chaque bande de PCR peuvent être recyclés à partir du gel par la dissolution des bandes de gel dans un tube Eppendorf contenant 60 ul d'eau distillée stérile, et l'incubation à 95 ° C pendant 5 minutes. Centrifuger brièvement à 10000 rpm pendant 10 sec pour collecter tous les échantillons. Retirer 1 pl pour l'utiliser comme matrice d'ADN pour effectuer la PCR avec le couple d'amorces 2961/4626 en utilisant les mêmes conditions que décrites ci-dessus. L'analyse des séquences peut être effectuée après purification utilisant un kit QIAquick PCR Purification. </li><li> Séquences d'ADN sont analysés en utilisant un outil en ligne pour déterminer leur localisation chromosomique sur le site web: http://genome.ucsc.edu (figure 1c). Cliquez sur "BLAT 'pour entrer dans une nouvelle fenêtre qui permet de coller une séquence d'ADN, une nouvelle fenêtre apparaît après avoir cliqué sur« soumettre », et montre les« Résultats de la recherche BLAT ». Cliquez sur "navigateur" de la frapper avec 100% d'identité pour entrer dans une fenêtre de côté pour montrer l'emplacement de la séquence d'ADN. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs 1. Test ACT utilisant ABL-1 région comme appât afin de déterminer sa longue interactions ADN large Comme illustré dans la figure 1a, deux sites Bgl II et un site BamH I ont été choisis pour le dosage de l'ACT. Dans le second cycle de PCR, l'amorce mis 4626/2961 a été utilisé pour amplifier ABL-M1, 4630/2961 a été utilisé pour ABL-M2 et 4636/2961 a été utilisé pour ABL-M3. Un motif de gel typique montre un à plusieurs bandes (figure 1b). Chaque fragment d'un test ACT est constitué de deux segments d'ADN combinés: un segment est dérivée de la région d'ADN appâts, tandis que le second segment provient du partenaire associé, qui a été rejoint au segment région appât par la séquence de reconnaissance d'enzyme de restriction premier. La séquence deuxième enzyme de reconnaissance apparaîtra à la fin de la séquence des partenaires associés (figure 1c). Le cloné ABL-M1 fragment contient l'ADN de la région de ABL1 situé sur le chromosome 9q32.4 partir +133,592,306-133,592,399, et le partenaire associé est situé au chromosome 3p13 +71,869,882-71,870,107. L'identité des partenaires associés sont découverts par le dynamitage de leurs séquences en utilisant le navigateur du génome UCSC (GRCh7/hg19 publié en Février 2009). PROK2 a été identifié comme le partenaire associé au locus chr3p13. De même, le partenaire ABL-M2 associé a été localisé à chr5q21.1, tout clone ABL-M3 a été identifiée comme une association intra-chromosomique à proximité de l'ABL-1 locus. 2. Déterminer moins répandue interactions à longue portée utilisant test ACT D'autres essais basés sur 3C ont rapporté beaucoup plus de partenaires que les interactions que nous avons montré dans la figure 1 et à l'IGF2 / H19 le locus 12. La méthodologie que nous avons décrites sélectionnera les interactions les plus répandues de longue portée. Cependant, en augmentant le nombre de cycles de PCR, il est possible d'identifier d'autres, les associations moins fréquentes aussi bien (figure 2). 3. Les différences dans les interactions à longue portée dans les cellules cancéreuses par rapport aux tissus normaux. Le test ACT peut aussi être utilisé pour identifier les différences dans l'architecture nucléaire et les interactions à longue portée entre les cellules normales et les cellules cancéreuses (figure 3). Ces différences peuvent refléter des changements d'architecture nucléaire qui se produisent pendant la transformation cellulaire, et donc ce test pourrait finalement être applicables à des fins diagnostiques. Les modèles de gel similaires qui se produisent dans les deux normaux et tissus cancéreux ont indiqué que le test ACT est fiable et reproductible. Alors que le test ACT peut identifier l'ADN des partenaires à long gamme, des analyses supplémentaires, tels que les poissons et les analyses de ChIP, sont tenus de vérifier la présence des associations identifiées entre loci lointain. Des études génétiques, physiologiques et biochimiques peuvent alors être effectuées pour élucider les implications biologiques de ces associations à long ADN gamme. