Name: Démonstration des utilisations du spectromètre force gravitationnelle roman de sétirer et de mesurer les protéines fibreuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Découvrez le fonctionnement du spectromètre force gravitationnelle pour l'analyse de molécules uniques en biophysique. Cette méthode permet de mesurer les forces moléculaires avec précision et offre des perspectives importantes pour les avancées en neurosciences.

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Ce matériau est basé sur des travaux appuyés par la Fondation nationale des sciences par la concession numéro 0842736.

Introduction à la nouvelle configuration GFS La SFP est constitué de plusieurs éléments essentiels: un microscope à lumière régulière, une monture équatoriale, une caméra et un ordinateur [Figure 1]. Les scellés de flux des cellules de chambre qui détient l'échantillon est également indispensable en fonction de la conception des SFP. Le microscope optique est monté sur la monture équatoriale de sorte que le champ peut être tourné dans différentes orientations dans l'espace. Cette capacité permet au vecteur statique de la gravité pour être exploitées de telle sorte que les échantillons peuvent être dynamiquement orienté par rapport au vecteur ainsi la force de gravité peut conférer des charges vigueur piconewton-gamme pour les échantillons. La caméra remplace la lentille oculaire du microscope optique afin qu'il puisse enregistrer des changements dans l'orientation de l'échantillon. Ces données brutes sont numérisées et manipulée par l'ordinateur pour interpréter les données en vigueur réelle et les mesures de distance. Les scellés de débit chambre est conçue pour permettre à tous les degrés de liberté dans l'espace sans perte d'échantillon. Dans la chambre se trouve la molécule de l'échantillon, qui est attaché près d'une extrémité à une "ancré" perle qui est collé à la surface de la chambre. Le terminus opposé est attaché à un "mobile" perle qui est libre de la surface de la chambre. C'est ce mobile perle, libre dans le tampon d'analyse qui peuvent être appliquées par la force gravitationnelle en sondant la molécule attachés à des charges de faible force [Figure 2]. L'échantillon ressemble simplement à une paire de microsphères sous le microscope, mais il ne prend une certaine expérience de discerner le bien utilisable paires couplées par leur attachement à une molécule à partir de couples où les deux perles sont assis sur la surface de l'écoulement de chambre. Une modification du système est l'ajout d'une plate-forme flottante qui détient le GFS et est suspendu par des ressorts. Dans cette configuration, une fois l'échantillon a été tourné dans une position où la force gravitationnelle peut agir sur l'échantillon, la plate-forme et toutes ses composantes peuvent être déposés contre la constante du ressort. Près de la chute libre, la force agissant sur le talon mobile est proche de zéro et à l'extension maximale des ressorts, la force gravitationnelle est multiplié par autant que deux fois. De cette façon, un gradué de force / distance de la réponse peuvent être représentées graphiquement afin de mesurer le comportement d'une molécule unique à des charges différentes vigueur. 1. Préparation de microsphères <ol><li> Immergez environ 10 mg de billes de verre ou de silice dans 0,04% de 3-aminopropyltriéthoxysilane (coupé avec de l'acétone) pour deux minutes. </li><li> Rincer avec deux changements d'eau bidistillée et centrifuger pour sédimenter à 2000 xg pendant 5 minutes. Rejeter le surnageant. