Imagerie C. elegans Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source

Ce protocole montre comment imager des événements dynamiques au stade précoce des embryons de CL egan à l’aide d’optiques DIC Norky ou de fluorescence, en utilisant des microscopes largement disponibles et des logiciels libres. Le protocole commence par la description de la dissection des embryons de CL gans et de leur montage pour l’imagerie. Ensuite, le réglage approprié des optiques DIC à masque Norky est passé en revue afin d’obtenir des images optimales avec le plus grand détail.

L'étalonnage de la fluorescence épiscopique en champ large et de l'éclairage est également examiné afin d'acquérir de bonnes données d'images fluorescentes, en association avec un logiciel open source. Une bonne microscopie permet de visualiser la dynamique cellulaire au sein d'un embryon en développement. Des illustrations visuelles de cette méthode sont essentielles, car la configuration correcte des optiques D iic est difficile, la terminologie pouvant prêter à confusion et la technique appropriée étant complexe à décrire par écrit.

En outre, les chercheurs doivent faire attention à minimiser l'exposition à la lumière lors de l'acquisition d'images fluorescentes. Afin de limiter la phototoxicité et le photoblanchiment, préparez d'abord deux solutions de montage : l'une composée de vaseline fondue, l'autre de deux à 3 % d'aros dans un tampon.

Des aros plus denses peuvent être préparés si les structures à imager sont très fragiles, en prenant soin d'éviter toute ébullition. Les deux solutions mères sont fondues au micro-ondes, puis conservées en aliquotes de quatre à cinq millilitres. Le jour de l'observation, faire fondre une aliquote de solution de vaseline dans un bloc chauffant à 65 à 70 degrés Celsius et faire fondre une aliquote de solution d'arose au micro-ondes.

À nouveau, éviter l'ébullition. Ensuite, pour maintenir ces solutions à l'état liquide, les conserver dans un bloc chauffant. Puis, recouvrir le haut et le bas de deux lames par une bande de ruban adhésif de laboratoire et placer une lame propre entre les deux lames recouvertes de ruban.

Ajoutez maintenant quelques gouttes de l'aros fondu sur une lame propre et recouvrez-la avec une autre lame propre. L'aros s'étend en une pastille carrée fine, prête avec la pastille de vers. Utilisez un microscope stéréoscopique et une aiguille en platine pour transférer deux vers adultes dans une goutte de tampon de neuf à douze microlitres sur une lamelle de 18 sur 18 millimètres.

Ensuite, coupez. Ouvrez les vers avec une aiguille ou un scalpel pour libérer les embryons, en gardant le côté en agar vers le bas. Placez le tampon à vers sur la lamelle de 18 sur 18 millimètres et rasez tout excès d'agar.

Enfin, pour sceller la lamelle, appliquez la solution de vaseline fondue le long de son périmètre à l’aide d’un pinceau ou d’un cure-dent. Les cellules sont désormais prêtes à être observées. Lorsque vous placez la lame sur le microscope, assurez-vous que les deux polariseurs sont alignés perpendiculairement l’un par rapport à l’autre.

Veillez à ce que les filtres et les prismes soient hors du trajet de la lumière. Si le champ n’est pas sombre, faites tourner le polariseur situé sous le condenseur jusqu’à ce qu’il le devienne. Localisez les embryons à l’aide de l’objectif 10 fois.

Recherchez près des corps des vers des groupes d'embryons jeunes afin d'obtenir plusieurs embryons dans le champ d'imagerie. Évitez les embryons situés à l'intérieur du ver pour obtenir les meilleures images. Une fois les meilleurs embryons localisés, passez à un objectif de puissance plus élevée.

Remplacez maintenant le cube de filtre par celui de contraste de phase DIC. Ensuite, insérez le prisme walstone supérieur de l'objectif dans le trajet de lumière et faites tourner la tourelle du condenseur pour sélectionner le prisme walstone inférieur correspondant à l'objectif. Une fois les prismes en place, réglez le curseur situé sous cette tourelle afin qu'il corresponde à l'ouverture numérique de l'objectif.

Pour obtenir une illumination de Köhler optimale, mettez au point le condenseur jusqu'à ce que le bord du diaphragme du condenseur apparaisse le plus net possible. Le point de netteté maximale correspond à un contour bien défini entre la lumière et le noir. Pour obtenir un contraste optimal, ajustez l'anneau d'ouverture et le prisme en tournant le bouton du curseur.