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure test ACT 1 en utilisant ABL-1 région comme appât dans l'ADN cellules HL-60. a. Struct ADNUre de ABL-1 région. L'enzyme de restriction d'abord utilisé dans ACT dosage était Bgl II. Les amorces pour le deuxième tour de PCR sont également marqués par des flèches et des numéros amorce correspondant. b. Motif de gel de l'essai ACT dans 5% d'urée-PAGE. La paire d'amorces 4626/2961 a été utilisé pour amplifier clone ABL-M1 à la PCR nichée, 4630/2961 a été utilisée pour cloner ABL-M2 et 4636/2961 a été utilisée pour cloner ABL-M3. C. Séquence d'ADN du clone ABL-M1. Fragment d'ADN de l'ADN-1 ABL appât est étiqueté en rouge, et le partenaire d'ADN associées est étiqueté en cyan. BglII site (AGACTC) a été marqué en vert, et le site Msp I (CCBG) est étiquetée en violet. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 cycles de PCR affecter les résultats d'essai ACT. Utilisation de la région de contrôle impression (ICR) au niveau du locus Igf2/H19 que l'ADN d'appât dans les cellules de fibroblastes de souris, programmes de cyclisme différents ont été appliqués dans les premier et deuxième tours de la PCR dans le dosage de l'ACT. 18-20 cycles dans le premier cycle de PCR n'a pas amplifier le signal suffisant pour être visualisées. Vingt cinq cycles dans les résultats de la PCR deuxième bandes claires, tout en augmentant le nombre de cycles pour le deuxième tour de PCR induit un modèle de diffamation, en plus de plusieurs bandes. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 Détection des différences dans l'architecture nucléaire entre les tissus du côlon normal et le tissu du cancer du côlon dans l'essai ACT. A. Structure de l'ADN de la région de l'ICR au IGF2/H19 locus et le gène IGF2. Dpn les sites II pour le dosage de l'ACT sont étiquetés. Amorces utilisées dans le second cycle de PCR sont marquées par des flèches et des numéros de différentes couleurs qui correspondent à chaque voie dans le volet B de la figure. b. Motif de gel de l'essai ACT dans 5% d'urée-PAGE. Tissus du côlon normal MAD03-1423 et les tissus du cancer du côlon MAD04-149 a été obtenu à partir de tissus du Réseau coopératif de l'homme (CHTN) Division de l'Ouest. Après chaque tissu du côlon a été homogénéisé, test ACT a été réalisé en suivant les procédures décrites ici. Voie 1 représente les résultats PCR en utilisant la paire d'amorces # # 2961and 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') marqué en rose dans le panneau a; piste 2 représente les résultats de la PCR en utilisant la paire d'amorces # 2961 et # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ») marqué en orange dans le panneau a; piste 3 représente les résultats de la PCR en utilisant la paire d'amorces # 2961 et # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3 ') marqué en bleu dans le panneau a; piste 4 représente les résultats de la PCR en utilisant la paire d'amorces # 2961 et # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') marqué en vert sur le panneau a. Des bandes uniques qui apparaissent uniquement dans les tissus du côlon normal sont étiquetés par des flèches jaunes, et les bandes qui n'est apparu que dans les tissus du cancer du côlon sont étiquetés dans les flèches rouges. ICR, région de contrôle empreinte; DMR, différentes régions méthylées.