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon de couplage (0,01 M pyridine coupé avec de l'eau doublement distillée et ajuster le pH à 6,0), et agiter ce mélange vigoureusement. Centrifuger comme décrit ci-dessus. Répétez cette étape trois fois. </li><li> Pour le gâteau humide de perles, ajouter 2 mL de la solution glutaraldéhyde à 5% (coupé glutaraldéhyde avec le tampon de couplage). Agiter vigoureusement. </li><li> Sous une hotte, tourner talon mélange / glutaraldéhyde pendant 3 heures à température ambiante. </li><li> Centrifuger comme ci-dessus et aspirer le surnageant. </li><li> Laver les billes dans 5 ml de tampon de couplage, en les secouant vigoureusement et centrifuger et aspirer le surnageant. Répétez ceci trois fois. </li><li> Ajoutez environ 15 pi de l'anticorps désiré à des billes et agiter vigoureusement. Les perles devrait être tourné pendant 16-24 heures. </li><li> Sous le capot, ajoutez 5 ml de solution 1 M trempe glycine (glycine coupé à l'eau distillée double et ajuster le pH à 7,0). Agiter vigoureusement le mélange et faire tourner pendant 30 minutes. </li><li> Centrifugeuse et aspirer le surnageant. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon de lavage (0,01 M Tris, pH 7,0; azide de sodium 0,1%, 0,1% de BSA; 0,15 M de NaCl et 0,001 M EDTA). Agiter vigoureusement ce, centrifugeuse et aspirer le surnageant. Répétez cette étape trois fois supplémentaires. </li><li> Changer de tampon à faible teneur en sel du tampon (0,1 M de KCl, 0,02 M d'imidazole; MgCl2 5 mM, ajuster le pH à 7,0). Répétez trois fois. </li></ol> 2. Pièce jointe échantillon à des microsphères <ol><li> Prenez une petite quantité de billes préparées (environ 2 pi de chaque gâteau de perles cependant, si il ya un grand écart de diamètre entre les lots, il est avantageux d'utiliser un ratio autour de 08:01 du grand pour de petites perles) et les ajouter à un microtube avec le tampon de dosage. Réduire la concentration de votre protéine d'environ 5 uM, en utilisant le tampon de dosage. Préparer au moins un volume total de 400 ul, y compris le tampon, les protéines et les perles. </li><li> Tournez ce mélange à environ 1 RPM pour 3 heures (si la protéine est trop agitée, elle sera totale et deviennent inutiles). </li></ol> 3. Préparation Chambre Glissez <ol><li> Manteau une lame de microscope d'épaisseur avec de la nitrocellulose 0,01% (dans l'acétate d'amyle). Laissez cette diapositive à sec pendant environ 10 minutes. </li><li> Avec un coupe-verre tranchant, couper couvercle coulissant de manière à faire une chambre. Cela nécessite quatre bandes de verre. </li><li> Utilisez le faitORY bord du verre et râteau c'est à travers un frottis de graisse à vide des deux côtés de la bordure. </li><li> Bandes de graisse presse enduit sur nitrocellulose séchée couvertes glisser pour créer une boîte sur la surface de la lame. </li><li> Pipeter environ 2 ul de mélange billes / protéine en tapant sur pipetteur surface du verre intérieur de la boîte. </li><li> Ajouter environ 20 à 400 ul de tampon faible teneur en sel selon la taille de la chambre est. </li><li> Appuyez sur une lamelle sur le dessus de la boîte qui est déjà enduite de graisse à vide pour terminer la chambre étanche et tamponné. </li><li> Laissez glisser assis sur un plateau de sorte que le perles ont largement le temps de s'ancrer à la nitrocellulose. </li></ol> 4. GFS Acquisition de données <ol><li> Glisser sur le mont GFS étape </li><li> Surveiller ce que l'appareil d'enregistrement et de GFS est légitime de rechercher des "paires perles», dans lequel la microsphère petite est fixé près de l'équateur de la microsphère grande. </li><li> Quand une paire est trouvée potentiels perles, passer par la profondeur de champ afin de déterminer si les "mobiles" perle ne se repose pas sur la surface de la lame. </li><li> Une fois une paire appropriée est identifiée, noter l'angle mobiles perle est loin de d max (d max = la distance maximale entre les centroïdes des microsphères couplées). Déplacer le champ en position d'acquérir la vidéo. </li><li> L'angle de déplacement de la SFP devraient être suffisants pour enregistrer d min, d max, min et D qui pourrait appeler des 25-90 degrés en fonction de la longueur de la molécule. </li><li> RECORD