Piège chromosomes associés pour identifier les interactions ADN à longue distance

L’objectif général de l’expérience suivante est de découvrir et d’identifier des partenaires d’ADN associés à longue distance. Ceci est réalisé par la fixation, la lyse cellulaire et la digestion de l’ADN par la première enzyme de restriction suivie d’une ligature pour créer un ADN chimérique composé de segments des deux gènes associés. Ensuite, des linkers sont ajoutés à l’ADN chimérique après la deuxième digestion de restriction Pour faciliter son amplification, l’amplification PCR est ensuite effectuée à l’aide d’amorces spécifiques de l’ADN de liaison et d’appât afin d’obtenir des quantités suffisantes des fragments d’ADN associés Des résultats sont obtenus qui montrent les partenaires d’ADN associés à longue portée avec l’ADN appât sur la base de l’analyse de séquence des fragments d’ADN amplifiés.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la capture de confirmation chromosomique ou trois C, est que A-C-T-S-A peut être utilisé pour identifier efficacement un partenaire d’ADN associé inconnu à longue portée. Alors que trois C ont été créés pour vérifier uniquement les interactions précédemment suspectées. Pour commencer cette culture protocolaire, des cellules humaines dans un incubateur ont été alimentées avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 80 à 90 %.

Des cellules leucémiques acides humaines sont utilisées pour cette démonstration. Collectez les cellules en les versant dans un tube NOC de 50 millilitres et centrifugez-les à 1200 tr/min pendant 15 minutes. Après la centrifugation, retirer le milieu par aspiration.

Ajoutez cinq millilitres de milieu de culture pour remettre en suspension les granules cellulaires. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, prélever environ une fois 10 à la septième cellule pour un volume de 40 millilitres avec du RPMI 1640, un milieu contenant 10 % de FBS. Ajoutez ensuite 1,7 millilitres de formaldéhyde à 37 % pour fixer la chromatine diluée.

Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes en secouant doucement. Après l’incubation, éteignez la réaction avec 2,4 millilitres de glycine à deux molaires. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant 15 minutes à 1200 tr/min et quatre degrés Celsius.

Après avoir retiré le super natin, lavez la pastille une fois avec 40 millilitres de PBS glacé, puis centrifugez l’échantillon pour récupérer la pastille de cellule lavée, remettez en suspension la pastille résultante dans 40 millilitres de tampon de lyse glacé avec des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés et 0,1 millimolaire PMSF incubez l’échantillon dans une chambre froide avec rotation pendant 90 minutes. Enfin, centrifugez l’échantillon à 2 500 tr/min pendant 15 minutes et retirez le super natin et obtenez les noyaux isolés. Remettre les noyaux en suspension dans 0,5 millilitres d’un tampon XNEB trois et ajouter 15 microlitres de 10 % SDS.

Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure en agitant. Ajoutez ensuite 45 microlitres de 20 % Triton X 100 pour séquestrer le SDS et incubez à nouveau à 37 degrés Celsius pendant une heure avec agitation et aliquote d’un fois 10 à la sixième. Les noyaux, soit environ 15 microgrammes, sont utilisés pour la digestion enzymatique de restriction à 55 microlitres de solution de noyaux.

Ajoutez 433 microlitres d’un tampon XNEB trois et 12 microlitres de BGL deux. Pour obtenir un volume total de réaction de digestion de 500 litres, incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, inactivez l’enzyme de restriction en ajoutant 95 microlitres de 10 % de SDS et dénaturez l’enzyme en chauffant à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Dans un bain-marie, ajoutez sept millilitres d’un tampon de ligature x et 360 microlitres de 20 % Triton X 100. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure. Baissez la température à 16 degrés Celsius et ajoutez 50 microlitres de 400 unités par microlitre.

T quatre ADN Ligase. Laissez la réaction de ligature incuber à 16 degrés Celsius pendant quatre heures, puis à température ambiante pendant 30 minutes. Une fois la ligature terminée, ajoutez 300 microgrammes de protéinase K et incubez à 65 degrés Celsius pendant la nuit.

Ajoutez ensuite cinq microgrammes d’ARNA et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Purifier l’ADN par extraction au phénol chloroforme et précipiter l’ADN dans l’isopropanol, dissoudre l’ADN précipité dans 150 microlitres d’eau distillée stérile. Pour ajouter des linkers à l’ADN chimérique, digérez d’abord l’ADN en incubant deux microgrammes d’ADN purifié avec cinq unités de msp, une à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures après la digestion, inactivez MSP un à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, précipitez l’ADN dans l’éthanol avec un microlitre de cinq milligrammes par millilitre. Le glycogène dissout l’ADN du palais résultant dans 50 microlitres d’eau distillée stérile. Ensuite, mélangez 50 microlitres de MSP, un ADN traité avec deux microlitres d’un oligonucléotide L de liaison de 20 micromolaires et un microlitre d’un oligonucléotide S de 20 micromolaires, puis ajoutez un microlitre d’eau distillée stérile et six microlitres de tampon 10 XT quatre ADN Ligase.

Recouvrez le mélange de cire liquide. Dénaturez les oligonucléotides à 50 degrés Celsius pendant une minute et laissez-les refroidir progressivement jusqu’à 10 degrés Celsius dans un gradient de 0,5 degré Celsius par minute. À l’aide d’un thermocycleur, ajoutez un microlitre de 400 unités par microlitre T quatre ADN ligase et incubez la réaction à 15 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, purifiez l’ADN ligaturé à l’aide d’un kit de purification PCR rapide Kaya et éluez-le dans 50 microlitres d’eau distillée stérile. Ils choisissent une amorce pour la région spécifique de l’ADN à étudier pour les interactions à longue portée. Dans cet exemple, Abel sera utilisé comme amorce ou appât.