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li>
<li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li>
<li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li>
<li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li>
<li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li>
<li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li>
<li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Berkum, N. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2%2FH19+and+Wsb1%2FNf1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%27C%27s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li>
</ol>

Dekker et al. Développée la conformation capture de chromosomes (3C) approche pour détecter la fréquence de l&#39;interaction entre deux locus génomiques 1, et 3C a été largement utilisée pour étudier les associations intra-et inter-chromosomique chromosomiques entre deux régions de l&#39;ADN des cellules de mammifères connues 2 -9. Bien que nouvellement développé Salut-C méthodologie peut être appliquée pour l&#39;étude de l&#39;ADN du génome entier d&#39;association, dosage de loi est encore une technique efficace pour l&#39;étude des interactions ADN spécifiques de locus 10-11. Nous avons modifié cette approche pour identifier les régions d&#39;ADN inconnus qui sont associés à une région d&#39;ADN connues chez la souris et les cellules humaines en culture (figure 1). Nous avons nommé cette méthode, le piège de chromosomes associés (ACT) de dosage, comme il nous a fourni une méthode fiable et reproductible pour identifier de nouveaux partenaires l&#39;ADN inconnu qui associent à une région d&#39;ADN cible connue 12. Un test réussi 3C avec des contrôles appropriés sont effectués avant l&#39;exécution des nouveaux aspects de l&#39;essai ACT 13. Afin tofind que de nombreuses régions d&#39;ADN associées que possible, il est nécessaire d&#39;utiliser différentes combinaisons d&#39;enzymes de restriction premier et deuxième. Il est particulièrement important d&#39;utiliser des enzymes de restriction qui sont insensibles à la méthylation CpG pour effectuer l&#39;étape de ligation premier 3C. La liaison aux protéines et de méthylation de l&#39;ADN peuvent également influer sur l&#39;efficacité de digestion d&#39;enzymes de restriction et peut conduire à l&#39;échec de la ligature des régions d&#39;ADN associées à certaines digestions d&#39;enzyme de restriction. La survenue d&#39;une ligature intra-ou inter-chromosomique dépend de protéine-ADN de réticulation et appropriée des cartes physiques des deux régions d&#39;ADN associées. Ainsi, certaines expériences préliminaires sont indispensables pour établir une concentration de formaldéhyde possible efficace et temps de traitement dans l&#39;essai de l&#39;ACT. Une gamme de concentrations finales de formaldéhyde (from1.5% à 2%) ont été utilisés dans plusieurs laboratoires lors de la partie 3C de l&#39;essai 7,9. Alternativement, les oligonucléotides utilisés comme agents de liaison peuvent être conçus pour correspondre à la fin de cohésion coupé par l&#39;enzyme de restriction secondes. Bien que nous avons constaté que 18 à 20 cycles dans le premier cycle de PCR et 20-25 cycles dans le second cycle de PCR pourrait fournir des bandes claires, il est nécessaire d&#39;établir les meilleures conditions de PCR pour chaque expérience (figure 2). Intra-molécule recuit entre la séquence adaptateur extrémité 5 &#39;et 3&#39;-end complémentaire d&#39;un brin d&#39;ADN peut se produire dans la PCR, il inhibe l&#39;adaptateur amorce spécifique de recuit avec la molécule d&#39;ADN, et conduit à l&#39;efficacité d&#39;amplification beaucoup plus faible dans les premiers cycles de plusieurs. Après l&#39;ADN cible a été amplifié par cycles, son montant peut être beaucoup plus grande que ces réactions non spécifiques, et peuvent faciliter la concurrence des hybridation des amorces à des molécules d&#39;ADN cible. C&#39;est aussi pourquoi nous pouvons voir l&#39;amplification de fond, et pourquoi le premier produit de PCR rondes doit être dilué pour diminuer amplification.It fond est important d&#39;enlever les amorces en excès de la réaction PCR afin de diminuer le fond dans le second cycle de PCR. Comme dans toutes les expériences basées sur la PCR, il est essentiel de concevoir des amorces qui ne sont pas situés dans des régions séquence de répétition, qui constituent la majorité de l&#39;ADN humain et la souris. Bien que nouvellement développé Salut-C méthodologie peut être appliquée pour l&#39;étude de l&#39;ADN du génome entier d&#39;association, dosage de loi est encore une technique efficace pour l&#39;étude des interactions ADN spécifiques de locus.

<table><tbody><tr><td>Milieu RPMI1640</td><td>Invitrogen</td><td>22400-105</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>Invitrogen</td><td>15512-023</td><td></td></tr><tr><td>Solution d'ATP, 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091-039</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>urée</td><td>Invitrogen</td><td>15505-035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;BamH&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bgl&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Dpn&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Msp&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8102S</td><td></td></tr><tr><td>Ligase T4 de l'ADN</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde à 37 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothréitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche Group</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>KlenTaq1</td><td>Ab peptides</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>dCTP alpha P32</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU513H250UC</td><td></td></tr><tr><td>Cycleur thermique PTC-100</td><td>MJ Research</td><td>mjptc100</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation électrique</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td></td></tr><tr><td>OmniPAGE Maxi</td><td>Aurogene Life Science</td><td>VS20D</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr></tbody></table>

piège chromosomes associés pour identifier les interactions adn à longue distance

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

L&#39;information génétique codée par l&#39;ADN est organisé en une structure complexe et très réglementé chromatine. Chaque chromosome occupe un territoire spécifique, qui peut changer selon le stade de développement ou du cycle cellulaire. L&#39;expression des gènes peut se produire dans des usines spécialisées transcriptionnelle où les segments de chromatine peut en boucle à partir de différents territoires chromosomiques, conduisant à la co-localisation des segments d&#39;ADN qui peuvent exister sur les chromosomes différents ou très éloignés sur le même chromosome. Le piège Associated chromosomes (ACT) test fournit une méthodologie efficace pour identifier l&#39;ADN de ces associations à long terme de façon impartiale en étendant et en modifiant la technique de capture des chromosomes conformation. Le dosage de loi rend possible pour nous d&#39;étudier les mécanismes de la régulation transcriptionnelle en trans, et peut aider à expliquer la relation de l&#39;architecture nucléaire à l&#39;expression des gènes dans la physiologie normale et pendant les états pathologiques.