Le microscope est maintenant presque prêt à être utilisé. Il est temps de régler les paramètres d'imagerie supplémentaires sur l'ordinateur à l'aide de Micro-Manager et d'un logiciel libre. Commencez par régler le gain de la caméra à zéro.

Ensuite, passez à l'enregistrement des fichiers en tant que TIFF 8 bits, et non en 16 bits. Les fichiers TIFF peuvent ensuite être analysés à l'aide de logiciels libres tels qu'ImageJ. Ajustez ensuite le niveau de lumière de manière à ce que les pixels les plus brillants soient juste en dessous du seuil de saturation. Si toutes les étapes ont été correctement effectuées, l'image aura un aspect tridimensionnel, comme si la lumière provenait d'un angle oblique.

Maintenant que l'image est excellente, sélectionnez les embryons que vous souhaitez imager et dessinez une région d'intérêt. Si le microscope est équipé d'un moteur de focalisation, utilisez-le pour acquérir plusieurs plans focaux à chaque instant. Ouvrez la fenêtre d'acquisition multidimensionnelle et définissez les plans supérieur et inférieur de la pile en Z en ajustant le bouton de mise au point afin de déterminer le premier et le dernier plan focal où apparaissent des granules de vitellus nets.

Définissez l'incrément. Cela déterminera le nombre de plans focaux collectés. Réglez ensuite un intervalle de temps suffisamment long pour acquérir l'ensemble des plans focaux.

Les points temporels maximum peuvent être fixés très haut afin que le logiciel prenne des images jusqu'à ce qu'il soit arrêté manuellement. Configurez le logiciel pour qu'il affiche uniquement la dernière image acquise, afin de pouvoir surveiller le processus. Donnez maintenant un nom de fichier aux images et commencez l'acquisition des images.

L'analyse d'image sera brièvement revue à la fin de la prochaine section. La réalisation d'un film GFP ressemble beaucoup à la prise de quatre D ni Musky DIC, mais un fichier de configuration incluant la commande logicielle du trouble fluorescent est utilisé. Une fois les embryons localisés, assurez-vous que le prisme walstone supérieur n'est pas sur le trajet de la lumière et basculez le cube de filtres vers F-I-T-C-G-F-P.

Si ce paramètre n'a pas été automatiquement activé au démarrage à l'aide du logiciel, assurez-vous que le gain de la caméra est réglé sur 255. Un fichier image est défini au format tiff 16 bits. Éteignez maintenant la source de lumière transmise et cliquez sur l'acquisition d'image en direct.

Ajustez l'intensité de la source de lumière UV et la durée d'exposition pour obtenir un bon rapport signal sur bruit pour le signal de fluorescence ; toutefois, maintenez l'exposition à la lumière au minimum afin de préserver les cellules. Ensuite, définissez l'intervalle de temps. Le nombre de points temporels et le nombre de plans focaux étant fixés, procédez à l'acquisition d'images comme décrit précédemment.

Pour analyser les films, utilisez un logiciel open source. ImageJ avec le plugin micromanager installé permet également d'importer des fichiers vidéo très volumineux dans ImageJ à l'aide du plugin loci. Cet embryon de type sauvage a été capturé en optique DIC sans masque.

Le postérieur se trouve en bas à droite et le ventral en bas à gauche. La vidéo montre une séquence d'images prises sur un plan focal unique, acquises toutes les 15 secondes. La lecture est réglée à 14 images par seconde.

Cet embryon exprime une fluorescence durant la première division embryonnaire, le pôle postérieur se trouvant en haut à droite. Ce film montre les changements dans un plan focal unique toutes les 10 secondes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'imaginer des embryons vivants en utilisant à la fois l'optique DIC Naski et la fluorescence en épi-illumination pour étudier des événements dynamiques.

Nous espérons que vous avez maintenant une meilleure compréhension de la mise en place de l'optique DIC Nomarski afin d'obtenir des images optimales, et que vous réalisez qu'il est possible d'acquérir des données fluorescentes de haute qualité à l'aide d'une illumination en fluorescence épi, sans dépendre systématiquement de microscopes plus sophistiqués. Vous pouvez également appliquer ces techniques d'imagerie à l'examen d'embryons dépourvus de la fonction d'un gène spécifique, afin d'approfondir l'analyse des exigences génétiques liées aux phénomènes qui vous intéressent durant la division cellulaire ou le développement.