que la paire se déplace de d min à d max et revenir à d min. </li><li> C'est une bonne idée aussi de tourner un film sur le fond de sorte qu'il peut être soustraite tard pour analyse. </li><li> Si vous effectuez une baisse GFS, déplacez le champ Retour à d max et d'enregistrer la baisse à au moins 60 images par seconde. La partie critique est la première oscillation, mais un temps record à long peut aussi être utilisé pour l'étude dynamique. </li></ol> 5. GFS Data Analysis <ol><li> Transformez la vidéo brutes en numérique "seuillée" l'image et exécuter des macros dans ImageJ pour déterminer la position centroïde de chaque bille dans chaque image de la vidéo. C'est aussi pour la vidéo-déposer. </li><li> Dump de l'X, Y et données de la zone d'ImageJ dans Excel et tracer les points. </li><li> Si une paire correcte perle a été acquis par la vidéo, une bosse visible dans le graphique est révélatrice des perles étant au plus proche de leur (d min) et à l'apex de la courbe est la position de d max. </li><li> Grâce à ces données, le rayon de chaque bille doit être déterminée précisément dans ImageJ et toutes ces informations sont mises dans l'équation imbriquées: d = [(g sin α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0.5 g = [D + R 2 min b 2 - (R a + r b) 2] = 0,5 R β sin b C = D max - R a - g (D = distance entre centroïdes, g = force de gravité; α = l'angle en degrés parallèles à l'objectif; r b = rayon de la téléphonie mobile bourrelet; r = rayon de une ancré bourrelet; β = angle de l'attachement hors de l'axe de l'équateur de l'ancrage de perles. </li><li> En utilisant le rayon équipé du mobile bourrelet qui donne aussi son volume, et étant donné la densité de la bille, la force de la perle mobiles confère à la molécule peut être calculé de piconewtons après la flottabilité du solvant est soustraite. Cette méthode mesure la force sur la molécule attaché dans piconewtons et calcule la longueur molécule absolue entre les pièces jointes d'anticorps en nanomètres. F = V (db) a (F = force, V = volume, d = densité de la microsphère de verre, une accélération = due à la pesanteur, b = la densité de l'eau déplacée). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Si la préparation des billes est fait correctement, il y aura moins d'agrégation perles bien qu'il y ait peut-être encore une motte occasionnels perle. Lorsqu'on regarde à travers le champ, il devrait y avoir une répartition raisonnable de perles si jumelé ou non dans la chambre. Il est important de minimiser les vibrations, autant que possible, pour cela soit une table de l'air, aux chocs spéciale absorbant les pieds d'un trépied qui détient une monture EQ, ou sur le système qui utilise des ressorts peuvent être utilisés pour l'isolation des vibrations. Une autre astuce utile sur la chambre de circulation étanche est de la laisser reposer pendant environ cinq minutes sur une table de niveau après qu'elle a été entièrement construite. Cela permet à toutes les billes seules grandes flotter à travers le tampon et le repos dans la couche de nitrocellulose. Si la lame ont été montées à la place directement à la fin, l'enquêteur serait continuellement avoir à traiter avec des perles littéralement voler à travers le champ de vision, et si cela se produit lors de l'acquisition vidéo, il peut corrompre èmeexpérimentation électronique. Si cela est fait correctement, le vol est considérablement minimisé perles et des résultats vidéo plus propre. Quand une paire potentiels perle est identifié par l'opérateur GFS, il est utile de le mettre dans une rotation préliminaire pour surveiller le comportement de la paire. Rarement, la grosse perle n'est pas solidement fixée à la diapositive. Si cela arrive, il est inutile dans l'utilisation de la paire, car il est essentiel que le plus grand ancré séjour perles dans une position fixe pendant toute la durée de l'acquisition. Si le couple est stable