Le piège de chromosomes associés (ACT) dosage est une nouvelle méthode impartiale pour identifier les interactions ADN à longue portée. La caractérisation des interactions ADN à long gamme va nous permettre de déterminer la relation de l&#39;architecture nucléaire à l&#39;expression des gènes dans les deux physiologie normale et dans des états pathologiques.

Piège chromosomes associés pour identifier les interactions ADN à longue distance

L'information génétique codée par l'ADN est organisée selon une structure chromatinienne complexe et hautement régulée. Chaque chromosome occupe un territoire spécifique, ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de découvrir et d'identifier des partenaires d'ADN associés à longue distance. Cette approche est réalisée par une fixation, une lyse cellulaire et une digestion de l'ADN par la première enzyme de restriction, suivie d'une ligature afin de créer un ADN chimérique composé de segments provenant des deux gènes associés. Ensuite, des adaptateurs sont ajoutés à l'ADN chimérique après la seconde digestion par une enzyme de restriction, afin de faciliter son amplification. Une amplification par PCR est alors effectuée à l'aide d'amorces spécifiques aux adaptateurs et à l'ADN cible (« appât »), permettant d'obtenir des quantités suffisantes de fragments d'ADN associés. Les résultats obtenus révèlent les partenaires d'ADN associés à longue distance avec l'ADN appât, sur la base de l'analyse de séquence des fragments d'ADN amplifiés.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le piégeage de la confirmation des chromosomes ou le 3C réside dans le fait que l'ACTSA peut être utilisée pour identifier efficacement un partenaire d'ADN associé à longue distance inconnu, alors que le 3C a été développé pour la vérification d'interactions uniquement déjà suspectées auparavant. Pour commencer ce protocole, cultiver des cellules humaines dans un incubateur alimenté en 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 80 à 90 %.Des cellules de leucémie aiguë promyélocytaire humaines sont utilisées pour cette démonstration. Recueillir les cellules en les versant dans un tube NOC de 50 millilitres et centrifuger à 1200 tr/min pendant 15 minutes. Après la centrifugation, éliminer le milieu par aspiration.Ajoutez cinq millilitres de milieu de culture pour resuspendre les culots cellulaires. Après avoir dénombré les cellules à l'aide d'un hémocytomètre, prélevez environ un fois dix puissance sept cellules et complétez à un volume de 40 millilitres avec le milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Ajoutez ensuite 1,7 millilitre de formaldéhyde à 37 % pour fixer la chromatine diluée.Incuber l'échantillon à température ambiante pendant 10 minutes avec agitation douce. Après l'incubation, arrêter la réaction avec 2,4 millilitres de glycine deux molaire. Ensuite, centrifuger l'échantillon pendant 15 minutes à 1200 tr/min et à quatre degrés Celsius.Après avoir éliminé le surnageant, lavez le culot une fois avec 40 millilitres de PBS glacé, puis centrifugez l'échantillon afin de récupérer le culot cellulaire lavé. Resuspendez le culot obtenu dans 40 millilitres de tampon de lyse glacé contenant des inhibiteurs de protéases fraîchement ajoutés et du PMSF à 0,1 millimolaire. Incubez l'échantillon dans une chambre froide sous agitation rotative pendant 90 minutes. Enfin, centrifugez l'échantillon à 2 500 tr/min pendant 15 minutes, éliminez le surnageant et récupérez les noyaux isolés. Resuspendez les noyaux dans 0,5 millilitre de tampon NEB 1X et ajoutez 15 microlitres de SDS à 10 %.Incuber l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation. Ajouter ensuite 45 microlitres de Triton X-100 à 20 % pour piéger le SDS et incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation, avec un aliquot de un fois 10 à la puissance six. Les noyaux, soit environ 15 microgrammes, sont utilisés pour la digestion par une enzyme de restriction dans 55 microlitres de solution de noyaux.Ajouter 433 microlitres d'un tampon XNEB trois et 12 microlitres de BGL deux. Pour obtenir un volume total de réaction de digestion de 500 microlitres, incuber la réaction à 37 degrés