Imagerie C. elegans Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source

Ce protocole montre comment imager des événements dynamiques dans des embryons de CL egan précoces avec l’optique Norky DIC ou la fluorescence en utilisant des microscopes largement disponibles et des logiciels open source. Le protocole commence par la description de la façon de disséquer les embryons de CL gans et de les monter pour l’imagerie. Ensuite, la configuration correcte du DIC ou de l’optique masquée est examinée pour garantir des images optimales avec le plus grand détail.

L’étalonnage de l’épifluorescence à grand champ et de l’éclairage est également examiné pour collecter de bonnes données d’image fluorescente associées à des logiciels open source. Une bonne microscopie peut visualiser la dynamique cellulaire d’un embryon en développement. Les illustrations visuelles de cette méthode sont essentielles car il est difficile de configurer correctement D iic Optics, car la terminologie peut prêter à confusion et la technique appropriée est difficile à décrire sous forme écrite.

De plus, les chercheurs doivent veiller à minimiser l’exposition à la lumière lors de l’imagerie fluorescente. Afin de limiter la phototoxicité et le photoblanchiment Pour préparer les embryons à l’imagerie, faites d’abord deux solutions de montage. L’un est de la vaseline fondue et l’autre est de deux à 3 % aros en tampon.

Des aros plus denses peuvent être réalisés si les structures à imager sont très fragiles, en prenant soin d’éviter l’ébullition. Les deux solutions mères sont fondues au micro-ondes, puis stockées sous forme d’aliquotes de quatre à cinq millilitres. Le jour de l’imagerie, faites fondre une aliquote de solution de vaseline dans un bloc de chaleur de 65 à 70 degrés Celsius et faites fondre une aliquote de la solution levée au micro-ondes.

Encore une fois, en évitant de faire bouillir. Ensuite, pour garder ces solutions fondues, stockez-les dans un bloc chauffant. Ensuite, couvrez le haut et le bas de deux lames avec une bande de ruban adhésif de laboratoire et positionnez une lame propre entre les deux lames collées.

Maintenant, versez quelques gouttes de l’aros fondu sur la lame propre et couvrez-la d’une autre lame propre. L’Aros se propage en un mince coussinet carré avec le coussinet à vis de terre préparé. À l’aide d’une lunette de dissection et d’un pic en fil de platine, transférez deux vers adultes dans une goutte de tampon de neuf à 12 microlitres sur une lamelle de 18 x 18 millimètres.

Puis coupez. Ouvrez les vers avec une aiguille ou un scalpel pour libérer les embryons avec le côté agarro vers le bas. Placez le coussinet à vis sans fin sur la lamelle de 18 x 18 millimètres et rasoirez toute gélose en surplomb.

Enfin, pour sceller la lamelle, appliquez la solution de vaseline fondue sur son pourtour avec un pinceau ou un cure-dent. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’imagerie. Lorsque vous placez la lame sur le microscope, assurez-vous que les deux polariseurs sont alignés perpendiculairement l’un à l’autre.

Assurez-vous que les murs et les prismes sont hors du chemin de la lumière. Si le champ n’est pas sombre, tournez le polariseur sous le condenseur jusqu’à ce qu’il soit maintenant. Trouvez les embryons à l’aide de l’objectif 10 fois.

Regardez près des corps du ver pour des groupes de jeunes embryons afin d’obtenir plusieurs embryons dans le champ d’imagerie. Évitez les embryons à l’intérieur du ver pour obtenir les meilleures images. Avec les meilleurs embryons localisés, passez à un objectif de puissance plus élevé.

Passez maintenant le cube de filtre en DIC. Ensuite, insérez le prisme de Walstone de l’objectif supérieur dans le chemin de la lumière et tournez la tarte sur le condenseur pour sélectionner le prisme de Walstone inférieur qui correspond à l’objectif. Une fois les prismes en place, ajustez le curseur sous cette tourelle pour qu’il corresponde à l’ouverture numérique de l’objectif.

Pour obtenir un éclairage Kohler optimal, faites la mise au point du condenseur jusqu’à ce que le bord de la membrane du condenseur apparaisse le plus net. La plus nette est lorsque la frontière entre le noir clair est la plus nette ou la plus nette. Pour obtenir un contraste optimal, ajustez la paroi de la pomme et le prisme en tournant le bouton sur le curseur.