et ne présente pas «ancré rouleau perles», puis il est adapté à l'expérimentation. Une parcelle de distances de séparation billes par rapport au changement de l'angle par rapport à la gravité peut être utilisé pour évaluer les données acquises. Un résultat bon représentant montrerait guère de séparation sur un plateau et que le cordon de mobiles se libère de la perle ancré raison de l'influence de la gravité, le graphique montrera plus de séparation. Cela continue jusqu'à un pic de Nice est atteint ce qui est appelé d max et la courbe commence à la baisse à nouveau retourner à la base d min [Figure 1]. Dans des conditions idéales, cette signature est symétrique. Un résultat non représentatif serait afficher un graphique avec des motifs incohérents ne montrant aucun distinctes d min-max d-d pattern min, ou elle montrerait les séparations qui sont des ordres de grandeur trop élevé pour une seule molécule indiquant peut-être il y avait un morceau de poussière entre les perles, ou peut-être que le talon du mobile a été tout simplement pas attachés du tout. Le processus de trouver la paire, c'est le tir, c'est le traitement, et il analyse les lacunes a cesser de nombreux cas où incorrecte paires perles sont abattues sur. Donc, si vous arrivez à la fin du processus dans son ensemble et vous avez une longueur molécule qui est conforme aux résultats précédents, on peut être très confiants que la paire originale perle est représentatif et peut être inclus dans les résultats. Dans un bon jour, environ la moitié de la prise de perles paires peuvent être prises par le biais de devenir un point légitimes des données. Par exemple, la longueur de la bobine enroulée de la myosine entre les MF20 MF30 et les anticorps, est connue basée sur les données EM et de l'AFM, les données à l'approche de 100 nm 2,7,8,9. Si le résultat est plusieurs fois cette longueur, l'échantillon a agrégées. Les résultats présentés ici sont tirées des expériences standard de rotation GFS et démontrer une distance de 96 nm ± 5 nm, [Figure 2], qui accepte en étroite collaboration avec les mesures de la MF30 (qui se lie à l'extrémité N-terminale de la myosine sous-fragment-2) et MF20 (qui se lie dans le meromyosin lumière) la distance de séparation d'anticorps sur la myosine déduite des valeurs littérature [Figure 3]. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Configuration de GFS. De grandes parties de GFS sont étiquetés. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Schéma de principe GFS. Le côté gauche montre centroïde de la téléphonie mobile perle à une distance minimale de centroïde de billes ancrées. Comme GFS est tournée, mobiles perles aligne avec le vecteur de gravité qui est aussi parallèle à l'axe de la molécule attachés. Dans cette position, la distance entre les centroïdes des perles mobiles et ancrés est à son maximum. En haut à droite montre une tranche représentative d'un film de GFS. En bas à droite est une image de la rotation GFS subir. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 résultat représentatif montrant min D sur la gauche du graphique;. D max à une séparation relative de 17,78 microns et un retour à la vitamine D dans la ligne de base d'environ 17,75 microns de séparation relative entre les billes. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Résultat représentatif de l'expérience de rotation GFS montrant la distance entre MF20 MF30 et anticorps en moyenne 96 nm. Cela représente la durée approximative de S2. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Myosine II dimère utilisé pour afficher les pièces jointes possibles pour une utilisation avec le GFS, y compris d'anticorps et / ou les pièces jointes d'actine. Différentes possibilités de fixation permet de différentes stratégies de GFS pour mesurer les différentes régions, ou pour demander force perpendiculaire ou parallèle à la tige de domaine du dimère de myosine.