Celsius toute la nuit. Le jour suivant, inactiver l'enzyme de restriction en ajoutant 95 microlitres de SDS à 10 % et dénaturer l'enzyme en chauffant à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes.Dans un bain-marie, ajoutez sept millilitres de tampon de ligature 1 x et 360 microlitres de Triton X-100 à 20 %. Incubez l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure. Abaissez la température à 16 degrés Celsius et ajoutez 50 microlitres de 400 unités par microlitre.Ligasez l'ADN avec la ligase T4. Incubez la réaction de ligature à 16 degrés Celsius pendant quatre heures, puis à température ambiante pendant 30 minutes. Une fois la ligature terminée, ajoutez 300 microgrammes de protéinase K et incubez à 65 degrés Celsius toute la nuit.Ensuite, ajoutez cinq microgrammes de RNAA et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Purifiez l'ADN par extraction au phénol-chloroforme et précipitez l'ADN dans l'isopropanol ; dissolvez l'ADN précipité dans 150 microlitres d'eau distillée stérile. Pour ajouter des linkers à l'ADN chimérique, digérez d'abord l'ADN en incubant deux microgrammes d'ADN purifié avec cinq unités de msp, une à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures. Après la digestion, inactiver MSP une à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, précipitez l'ADN dans l'éthanol avec un microlitre de glycogène à cinq milligrammes par millilitre. Dissolvez le culot d'ADN obtenu dans 50 microlitres d'eau distillée stérile. Puis mélangez 50 microlitres d'ADN traité par MSP1 avec deux microlitres d'un oligonucléotide adaptateur (linker) L à 20 micromolaire et un microlitre d'un oligonucléotide S à 20 micromolaire, ajoutez ensuite un microlitre d'eau distillée stérile et six microlitres de tampon 10 X pour l'ADN ligase T4.Couvrez le mélange avec de la cire liquide. Dénaturez les oligonucléotides à 50 degrés Celsius pendant une minute, puis laissez refroidir progressivement jusqu'à 10 degrés Celsius selon un gradient de 0,5 degré Celsius par minute. À l'aide d'un thermocycleur, ajoutez un microlitre de ligase T4 ADN à 400 unités par microlitre et incubez la réaction à 15 degrés Celsius toute la nuit.Le jour suivant, purifiez l'ADN ligaturé au brin intermédiaire à l'aide d'un kit de purification rapide d'ADN PCR Kaya et élué dans 50 microlitres d'eau distillée stérile. Ensuite, choisissez un amorçage pour la région spécifique d'ADN à étudier en ce qui concerne les interactions à longue distance. Dans cet exemple, Abel sera utilisé comme amorçage ou comme appât.Préparez l'ADN purifié pour la première PCR en combinant un microlitre d'ADN purifié avec un microlitre de 20 micromolaire du premier amorce spécifique, 46 56, et un microlitre de 20 micromolaire de l'amorce spécifique du linker 29 63. Ajoutez ensuite trois microlitres de trois x ClinTech, un cocktail de polymérase ADN préalablement mélangé avec du 32 P-D-C-T-P conformément au protocole écrit, suivi de trois microlitres d'eau distillée stérile. Réalisez l'amplification par PCR en utilisant le cycle thermique PCR à démarrage à chaud décrit dans le protocole écrit après la fin du cycle PCR.Purifiez les produits de la première PCR à l'aide d'un kit de purification rapide PCR Kaya. Élué dans 30 microlitres d'eau distillée stérile. Utilisez un microlitre du produit de la première PCR dilué 100 fois pour effectuer un deuxième tour de PCR en utilisant des amorces imbriquées, en ajoutant un microlitre d'une amorce spécifique à l'aptamère de 20 micromolaire, 46 26, et un microlitre d'une amorce spécifique au linker de 20 micromolaire, 29 61.À nouveau, ajouter trois microlitres de trois x ClinTech, de l'ADN polymérase, un cocktail et trois microlitres d'eau distillée stérile. Réaliser le deuxième cycle de PCR en utilisant un programme de thermocyclage de 25 cycles à 95 degrés Celsius pendant 20 secondes, 67 degrés Celsius pendant 40 secondes et 72 degrés Celsius pendant une minute, suivi d'une extension à 72 degrés Celsius pendant cinq minutes.Visualisez les produits de PCR en faisant migrer un gel PAGE contenant 5 % d'urée, puis en analysant l'écran exposé à l'aide d'un imageur à phosphorimagerie. Chaque bande de PCR peut être récupérée à partir du gel en dissolvant les bandes de gel dans un tube Eppendorf contenant 60 microlitres d'eau distillée stérile et en incubant à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Faites une courte centrifugation des produits de gel dissous à 10 000 tr/min pendant 10 secondes.Pour collecter tous les échantillons. Prélever un microlitre à utiliser comme matrice d'ADN pour réaliser la PCR avec le prime repair. 