Préparez l’ADN purifié pour le premier tour de PCR en combinant un microlitre d’ADN purifié avec un microlitre de 20 micromolaires capables d’une amorce spécifique, 46 56, et un microlitre de 20 micromolaires liaison spécifique amorce 29 63. Ajoutez ensuite trois microlitres de trois x ClinTech, ADN polymérase, un cocktail préalablement mélangé avec 32 P-D-C-T-P selon le protocole écrit, suivi de trois microlitres d’eau distillée stérile. Effectuez une amplification PCR à l’aide du cycle thermique PCR de démarrage à chaud décrit dans le protocole écrit une fois le cycle PCR terminé.

Purifiez les premiers produits PCR ronds à l’aide d’un kit de purification PCR rapide Kaya Elute dans 30 microlitres d’eau distillée stérile. Utilisez un microlitre du premier produit PCR dilué 100 fois pour effectuer une deuxième série de PCR à l’aide d’amorces imbriquées en ajoutant un microlitre de 20 micromolaires capables d’une amorce spécifique, 46 26 et un microlitre de 20 micromolaires d’amorce spécifique de liaison de liaison. 29 61.

Encore une fois, ajoutez trois microlitres de trois x ClinTech, de l’ADN polymérase, un cocktail et trois microlitres d’eau distillée stérile. Exécutez le deuxième cycle de PCR à l’aide d’un programme de cycles thermiques de 25 cycles à 95 degrés Celsius pendant 20 secondes. 67 degrés Celsius pendant 40 secondes et 72 degrés Celsius pendant une minute, suivis d’une extension à 72 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Visualisez les produits PCR en exécutant un gel de page à 5 % d’urée, puis en scannant l’écran exposé dans un imageur phospho. Chaque bande PCR peut être recyclée à partir du gel en dissolvant les bandelettes de gel dans un tube einor contenant 60 microlitres d’eau distillée stérile et en incubant à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Centrifugeuse. Le gel dissous produit brièvement à 10 000 tr/min pendant 10 secondes.

Pour collecter tous les échantillons. Prélever un microlitre pour l’utiliser comme matrice d’ADN pour effectuer la PCR avec la réparation principale. 29 61 46 26.

En utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, après purification et séquençage, l’analyse peut être effectuée avec un outil en ligne pour déterminer la localisation chromosomique. Une fois sur le site de bio-informatique du génome, cliquez sur blatt pour générer une nouvelle fenêtre et collez la séquence d’ADN. Après avoir soumis la séquence d’ADN, les résultats de la recherche BLATT apparaîtront.

Cliquez sur le navigateur sur le résultat avec 100 %identity pour révéler l’emplacement de la séquence d’ADN. La région la plus apte a été utilisée comme appât pour déterminer ses interactions ADN à longue portée. Deux sites BGL deux et un site BAM H ont été choisis pour le test A CT dans le deuxième tour de l’ensemble d’amorces PCR, 46 26 29 61 a été utilisé pour amplifier M1 46.30 29 61 a été utilisé pour M deux et 46, 36 29 61 a été utilisé pour M trois.

Un motif en gel typique révèle une à plusieurs bandes, comme on le voit ici pour la capacité M1, la capacité M deux et la capacité M trois ici. La séquence d’ADN du clone capable M1 démontre que chaque fragment d’un test A CT est constitué de deux segments d’ADN combinés. Un segment est dérivé de la région de l’ADN de l’appât tandis que le second segment provient du partenaire associé.

Les segments sont reliés les uns aux autres par la première séquence de reconnaissance de l’enzyme de restriction. La deuxième séquence de reconnaissance enzymatique apparaîtra à la fin de la séquence partenaire associée. Le fragment cloné de Able M1 contient de l’ADN de la région d’ABLE un située sur le chromosome neuf Q 32.4, et le partenaire associé est situé sur le chromosome trois P trois, qui a été identifié comme proc deux.

De même, le partenaire associé à M two a été localisé sur le chromosome cinq Q 21.1, tandis que le clone M three a été identifié comme une association intrachromosomique près du locus ABLE one, contrairement aux tests à trois C. La méthodologie décrite dans cette vidéo sélectionnera les interactions à longue portée les plus courantes. Cependant, en augmentant le nombre de cycles de PCR R, il est possible d’identifier d’autres associations moins fréquentes en utilisant la région d’empreinte et de contrôle ou ICR au locus IGF deux H 19 comme ADN appât dans les cellules de fibroblastes de souris, différents programmes de cyclage ont été appliqués dans les premier et deuxième tours de PCR dans le test A CT.

Le test A CT peut également être utilisé pour identifier les différences dans l’architecture nucléaire et les interactions à longue portée entre les cellules normales et les cellules cancéreuses. Le tissu normal du côlon et le tissu cancéreux du côlon ont été homogénéisés et le test A CT a été effectué conformément aux procédures décrites dans le présent document. La structure de l’ADN de la région ICR au locus H 19 de l’IGF deux et au dpn du gène dpn du gène IGF deux.

Deux sites pour le test A CT sont marqués ; les amorces utilisées dans le second tour PCR sont étiquetées par des flèches et des numéros de couleurs différentes. Le motif en gel du test A CT représente les résultats de la PCR à l’aide de l’amorce 29 61 avec l’une ou l’autre des paires d’amorces 41, 61, 41 63, 51 45 et 51 51. Les bandes uniques qui n’apparaissent que dans le tissu normal du côlon sont marquées par des flèches jaunes, et les bandes qui ne sont apparues que dans le tissu du cancer du côlon sont étiquetées par des flèches rouges après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du marché pour explorer l’architecture nucléaire et la régulation des gènes de manière tridimensionnelle.