<ol><li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li>
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</ol>

Lors de la conversion d&#39;un film à une représentation numérique seuillée, il est crucial pour l&#39;image seuillée pour maintenir la même région, dans chaque image de la vidéo. Parce que les perles dans une paire de billes se déplacent indépendamment les uns des autres, toute dérive dans les zones seuillée peuvent aussi causer les distances relatives entre les centroïdes des perles à la dérive et d&#39;introduire des erreurs significatives. Contrôle de la zone seuil réduit l&#39;erreur de cinq fois dans les mesures d...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropyltriéthoxysilane</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7776</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Research Organics</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9682T</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Amresco</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMR-0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MSI</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60443</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diméthylformamide</td><td>Extrait de grande nouvelle</td><td>D4254</td><td></td></tr><tr><td>Myosine II squelettique de lapin</td><td>Lapins blancs de Nouvelle-Zélande (7-8)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>anticorps MF30 (9-10)</td><td>Banque d'hybridomes pour l'étude du développement</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>anticorps MF20 (6)</td><td>Banque d'hybridomes</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de laboratoire</td><td>boréal</td><td>WW57905M00</td><td></td></tr><tr><td>Monture équatoriale</td><td>Celestron</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Caméra vidéo numérique</td><td>Sony Corporation</td><td>XCDV60</td><td></td></tr><tr><td>Libération de Caliper</td><td>Cabelas</td><td>IA-415482</td><td></td></tr><tr><td>Ressort de compression</td><td>Jones Spring Co.</td><td>723</td><td></td></tr><tr><td>Ressort de traction</td><td>Jones Spring Co.</td><td>770</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Instituts nationaux de la santé</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pilotes Fire-i &amp;et application </td><td>Unibrain</td><td>3.80</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

démonstration des utilisations du spectromètre force gravitationnelle roman de s&#39;étirer et de mesurer les protéines fibreuses

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

L&#39;étude de la structure macromoléculaire est devenue critique à l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires et de la fonction. Il ya plusieurs BioInstruments limité, mais important, capable de tester la dépendance vigueur de caractéristiques structurelles de protéines. Échelle a été un paramètre limitant de la précision avec les chercheurs peuvent les pairs dans le monde nanomécaniques de molécules, comme les acides nucléiques, enzymes et protéines motrices qui assurent maintien de la vie de travail. La microscopie à force atomique (AFM) est bien réglé pour déterminer les structures des protéines fibreuses natif avec une résolution de distance à égalité avec la microscopie électronique. Toutefois, dans les études de la force AFM, les forces sont généralement beaucoup plus élevé que une seule molécule pourrait l&#39;expérience 1, 2. Pièges optiques (OT) sont très bons à la détermination de la distance relative entre les billes piégées et qu&#39;elles peuvent transmettre des forces très petit 3. Cependant, ils ne donnent pas de précision longueurs absolues des molécules à l&#39;étude. Simulations moléculaires fournissent des informations favorables à de telles expériences, mais ils sont limités dans la capacité à gérer les mêmes grandes tailles moléculaires, de longues périodes, et convaincre certains chercheurs en l&#39;absence de preuves à l&#39;appui d&#39;autres 2, 4. La force gravitationnelle spectromètre (SFG) remplit un créneau essentiel dans l&#39;arsenal d&#39;un enquêteur en offrant une combinaison unique de capacités. Cet instrument est capable de générer des forces en général, avec 98% ou plus de précision de la gamme à la gamme femtonewton nanonewton. Les mesures de distance sont actuellement capables de résoudre la longueur moléculaire absolue à cinq nanomètres, et relative perles distances de séparation paire avec une précision semblable à un piège optique. En outre, le SFP peut déterminer étirement ou dévidage où la force est à proximité de l&#39;équilibre, ou de fournir une force graduée de juxtaposer contre toute modification structurelle mesurée. Il est même possible de déterminer combien de résidus d&#39;acides aminés sont impliqués dans des événements dérouler sous une force physiologique 2. Contrairement à d&#39;autres méthodes où il ya l&#39;étalonnage vigueur vaste qui doit précéder toute épreuve, le SFP nécessite pas de calibration telle force 5. En complétant les forces d&#39;autres méthodes, le GFS combler les lacunes dans la compréhension de la nanomécanique de protéines essentielles et d&#39;autres macromolécules.