29 61 46 26.En utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, après la purification, une analyse de séquençage peut être effectuée à l’aide d’un outil en ligne afin de déterminer la localisation chromosomique. Une fois sur le site de bioinformatique génomique, cliquez sur blatt pour ouvrir une nouvelle fenêtre et collez la séquence d’ADN. Après avoir soumis la séquence d’ADN, les résultats de la recherche BLATT s’afficheront.Cliquez sur le résultat présentant une identité de 100 % dans le navigateur pour révéler l'emplacement de la séquence d'ADN. La région able one a été utilisée comme amorces pour déterminer ses interactions d'ADN à longue distance. Deux sites BGL two et un site BAM H one ont été choisis pour le test A CT lors du deuxième tour de jeu d'amorces de PCR ; 46 26 29 61 a été utilisé pour amplifier able M1 ; 46 30 29 61 a été utilisé pour able M two ; et 46 36 29 61 a été utilisé pour able M three.Un profil de gel typique révèle une à plusieurs bandes, comme illustré ici pour les clones able M1, able M2 et able M3. La séquence d'ADN du clone able M1 est présentée afin de démontrer que chaque fragment issu d'un test A CT est constitué de deux segments d'ADN combinés. L'un de ces segments provient de la région d'ADN appât, tandis que le second segment provient du partenaire associé.Les segments sont reliés les uns aux autres par la première séquence de reconnaissance de l'enzyme de restriction. La séquence de reconnaissance de la deuxième enzyme apparaîtra à la fin de la séquence partenaire associée. Le fragment M1 clonable contient de l'ADN provenant de la région ABLE un située sur le chromosome neuf Q 32,4, et le partenaire associé est situé sur le chromosome trois P trois, qui a été identifié comme proc deux.De même, le partenaire associé M deux a été localisé sur le chromosome cinq Q 21,1, tandis que le clone M trois a été identifié comme une association intrachromosomique près du locus ABLE un, contrairement aux essais trois C. La méthodologie décrite dans cette vidéo permettra de sélectionner les interactions à longue distance les plus fréquentes. Toutefois, en augmentant le nombre de cycles de PCR, il est possible d'identifier également des associations supplémentaires, moins fréquentes, en utilisant la région d'empreinte et de contrôle ou ICR du locus IGF deux H 19 comme ADN appât dans des cellules de fibroblaste de souris ; différents programmes de cyclage ont été appliqués lors des premier et deuxième tours de PCR dans l'essai A CT.Le test A CT peut également être utilisé pour identifier les différences dans l'architecture nucléaire et les interactions à longue distance entre les cellules normales et les cellules cancéreuses. Des tissus coliques normaux et des tissus de cancer du côlon ont été homogénéisés, puis le test A CT a été réalisé selon les procédures décrites ici. On observe ici la structure de l'ADN de la région ICR au locus IGF two H 19 et du gène IGF two dpn.Deux sites pour le test A CT sont indiqués ; les amorces utilisées lors de la PCR du deuxième tour sont marquées par des flèches et des numéros de différentes couleurs. Le profil sur gel du test A CT représente les résultats de la PCR utilisant l'amorce 29 61 avec l'une des paires d'amorces suivantes : 41, 61, 41 63, 51 45 et 51 51. Les bandes uniques qui apparaissent uniquement dans le tissu colique normal sont indiquées par des flèches jaunes, tandis que les bandes présentes uniquement dans le tissu de cancer du côlon sont marquées par des flèches rouges après leur mise au point.Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du marché pour explorer l'architecture nucléaire et la régulation des gènes de manière tridimensionnelle.

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