Aujourd’hui, le microscope est presque prêt à l’emploi. Il est temps de contrôler des paramètres d’imagerie supplémentaires sur l’ordinateur avec micromanager et un logiciel open source. Commencez par régler le gain de l’appareil photo sur zéro.

Passez ensuite à l’enregistrement des fichiers en huit bits, et non en 16 bits. Les fichiers TIFF peuvent ensuite être analysés par un logiciel open source comme Image J.Ensuite, ajustez le niveau de lumière à l’endroit où les pixels les plus brillants se trouvent juste en dessous des niveaux de saturation. Si tout a été fait correctement, l’image aura un aspect 3D avec la lumière semblant briller à un angle.

Maintenant que l’image est brillante, sélectionnez les embryons que vous souhaitez imager et dessinez une région d’intérêt. Si le microscope est équipé d’un moteur de mise au point, utilisez-le pour collecter plusieurs plans focaux à la fois. Ouvrez la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle et réglez les plans supérieur et inférieur de la pile Z en ajustant le bouton de mise au point pour trouver le premier et le dernier plan focal avec quelques granules de culasse au point.

Définissez la taille du pas. Cela permettra de définir le nombre de plans focaux collectés. Maintenant, définissez un intervalle de temps suffisamment long pour acquérir tous les plans focaux.

Les points de temps maximum peuvent être réglés très haut afin que le logiciel prenne des images jusqu’à ce qu’il soit arrêté manuellement. Configurez le logiciel pour qu’il n’affiche que la dernière image acquise afin que le processus puisse être surveillé. Donnez maintenant un nom de fichier aux images et commencez à acquérir des images.

L’analyse des images sera brièvement examinée à la fin de la section suivante. La construction d’un film GFP est un peu comme la réalisation de quatre DIC D ni Musky, mais un fichier de configuration qui inclut le contrôle logiciel de l’éclatement fluorescent est utilisé. Au lieu de cela, une fois les embryons localisés, assurez-vous que le prisme de Walstone supérieur n’est pas dans le trajet de la lumière et basculez le cube de filtre sur F-I-T-C-G-F-P.

Si ce n’est pas automatiquement réglé au démarrage à l’aide du logiciel, assurez-vous que le gain de l’appareil photo est réglé sur 255. Un fichier image est défini au format tiff 16 bits. Éteignez maintenant la source de lumière transmise et cliquez sur l’imagerie en direct.

Ajustez l’intensité de la source de lumière UV et le temps d’exposition pour obtenir un bon rapport signal/bruit pour le signal de fluorescence, cependant, maintenez l’exposition à la lumière au minimum pour préserver les cellules. Ensuite, configurez l’intervalle de temps. Le nombre de points temporels et le nombre de plans focaux procèdent maintenant à l’acquisition de l’image comme décrit précédemment.

Pour analyser les films, utilisez un logiciel open source. Image J avec le plugin micromanager installé De très gros films peuvent également être importés dans Image J à l’aide du plugin loci. Il s’agit d’un embryon de type sauvage capturé avec des optiques ni MASKY, DIC.

L’arrière est en bas à droite et l’arrière est en bas à gauche. La vidéo montre une séquence d’images à plan focal unique collectées toutes les 15 secondes. La lecture est réglée à 14 images par seconde.

Cet embryon exprime la fluorescence lors de la première division embryonnaire ici, en arrière, en haut à droite. Cette vidéo montre les changements dans un seul plan focal toutes les 10 secondes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imager des embryons vivants en utilisant à la fois l’optique DIC Naski et l’épifluorescence pour étudier les événements dynamiques.

Nous espérons que vous avez une meilleure compréhension de la façon de configurer l’optique DIC Nomar pour obtenir des images optimales et que vous réalisez que vous pouvez obtenir des données fluorescentes de haute qualité en utilisant l’éclairage par fluorescence épi, et que vous n’êtes pas toujours dépendant de microscopes plus avancés. Vous pouvez également appliquer ces techniques d’imagerie pour examiner des embryons dépourvus de fonction génique spécifique afin d’étudier plus en détail les exigences génétiques de vos événements préférés lors de la division ou du développement cellulaire.