Ceci est une étape-par étape indiquant l&#39;objet, l&#39;exploitation et des résultats représentatifs du spectromètre force gravitationnelle roman.

Démonstration des utilisations du spectromètre force gravitationnelle roman de s&#39;étirer et de mesurer les protéines fibreuses

L'étude de la structure macromoléculaire est devenue essentielle pour l'élucidation des mécanismes et des fonctions moléculaires. Il existe plusieurs méthodes limitées, mais...

Le dispositif de force gravitationnelle comprend un objectif épi, un microscope optique classique, une caméra numérique et un ordinateur. Nous l'utilisons pour réaliser de l'acide à une seule molécule. Nous pouvons enregistrer l'équilibre des forces ou appliquer une force progressive par goutte.Pour commencer, nous devons préparer une microplaque en verre afin qu’ils puissent être réalisés par ce type de procédé. Pour mesurer environ 10 milligrammes des grains que vous allez utiliser, je prépare habituellement 2K. Ici, nous avons cinq millilitres de ce que nous allons appeler trois triologie.C'est là que nous obtiendrons notre tube Put One. Mélangez soigneusement à l'aide d'une pipette de transfert, puis transférez deux millilitres du mélange sur votre gâteau de beurre. Laissez reposer les gâteaux de beurre pendant deux minutes, puis vortexez soigneusement pendant deux minutes.Le bas a mangé les deux mouillés. Vous voulez oh une purine dans de l'eau doublement distillée. Couplage à pH six.Vous ajoutez donc simplement cinq millilitres du tampon de couplage à chaque morceau de viande, et ce couplage fait adhérer la bille au ling. Ensuite, les anticorps en suspension se lient de nouveau au ling ; vortexez pendant une minute. Faites précipiter les échantillons pendant cinq minutes, puis, pour obtenir votre solution, vous allez la diluer à partir de n'importe quelle concentration initiale jusqu'à 5 % à l'aide du tampon de couplage.Ensuite, vous prenez deux millilitres de cette solution et vous ajoutez cela permettra au couple TER de s'associer avec le terminal déjà présent sur notre vortex. Ceci pendant deux, tournez pendant trois. Procédure de tampon d'hybridation.À nouveau, ajoutez cinq millilitres d’un tampon de couplage dans votre gâteau de filtration. Mélangez à nouveau, centrifugez et aspirez. Laissez saturer. Lors de la quatrième addition, laissez un peu de solution saturée en surface du gâteau, afin que l’anticorps puisse circuler librement.Voici notre anticorps ici. Micro-quantifiez ce volume. Les anticorps humides sont rotés ; vous ajouterez sept volumes d'eau doublement distillée à un volume d'anticorps, et le mélange est agité par rotation pendant 30 minutes, ou pendant la durée appropriée.Pour éteindre toute la colle sous-activée, œil pour œil. Faites-le centrifuger afin d'éliminer le S. Ensuite, vous voudrez préparer un mélange dont le contenu correspond au protocole. Prenez cinq millilitres du prélèvement, prenez les billes, voici les billes, insérez-les jusqu'à la dent.Répétez l'étape trois fois, puis procédez de la même manière pour tout essai que vous effectuez. Pour commencer notre préparation, nous devons d'abord obtenir notre protéine. Dans ce cas, rendez-vous au congélateur à –70 °C pour récupérer la protéine stockée ; il est important de prendre cette protéine et de la réchauffer.Ceci est désormais beaucoup plus concentré que ce que nous voulons utiliser dans notre test. Nous allons donc réduire à environ quinze et en prélever une partie au niveau de l'embout. Mais ensuite, cela doit être fait avec précision : après avoir réduit le volume à environ cinq microlitres, nous allons utiliser les grosses billes et prélever un volume plus important, soit 10 microlitres, à partir de cette bille exemple.Et cela va donner une bonne concentration finale ; ici, nous ajoutons environ cinquante microlitres supplémentaires de tampon de dosage dans le tube microcentrifuge. Nous allons maintenant procéder au mélange à l’aide du vortex, comme indiqué ici avec l’appareil A. Nous faisons tourner le tube pendant une minute environ et nous répétons cette étape. Il est maintenant temps de construire effectivement le flux sur lequel nos échantillons seront placés et resteront.Je place donc cette lame de microscope standard dans de l'oh 1 %, qui sera découpée avec de la colle pour permettre aux ancres de s'attacher à la surface de la lame en verre, de la couverture et des lames de microscope. J'ai déjà préparé les bords avec la colle, et j'appliquerai ce morceau de verre plus fin, une lame hyper plus épaisse. Cette chambre sera relativement petite.Voici donc un petit ici et sa position est endommagée. Un autre de ces gars tient chaque jour. L'agent me rend meilleur, manque meilleur.Ici, nous allons goûter les deux derniers vins de 25 ans, peut-être leur saveur, avant de commencer à ajouter le craquelin et le fromage. Et vous avez manqué le soleil. Seuls quelques-uns ont du goût, et seulement un peu.Et ici, si vous regardez attentivement, vous pouvez effectivement voir la bille. Concernant la pointe, ce que je fais, c’est que je commence par simplement tapoter la zone concernée, et je n’attends pas que l’ensemble de la surface de la lame ici soit recouverte, nous en mettrons environ 40 pour pouvoir orienter différemment cette lame sans craindre que les échantillons ne migrent vers le bas. Hé, vous n’avez pas besoin d’une vis de fixation pour prélever mon bouquet, un peu de mon vin, à l’arrière de la ligne, et je pourrais monter la lame et j’utilise une pince supplémentaire pour stabiliser davantage l’ensemble. Ensuite, nous pouvons mettre en place l’objectif.Il s'agit d'une télécommande que nous utilisons pour positionner ici la lame et tout est allumé, y compris la caméra. Nous pouvons commencer la surveillance pour détecter d'éventuels phénomènes en surveillant simplement l'écran vidéo. Celui de gauche possède une petite sphère, dont l'aspect ressemble à celui des autres petites sphères simplement posées à la surface du lop.Cependant, la paire de billes présente une bille qui entre en netteté lorsque la surface de la bille hors netteté du LOP indique que celle-ci se situe à un plan de focalisation différent de celui de l'autre lame contenant des paires, et également de la paire située à droite. A illustre comment les paires pourraient apparaître sur une lame. Ainsi, nous positionnons la lame que nous faisons tourner selon différents angles, ce qui nous donne différentes longueurs ; nous utilisons ensuite la rotation. Nous observons une représentation de l'aspect qu'un para alimenté pourrait avoir, obtenue à l'aide d'un ordinateur.Nous trouvons les deux. Dans ce cas, le calcul permet de supprimer la mesure fournie, ici supprimer le F et également de le supprimer. Merci d'avoir regardé.Bonne chance avec votre perturbation. Il y a un moment pour danser. D'ailleurs, ne pensez pas que quelqu'un ne remportera pas la mienne.Mes amis étaient occupés à essayer de l'obtenir. Tout cela m'a laissé à l'arrière. Où est cette fille avec qui je suis venu ?Elle part avec mon ami. Elle pense vraiment qu'elle est quelqu'un. Ne sait-elle pas ce qu'est un vrai homme ?Reprenez le cheval mécanique, redressez-vous, taureau mécanique. Laissez-vous aller. Droit, droit, droit jusqu’au Mexique.J'adore la manière dont on s'éclate ce soir. Taureau mécanique. Ne ralentis pas.Donnez-moi 5 unités pour me positionner lorsque vous aurez terminé avec ma main gauche. Juste pour utiliser ma droite. Oui, avec ma main gauche, je vais simplement utiliser la droite.

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